Exemples de réalisations

Manipulation de gouttes

Nous avons tout d'abord démontré la formation de gouttes d'eau à par-tir d'un réservoir et leur déplacement à travers un canal de 5 cm de long (-gure 4.2A). Comme le montre la (-gure 4.2B, une goutte est formée en remplis-sant un volume délimité par trois vannes et couvert par des canaux d'aspiration. La vanne 1 sépare la goutte du réservoir, la vanne 2 sépare la goutte du canal de 5 cm de long et la vanne 3 permet d'ouvrir un évent pour libérer la goutte et autoriser son déplacement. Finalement, un second réseau d'aspiration est placé

42 Chapitre 4. motifs d'autres types de matière à l'extrémité opposée du long canal pour contrôler le déplacement de la goutte libérée.

La séquence suivante est utilisée pour fabriquer une goutte : Tout d'abord, les vannes 2 et 3 (gure 4.2B) sont fermées pour former une cavité étanche avec le réservoir où le vide est créé en utilisant les canaux d'aspiration. A ce stade, le liquide provenant du réservoir emplit la cavité en environ 5 s. Ensuite, la vanne 1 est fermée pour séparer la goutte du réservoir et les vannes 2 et 3 sont ouvertes pour libérer la goutte qui peut ainsi se mouvoir et être déplacée jusqu'à une cavité placée à l'autre extrémité du canal en utilisant des canaux d'aspiration.

Plusieurs gouttes successives peuvent être formées de cette manière jusqu'à ce que la cavité, où la micro-aspiration est appliquée, soit totalement remplie. Dans notre cas, la goutte mettait environ 50 s pour parcourir la longueur totale du canal. La goutte commençait sa progression à une vitesse de 1,6 mm/s au début du canal, pour nir à une vitesse de 5,6 mm/s à son extrémité. Cette augmentation de vitesse sera expliquée par la suite.

Remplissage de cavités

La technique présentée ici est particulièrement adaptée à la manipulation de petites quantités de liquide tout en ayant un contrôle précis sur leur volume. Cette particularité la rend pertinente pour la manipulation d'échantillons chers comme c'est le cas dans la recherche de conditions de cristallisation de protéines. Dans cette seconde expérience, nous avons appliqué cette méthode à la cristal-lisation de protéines sur puce. En eet, l'uticristal-lisation d'une méthode exible de distribution des liquides et la réduction des volumes morts sont des points es-sentiels à l'ecacité de tels systèmes [54]. Notre technique de manipulation de liquides permet de répondre à ces attentes. Comme le montre la gure 4.3A, le dispositif simule deux types de méthode de cristallisation de protéines simulta-nément : la méthode par diusion et la méthode par échange en phase vapeur [50]. Chaque cellule est composée de deux chambres isolées par au moins une vanne de séparation. Une chambre contient la solution de protéine et l'autre chambre contient un agent précipitant. Une fois les chambres remplies de réac-tifs en utilisant la micro-aspiration, elles sont séparées des réservoirs d'origine par des vannes intégrées.

L'étape suivante consiste à autoriser les échanges entre les deux réservoirs. Pour la cellule de diusion, l'ouverture de la vanne de séparation permet la diusion des protéines dans l'agent précipitant (Figure 4.3B). Pour la cellule d'échange en phase vapeur, l'ouverture de deux vannes permet aux liquides contenus dans les chambres d'échanger de l'eau par évaporation à travers la même cavité d'air. (Figure 4.3C à droite). Dans ces expériences, les réactifs ont été introduits dans le système en utilisant une simple pipette et automati-quement délivrés par aspiration. Le volume mort était inférieur à 10% avec un volume réactif distribué bien contrôlé.

La séquence suivante a été utilisée pour remplir les cavités. Tout d'abord, les vannes de séparation sont fermées et le vide est créé dans les canaux d'aspiration. Après un remplissage complet des cavités, le vide est relaxé pour éviter les déformations mécaniques du dispositif dues à la diérence de pression et ainsi garder un bon contrôle sur le volume. Ceci est possible car le PDMS environnant la chambre est appauvri en gaz et les bulles ne réapparaissent pas, contrairement aux chambres closes emplies par injection où la pression doit être maintenue pour éviter la réapparition de bulles. Finalement, les entrées des chambres sont

4.1. Contrôle indirect des liquides 43 t=0 s t=1,4 s t=5,5 s t=17,5 s t=41 s t=54 s t=40,8 s t=41,2 s Reservoir Aspiration channels Aspiration channels valve control Air vent droplet formation cavity 1 1 2 3 valve control 2+3

A

B

Figure 4.2  Fabrication et déplacement de la goutte : A) Schéma du système : le rouge indique la couche contenant les canaux de contrôle (couche inférieure) et le vert représente la couche contenant les canaux de contrôle (couche supérieure). B) Séquence d'images de microscopie en transmission illustrant la fabrication d'une goutte. Sur la gauche : Fabrication de la goutte. Sur la droite, déplacement de la goutte le long du canal. La numérotation de 1 à 3 donne le numéro des vannes comme utilisé dans le texte et les èches rouges indiquent le front de la goutte. La barre d'échelle représente 500 µm.

44 Chapitre 4. motifs d'autres types de matière t=2.55s t=0s t=12.1s t=120s t=2.4s t=0s t=15.9s t=20s Réservoir d'agent précpitant Réservoir de solution de protéine Cellle d'échange par diffusion Cellule d'échange en phase vapeur

B C

A

Figure 4.3  Système de cristallisation de protéines. A) Schéma du système : le rouge indique la couche contenant les canaux de contrôle (couche inférieure) et le vert représente la couche contenant les canaux de contrôle (couche supérieure). B-C) Séquence d'images en transmission de la cellule de diusion (B) et de phase vapeur (C) La protéine est remplacée par un colorant pour l'illustration. Dans les images du bas, on peut remarquer la diusion du colorant dans la cellule de diusion et l'interface liquide/air bien contrôlé dans la cellule de phase vapeur. La barre d'échelle représente 500 µm.

4.1. Contrôle indirect des liquides 45 fermées et les vannes de séparation ouvertes pour laisser agir la diusion des espèces.

Lors de l'étape de remplissage, la vitesse de remplissage diminue progressi-vement : 90% du volume de la chambre était empli dans les 4 s. alors que les 10 derniers % ont pris 6,2 s à se remplir, donnant un débit moyen de 9 nL/s. La vitesse de remplissage est plus rapide en moyenne pour les cavités plus grandes mais un temps minimum de remplissage est nécessaire pour évacuer les der-niers volumes d'air encore présents dans les dernières bulles accrochées sur la membrane de PDMS (voir chapitre 4.1.3).

Ce type de puce, utilisant la micro-aspiration pour réduire les volumes morts et simplier le remplissage des chambres, a été testé avec succès pour réaliser un criblage basique des conditions de cristallisation du lysozyme (voir annexe A.2).