Matériels et Méthodes

B.5.1 Matériels

Patients

Les Contrôleurs du VIH (groupe HIC; n = 15) ont été recrutés dans le cadre de la cohorte CO21 CODEX mise en œuvre par l'Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS). Les contrôleurs du VIH ont été définis comme des patients infectés par le VIH-1 qui étaient séropositifs pendant plus de 5 ans, n'avaient reçu aucun traitement antirétroviral, et pour lesquels plus de 90% des mesures de la charge virale plasmatique étaient indétectables par des tests standards. Tous les contrôleurs du VIH inclus dans la présente étude ont des charges virales actuelles <50 copies d'ARN du VIH / mL. Le groupe de patients traités de manière efficace (groupe HAART; n = 15) a reçu un traitement antirétroviral pendant au moins 5 ans et a montré une suppression virale à long terme avec des charges virales <50 copies / mL. Les patients traités ont été recrutés à l'hôpital Raymond Poincaré (Garches, France) et à l'hôpital Bicêtre (Le Kremlin-Bicêtre, France). Le groupe donneur sain (groupe HD, n = 8) était composé d'individus anonymes sains qui ont fait un don de sang à l'Etablissement Français du Sang (EFS, Paris, France). L'étude a été promue par l’ANRS sous le numéro EP36-8 et EP36-10. Tous les participants ont donné leur consentement écrit préalable avant l'échantillonnage du sang.

Anticorps

Les anticorps suivants ont été utilisés pour des marquages membranaires : Analyse d’expression sur cellule unique

Mêmes anticorps que dans l’étude Tfh additionnés de: anti-CCR5-PerCP/Cy5.5 (clone HEK/1/85a), anti-CXCR3-BV605 (clone 1C6/CXCR3) et anti-CCR7-PE-Cy7 (clone G043H7),

Analyse des cellules T CD4+ primaires fusionnées

anti-CD3-BUV395 (clone UCHT1), anti-CD4-BD Horizon™ R-phycoerythrin-CF594 (PE- CF594) (clone RPA-T4), anti-CD45RA-BUV737 (clone HI100), anti-CCR5-AF700 (clone HEK/1/85a), anti-TCR-Allophycocyanin (APC) (clone IP26) et le marqueur de viabilité eFluor® 780 (eF780) (eBioscience) a été ajouté pour analyser les cellules vivantes.

B.5.2 Méthodes

Culture cellulaire

PBMC

Les PBMC ont été isolées par un gradient de centrifugation Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences) à partir de sang humain de donneurs anonymes obtenu auprès de l’Etablissement Français du Sang (EFS) (Paris, France) ou de patients Contrôleurs et traités. Les cellules purifiées ont été utilisées pour les expériences ou cryo-préservées dans de l’azote liquide.

Les lignées cellulaires HEK 293T

Les cellules humaines embryonnaires de rein (HEK 293T) utilisées dans cette étude ont été cultivées dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 100 unités / mL de pénicilline et 100 µg / mL de streptomycine.

Marquage des tétramères

Les patients ont été génotypés pour le gène HLA-DRB1 avec une résolution de 4 digits en utilisant le kit INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus (Fujirebio). Seuls les patients ayant un génotype présentant au moins un des allèles suivants ont été inclus dans l’étude : DRB1*0101 (DR1), DRB1*1101 (DR11), DRB1*1501/1502 (DR15) ou DRB5*0101 (DRB5). Les tétramères de CMH-II couplés au fluorochrome APC correspondants aux allèles suivantes : DR1, DRB15 et DRB5 ont été obtenus auprès du NIH Tetramer Core Facility (Emory University, USA). Les monomères biotinylés DR11 ont été obtenus respectivement auprès du Dr Fabrice Lemaître (Institut Pasteur, Paris) et du Tetramer Core Laboratory of the Benaroya Research Institute (Seattle, USA).

