La Microuidique pour la fabrication des GUV

Les méthodes de gonement spontané de vésicules donnent généralement une importante polydispersité qui ne peut être corrigée par les techniques habi-tuelles de reformation des SUV et des LUV (extrusion ou déplétion de solvant). Face à la nécessité d'obtenir des vésicules géantes monodisperses pour leurs perspectives d'application dans le domaine des cellules articielles, un impor-tant eort de recherche s'est récemment concentré sur la fabrication de GUV monodisperses. Comme l'échelle de ces objets est bien loin de l'échelle mise en jeu dans les phénomènes d'auto-organisation, l'utilisation d'un patron de taille micrométrique nécessitant des technologies de microfabrication paraît la solu-tion la plus appropriée. Les résultats des recherches récentes semblent conrmer a posteriori cette supposition.

1.3. Les méthodes de fabrication 85 Lasi£ et al. avaient déjà introduit en 1987 l'utilisation de surface texturées pour contrôler la taille de SUV et de LUV fabriqués par la méthode de l'hy-dratation [122, 123, 124]. D'autre part, la fabrication de vésicules par extrusion permet un bon contrôle de leur taille moyenne qui est en rapport avec la taille des pores de la membrane utilisée. Une bonne monodispersité peut même être obtenue pour les SUV de taille inférieure à 100 nm fabriquées de cette manière [125, 75]. Mais cette méthode n'est pas directement applicable à la fabrication de GUV. Néanmoins, s'inspirant de cette méthode, Dittrich et al. ont montré qu'il était possible de fabriquer des vésicules de 4 ± 2 µm de diamètre par ex-trusion d'un lm de phospholipide multicouche à travers des trous de 3,5 µm micro-fabriqués dans une membrane de nitrure de silicium. Les vésicules obte-nues étaient multilamellaires et relativement polydisperses [126]. Toujours par extrusion, mais cette fois-ci à l'aide d'un jet de liquide propulsé à l'aide d'une micropipette à travers une bicouche de phospholipide, Funakoshi et al. ont ob-tenu des vésicules monodisperses de 300 ± 30 µm [127], mais leur membrane contenait une quantité notable d'huile. En améliorant cette technique, Stacho-wiak et al. ont obtenu des GUV monodisperses de 200 ± 6 µm [128](gure 1.7C). Ces derniers ont montré la possibilité d'incorporer une protéine canal membra-naire dans la membrane (α-hemolysine) conrmant le caractère fonctionnel et unilamellaire de la membrane. Néanmoins, cette méthode ne permet pas encore d'obtenir un grand nombre de vésicules en un temps raisonnable et la taille des vésicules obtenues reste trop grande pour servir de modèle cellulaire.

En utilisant l'électroformation, Taylor et al. ont obtenu des vésicules de taille contrôlée en imprimant le phospholipide sur une électrode d'ITO par microcon-tact printing [129, 130] (gure 1.7A), mais il n'a jamais été montré qu'il était possible d'obtenir des vésicules réellement monodisperses par cette méthode. Ceci malgré d'autres tentatives [131] et comme nous le verrons dans le chapitre suivant.

Pour obtenir des vésicules parfaitement monodisperses, l'idée a également germé d'utiliser des patrons pour fabriquer les vésicules. En précurseur, Ka-tagiri et al. ont utilisé des particules monodisperses comme support de fabri-cation, ce qui a permis de fabriquer des simili-vésicules géantes parfaitement monodisperses, mais celles-ci s'apparentent plus à des membranes supportées sur un support sphérique qu'à de vraies vésicules [132] (gure 1.7B). Dans le même esprit, Shum et al. ont utilisé des émulsions doubles de taille contrôlée par microuidique (gure 1.7D). L'émulsion composée de gouttes d'eau dans un solvant organique volatile dans l'eau en présence de phospholipides, se trans-forme, après évaporation du solvant dans l'eau, en des vésicules parfaitement monodisperses [133]. Cette technique permet de fabriquer des vésicules plus rapidement qu'avec la technique micro-jet, mais le caractère unilaméllaire des vésicules obtenues reste à démontrer.

86 Chapitre 1. Les vésicules unilamellaires géantes

A B

C D

25 µm

100 µm

Figure 1.7  Fabrication de vésicules géantes monodisperses. A) Par électro-formation en imprimant des motifs de phospholipide sur l'électrode par micro-contact printing. Extrait de [129]. B) En utilisant des billes de polymère comme support. Extrait de [132]. C) par extrusion microjet (En insert : formation d'une vésicule). Extrait de [128]. D) Vésicules formées a partir d'une double émulsion et contenant des particules de latex (En insert : fabrication de l'émulsion). Ex-trait de [133].

