Analyse des images par analyse des contours

Principe

Détection des contours

La détection des contours des vésicules est réalisée en utilisant la fonction "edge" de la toolbox Matlab. Cette fonction permet d'identier le contour d'ob-jets à partir des gradients de luminosité de leur contour. Plusieurs algorithmes de détection sont disponibles. La méthode retenue est la méthode de Canny. Cet algorithme sélectionne les maxima locaux de gradients sur l'image ltrée par un ltre Gaussien. Il permet d'ajuster deux seuils de détection : un pour les faibles variations (contours faibles) et un autre pour les fortes variations (contours forts). Les contours sélectionnés sont les contours faibles contenant des zones à contour fort. Cette méthode permet d'obtenir des contours continus en limitant les contours parasites. Elle est moins sensible au bruit et donne une meilleure continuité des contours qu'un simple seuillage sur le gradient.

Trois paramètres peuvent être ajustés :

 σ : Écart-type du ltre Gaussien. L'augmenter supprime les petits objets et rend l'analyse moins précise (analyse plus oue)

 Les seuils de détection. Diminuer les seuils augmente le nombre d'objets. Augmenter le seuil haut supprime les objets peu contrastés et diminuer le seuil bas fait apparaître plusieurs contours par objet.

Ces paramètres ont été ajustés pour détecter correctement les vésicules dans nos conditions en microscopie en contraste de phase. Ils doivent être modiés en fonction de la résolution des images ou si le type de microscopie est changé. Pour rendre les contours plus connexes, la fonction "imclose" est utilisée. Cette fonction dilate les contours puis les re-contracte sans détruire la connexité des objets. Ceci a pour eet de coller les objets les plus proches, assurant une bonne continuité des contours. En revanche, cette fonction a l'inconvénient de coller les vésicules trop proches et ne permet donc de corriger des défauts de contour que sur quelques pixels.

Après extraction des contours (gure 2.1), les contours de moins de 10 points sont éliminés. Il ne reste plus qu'à vérier si ces contours sont bien des cercles et de calculer leur diamètre.

Prétraitement

L'image obtenue par la caméra possède généralement un faible contraste, une luminosité variable d'une image à l'autre et un bruit non négligeable pouvant perturber la détections des contours (augmentation des contours parasites et discontinuité dans les contours).

Pour augmenter la robustesse du programme, les images sont d'abord for-matées : la luminosité et le contraste de l'image sont améliorés et égalisés en

92 Chapitre 2. Vésicules de taille contrôlée

Figure 2.1  Détection des contours. Les traits rouges représentent les contours détectés superposés sur l'image originale.

utilisant une fonction d'égalisation de l'histogramme et le bruit est réduit par un ltre adapté.

Deux types distincts de bruits sont présents dans les images acquises avec la caméra utilisée (pixeLink PL A741) :

 Un bruit provenant des défauts du capteur (défauts ponctuels).  Un bruit Gaussien d'origine thermique.

L'image est ltrée en utilisant les outils de ltrage de la toolbox. Deux ltres successifs sont appliqués pour supprimer le bruit :

 Un ltre médian à 2 dimensions sur une matrice carrée de 3 pixels (fonc-tion "medlt2"). Ce ltre choisit pour chaque pixel la valeur médiane de la matrice de pixel environnant. Il est très ecace pour supprimer les dé-fauts ponctuels de pixel unique, mais peu ecace pour supprimer le bruit thermique.

 Un ltre de Wiener à 2 dimensions sur une matrice carrée de 5 pixels. Ce ltre est un ltre statistique ecace pour éliminer le bruit additif gaussien. Ce ltre est bien adapté au bruit thermique, mais ne supprime pas les défauts du capteur qui sont ponctuels.

Défaut du capteur Bruit thermique

Figure 2.2  Retrait du bruit dans les images. A gauche : Image bruitée. A droite : Image ltrée.

2.1. Méthode de caractérisation 93 Analyse des contours

Chaque contour extrait doit représenter le contour d'un cercle. Cette situa-tion idéale n'est généralement pas respectée et des objets parasites viennent s'ajouter aux contours corrects. Leur élimination se fait à la n. Tout d'abord, nous cherchons à mesurer le centre et le rayon de chaque contour à partir des coordonnées de ses points. Cette mesure se fait en optimisant au moindre carré un cercle libre sur l'ensemble des coordonnées de chaque objet.