Les monomères ont été incubés avec 0,2 mg/mL de peptide Gag293 ou de peptide associé à la chaîne invariante (CLIP) « PVSKMRMATPLLMQA », un peptide contrôle. L’incubation s’est faite à 37°C durant 72h en présence de 2,5 mg/mL de n-octyl-b-D-glucopyranoside et un cocktail d’inhibiteurs de protéases. Les monomères chargés avec les peptides Gag293 ou CLIP ont été tétramérisés avec de la streptavidine marquée avec APC (eBioscience). Le protocole de marquage des tétramères CMH-II a été adapté de (618)

Les PBMC fraichement isolées de patients (ou récupérées après cryo-préservation ou après

milieu complet RPMI supplémenté avec 15% de sérum humain AB pendant 90 min à 4°C. Les marquages ont été réalisés sur 5.106 PBMC / tubes dans 100 µL final, avec 1 tube pour le contrôle CLIP et au moins 2 tubes pour le marquage tétramère Gag293. Les combinaisons d’anticorps ciblant des marqueurs de surface ont été ajoutées durant les 30 dernières minutes de l’incubation. Après lavage, les cellules ayant subi les mêmes conditions de marquage ont été groupées, à un minimum de 1.106 de PBMC pour la condition avec le tétramère Gag293 (Pour plus de détails cf Annexe 2).

Analyse sur cellule unique

Tri de cellules uniques

A partir des PBMC marquées avec des tétramères et des anticorps, les cellules T CD4+ sont sélectionnées par cytométrie en flux dans les populations suivantes : CD3+, CD4+, CD14-, CD20-, Marqueur de viabilité-, CD8- et CD4+.

Les cellules T CD4+ spécifiques de Gag293 (Tet+) sont alors triées sur la base du marquage tétramère, dont la fenêtre a été fixée à partir du contrôle CLIP. Les cellules non-spécifiques qui ne montrent pas de marquage tétramère (Tet-) sont triées sur leur phénotype mémoire (CD45RA-). Nous réalisons alors un tri en cellule unique à l’aide du trieur cellulaire FACSAria II cell sorter (BD Biosciences) présent sous une hotte de sécurité microbiologique. Chaque cellule est triée dans un puits d’une plaque PCR 96 puits, contenant du NP40 à 0,5% pour lyser les cellules, une RNase (Superase-in) et un tampon commercial (5x Vilo) pour la transcription inverse. Pour chaque patient, 25 cellules Tet+ et 25 Tet- ont été triées, en utilisant le mode « single cell purity » permettant d’éviter les contaminants. Durant le tri nous avons utilisé la technologie « index sorting » permettant d’enregistrer les paramètres MFI des cellules triées. En plus de la combinaison utilisée pour la sélection des cellules, nous avons aussi enregistré 4 paramètres (CCR7, CCR5, CXCR3, et PD-1). Nous avons aussi enregistré au moins 5.106 évènements pendant la durée du tri permettant de faire le phénotypage de l’ensemble des cellules. Les cellules triées et lysées ont été ensuite stockées à -80°C.

Transcription inverse et amplification des gènes d’intérêt par PCR

Après décongélation, les échantillons ont été dénaturés pendant 90s à 60°C, puis ont subi la transcription inverse avec le mix enzymatique « SuperScript® Enzyme Mix », contenant la RT SuperScript III et la RNase (Thermo fisher). Nous avons amplifié les 48 gènes d’intérêt à partir des ADNc néo-synthétisés, pour cela nous avons réalisé une PCR en présence de nos 48 paires d’amorces (testées préalablement en qPCR classique) à 0,2X chacune et du MIX « TaqMan® PreAmp Master » contenant la polymérase ADN « AmpliTaq Gold® DNA Polymerase » (Thermo fisher). S’en suivent 20 cycles d’amplification et d’exonucléase pour enlever les amorces résiduelles. L’ADNc amplifié et nettoyé de ses amorces est alors dilué au 1/5ème _{dans du tampon TE, puis conservé à -20°C.}

qPCR multiplexée en micro-fluidique

Les échantillons et amorces ont été préparés pour une plaque 48.48 « Fluidigm Dynamic arrays » (Fluidigm, San Fransisco, CA, USA) selon les recommandations indiquées par le fournisseur. Brièvement, chaque paire d’amorces, à 10 µM, a été mélangée au mix « 2x assay loading reagent » et les échantillons à l’evagreen et au « 20X Fluidigm sample reagent ». Les échantillons et amorces sont alors chargés dans la plaque 48.48 « Fluidigm Dynamic arrays » où la puce a été apprêtée, puis la PCR en temps réel a été exécutée sur le système biomark pour l’analyse génétique suivant les instructions du fournisseur. Les données ont été collectées en utilisant le logiciel Fluidigm « real-time PCR Analysis ».