1.4. Conclusion 87

1.4 Conclusion

Des quatre ordres de grandeur qui séparent la taille des plus petites vésicules de la taille des plus grandes, résulte un large panel d'objets plus ou moins sphé-riques. Après avoir introduit les bases de leur composition, nous avons présenté les diérentes congurations que pouvaient prendre les vésicules composées de phospholipides, également appelées liposomes, et leurs applications potentielles comme outils dans le domaine de la recherche et dans l'industrie. Le cas des vésicules unilamellaires géantes a attiré plus particulièrement notre attention comme brique de base des cellules articielles qui orent actuellement de nou-velles perspectives dans des domaines très divers, comme la compréhension des mécanismes cellulaires ou la production industrielle de protéines. La nécessité de trouver de nouvelles méthodes pour fabriquer des vésicules géantes de taille contrôlée, indispensables à l'élaboration des prochaines générations de cellules articielles en est ressortie. Après une rétrospective des diérentes méthodes de fabrication des vésicules, nous avons présenté plus précisément la méthode de l'électroformation dont il sera question dans le chapitre suivant. Pour nir, nous avons présenté les diérentes techniques microuidiques apparues récem-ment visant l'obtention de vésicules monodisperses. Si certaines présentent des aspects très intéressants, notamment pour l'encapsulation de solutions variées, aucune d'entre elles ne permet encore de remplacer l'électroformation qui per-met d'obtenir un grand nombre de GUV parfaitement unilamellaires et qui peut s'aranchir de l'utilisation de solvants organiques, condition indispensable à l'in-tégration de protéines sensibles dans la membrane.

Comment mieux contrôler cette technique de fabrication encore mal com-prise ? C'est à cette question que tentera de répondre le chapitre suivant.

Chapitre 2

Electroformation de vésicules

de taille contrôlée

N

ous avons discuté dans le premier chapitre, la nécessité de trouver des mé-thodes permettant la fabrication de GUV de taille contrôlée pour les pro-chaines générations de cellules articielles. Certaines ont déjà vu le jour paral-lèlement à nos travaux et permettent d'obtenir des vésicules monodisperses en utilisant des techniques microuidiques d'extrusion ou d'émulsion double. Tou-tefois, ces techniques sourent encore de faibles rendements et n'ont pas permis d'obtenir des membranes de très bonne qualité. Seule l'électroformation permet d'obtenir un grand nombre de vésicules unilamellaires avec une bicouche bien dénie. Il demeure que jusqu'à présent, aucune technique de contrôle de la taille de vésicules fabriquées de cette manière n'a encore donné de résultats satisfai-sants. Pourtant, pour certaines applications, l'utilisation de l'électroformation orirait une plus grande liberté quant à la composition et la qualité de la mem-brane des GUV formées. Dans ce chapitre, nous apporterons certaines réponses à ce problème.

Nous commencerons par décrire les outils informatiques que nous avons dé-veloppés pour caractériser la taille des vésicules par analyse d'image. Ensuite, des paramètres de l'électroformation : tels que la température, le temps de gon-ement et la nature de la surface dont l'inuence est peu connue seront étudiés en terme d'inuence sur la distribution des tailles des vésicules électroformées. Pour nir, deux techniques basées sur le masquage de l'électrode et l'impression de motifs de phospholipide sur l'électrode permettant un certain contrôle de la taille des vésicules seront présentées.

90 Chapitre 2. Vésicules de taille contrôlée

2.1 Méthode de caractérisation de la taille des

vésicules

Pour quantier la distribution en taille des vésicules fabriquées, il est né-cessaire de pouvoir mesurer leur taille une fois celles-ci extraites. L'observation des vésicules contenant du sucrose dans une solution de glucose donne un bon contraste au microscope à contraste de phase, grâce à la diérence d'indice entre le contenu de la vésicule et son milieu. Les liposomes ainsi observés sont carac-térisés par un disque sombre entouré par un halo blanc et le niveau de signal sur bruit est élevé. Cette forme caractéristique se prête bien à l'analyse d'image.

De nombreuses méthodes d'analyse d'image existent pour détecter ce type d'objet. Les trois suivantes ont été l'objet de nos investigations :

 Seuillage. Cette méthode consiste à séparer l'objet du fond en sélection-nant les zones de l'image dont la luminosité est supérieure à un certain seuil, puis de mesurer la taille des objets détectés. C'est la méthode la plus simple à mettre en ÷uvre. Elle a été utilisée pour analyser les premières expériences, mais elle a vite été abandonnée à cause de son manque de robustesse. Le seuillage est bien adapté pour analyser les vésicules uores-centes car leur luminosité est homogène et les images contiennent généra-lement peu d'objets parasites.

 Détection de contours. Cette méthode consiste à sélectionner les maxima de gradients spatiaux de luminosité. C'est la méthode retenue pour faire les histogrammes des tailles des vésicules observées en contraste de phase. Elle fonctionne bien si les images sont de bonne qualité.

 Transformée. A l'instar de la transformée de Fourrier à 2 dimensions qui décompose l'espace de l'image en somme de sinusoïdes, cette méthode propose d'utiliser une transformée identiant des formes de vésicule. Cette solution est plus robuste et plus souple, mais très coûteuse en termes de calcul et d'espace mémoire. Elle sera utilisée pour le cas dicile de l'analyse des images confocales d'expression de protéines dans les vésicules lorsque l'expérience ne peut produire d'images de bonne qualité.

Les programmes d'analyse ont tous été réalisés avec Matlab et sa boite à outil  Image processing toolbox  qui propose de nombreux outils facilitant la manipulation des images.

Dans le document Dépôt de matière et formation de motifs sur une surface solide : Méthodes microfluidiques, Contrôle par forces capillaires et Génération de vésicules géantes. (Page 97-103)