Le problème se pose de la manière suivante : Considérons un cercle à approximer d'équation :

(x − xc)2+ (y − yc)2= r2 (2.1) où xc et yc sont respectivement l'abscisse et l'ordonnée du centre et r le rayon. Cette équation peut être développée sous la forme canonique :

ax + bx + c = −x2− y2 (2.2)

avec a = −2xc, b = −2yc et c = x2

c+ y2

c − r2

Si l'on a n couples {x; y} pour un même cercle, correspondant aux n point d'un contour détecté, on obtient un ensemble d'équations qui peut s'écrire sous forme matricielle :    x1 y1 1 ... ... ... xn yn 1    | {z } A   ^a_b c   | {z } X =    −x2 1− y2 1 ... −x2 n− y2 nc    | {z } B +    ε1 ... εn    | {z } E (2.3)

Où X correspond aux paramètres à approximer et l'erreur de l'approximation est donnée sur chaque point par :

E = AX − B =    (x₁− x_c)2+ (y₁− y_c)2− r2 ... (xn− xc)2+ (yn− yc)2− r2    (2.4)

L'erreur εi, ainsi dénie pour chaque point i, correspond à la diérence entre le rayon approximé et la distance du point considéré avec le centre. Le carré de Eest minimal lorsque grad(E2) = 0. On peut montrer que dans ce cas :

X = (AtA)−1AtB (2.5)

Diérentes interprétations de l'erreur sont alors possibles en fonction du paramètre que l'on considère erroné. Si l'on interprète l'erreur comme une erreur de rayon, on remplace r par rr+ eoù rrest le rayon réel du point, c'est-à- dire la distance entre le point et le centre, et e est l'erreur sur le rayon, c'est-à-dire la distance entre r et rr. L'équation 2.4 devient alors :

εi = (xi− xc)2+ (yi− yc)2− (rri+ ei)2= −2rei− e2

i (2.6)

Où eiest l'erreur ajoutée au rayon calculé pour chaque point i, c.-à-d. la distance de chaque point i du contour au cercle approximé suivant l'axe (ci).

94 Chapitre 2. Vésicules de taille contrôlée L'erreur sur le rayon s'exprime donc :

ei= rri− q

r2

ri− εi (2.7)

Le calcul de cette erreur va servir comme critère pour éliminer les contours parasites. Lorsque le contour est bien déni, les vésicules sont détectées avec une bonne précision (gure 2.3A)

Supression des contours parasites

Les images contiennent généralement un certain nombre de défauts (pous-sières, vésicules collées, contours parasites, etc.) qu'il faut écarter pour qu'ils ne soient pas pris en compte dans le dénombrement des vésicules. Deux paramètres ont été retenus pour évaluer la conformité d'un objet comme vésicule :

 Avoir un écart-type de l'erreur sur le rayon inférieur à 25 % de son rayon. L'erreur d'approximation de chaque point est calculée comme indiqué au paragraphe précédent, puis normalisée par le rayon. La vésicule est rejetée si l'écart type de cette collection est supérieur à 25% (gure 2.3B).

 Posséder un contour recouvrant au moins 180◦ d'angle autour du centre. Pour mesurer l'angle de recouvrement du contour, on utilise trois vecteurs partant du centre du cercle et pointant sur le contour : à ses extrémités et sur son milieu. La diérence entre ces angles est utilisée pour extraire l'angle de recouvrement. Les contours possédant un angle de recouvrement inférieur à 180◦ sont écartés (gure 2.3C).

Conclusion

En pratique, la détection fonctionne bien pour les images en contraste de phase et pour les images en épiuorescence avec susamment peu de bruit. Ce programme nous a permis de réaliser rapidement des histogrammes sur plusieurs milliers de vésicules donnant des informations nes concernant leur morpholo-gie. Dans certains cas, l'analyse des contours par cette méthode ne donne pas de bons résultats. Les conditions qui ne permettent pas ou alors dicilement le traitement des images par cette méthode d'analyse du contour sont les sui-vantes :

 Si plusieurs vésicules sont collées, le groupe de vésicule n'est pas détecté ou n'est détecté qu'une seule fois de manière erronée. C'est la principale limitation.

 Si le contraste des vésicules varie beaucoup d'une vésicule à l'autre, il est dicile de détecter les vésicules faiblement contrastées sans produire de détection de contours parasites diciles à écarter.

 Si le bruit de l'image est trop important, les vésicules ne sont pas détectées sur l'image originale et il est dicile de trouver un ltre qui conserve le contraste de la vésicule en supprimant susamment le bruit.

Par exemple, les images prises au microscope confocal de protéines uorescentes encapsulées dans les vésicules (cf. chapitre 4.2) vérient ces trois conditions. Elles ont donc nécessité une autre méthode d'analyse qui est abordée au chapitre suivant.

2.1. Méthode de caractérisation 95

B

A

C D

Figure 2.3  Optimisation de cercles sur les contours de l'image. A) Résultat de la détection sur une image typique. B) Les cercles verts représentent les détections validées. B) les cercles rouges représentent les objets invalidés car leur forme n'est pas susamment circulaire. C) Les cercles violets représentent les objets invalidés car l'arc formé par le contour ne parcourt pas un angle susant sur le cercle.

96 Chapitre 2. Vésicules de taille contrôlée