Normalisation et nettoyage des données

Les cellules montrant des expressions trop basses pour leur gène de ménage (GAPDH) ont été retirées. Les cellules présentant des expressions faibles dues à des dimères d’amorces, détectables par la courbe de fusion, ont également été retirées. Chaque expression génique a été normalisée à la GAPDH de la cellule correspondante. Après compensation à partir des cellules monomarquées et normalisation des expression géniques, les expressions protéiques (6 MFI) et géniques (44 gènes) ont été rassemblées dans un tableau regroupant toutes les cellules des 9 patients Contrôleurs et des 9 patient traités. Sur la population totale que nous avons acquise durant le tri, nous avons été capable de fixer des fenêtres de sélection pour

discriminer pour chaque paramètre MFI si la cellule était positive ou négative pour ce paramètre donné, nous permettant par la suite de discriminer les cellules CXCR5+ des cellules CXCR5- par exemple. La partie d’analyse des données se trouve dans la section statistiques.

Gènes et MFI étudiés

Gènes

APOBEC3G, AV24, BATF, BCL6, BST2, BV2, CCL3 ISO, CCL4 ISO, CCL5, CCR4, CCR5, CCR6, CD274, CD40, CD40LG, CTLA4, CXCL8, CXCR3, CXCR5, EOMES, FAS, FASLG 2, FOXP3, GAPDH, GATA3, GZMB, HLADRB1, ICOS, IFNA, IFNG, IL10, IL12RB2, IL15RA, IL21, IL21R, IL2RA, IL2RB, IL7R, LAG3, MAF, MX2, PRDM1, PRF1, RORC, SERINC5, TBX21, TRIM5A, ZBTB7B.

MFI

CXCR5 -AF488, CXCR3-AF700, CD8-BV785, PD-1-PE, CCR7-PE-Cy7, CCR5-PerCP- Cy5-5.

Analyse des cellules T CD4+ fusionnées

Production de virus Blam-Vpr

La séquence codant pour la gp160 de la souche R5 JRFL a été intégrée dans le plasmide pNL4.3-Ren, ADN proviral, qui contient la séquence de la souche de VIH-1 de tropisme X4 NL4.3, en lieu et place du gène de l’enveloppe. La séquence de ce plasmide contient un gène rapporteur (la luciférase de Renilla Reniformis) en lieu et place du gène nef.

Les virus JRFL-Blam-Vpr ont été produits en co-transfectant dans des cellules HEK 293T, par la méthode de précipitation au phosphate de calcium, l’ADN proviral exprimant la glycoprotéine d’intérêt, le plasmide pCMV4-Blam-Vpr et le plasmide pAdvantage permettant d’optimiser la production de virus. La transfection a été faite dans des flasques T162 cm2, contenant 10 millions de cellules, avec 43 µg d’ADN proviral, 6 µg de plasmide pCMV4- Blam-Vpr et 7 µg du plasmide pAdvantage. Dix huit heures après transfection, le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais et 48 h post-transfection les surnageants de culture ont été récoltés, centrifugés à 800 g pendant 5 min puis concentrés 50 fois dans du milieu DMEM contenant 10% de SVF après ultracentrifugation à 83000 g pendant 90 min. Les virus ainsi produits ont été quantifiés à l’aide d’un kit ELISA de dosage de la protéine Gag p24

Fusion

Cette technique mesure la fusion de virus ayant incorporé la protéine de fusion β-lactamase (BLAM)-Vpr à des cellules cibles qui seront chargées par le substrat (CCF2) de la BLAM, (664). Suite à la fusion, le CCF2-AM (Life Techonologies) sera clivé par la BLAM qui aura été libérée dans les cellules où le virus a fusionné, ce qui se traduira par un changement dans le spectre d’émission de fluorescence de cette molécule passant du vert (520 nm) au bleu (447 nm). Ce changement d’émission de fluorescence dans les cellules ayant fusionnées avec le virus, souvent quantifié en pourcentage de cellules « bleues », sera mesuré par cytométrie en flux.

Les expériences de fusion ont été réalisées en tubes Eppendorf dans un volume final de 500 µL de milieu de culture contenant 5.106 _{PBMC préalablement décongelées et ayant subies 30}

à 60 min de culture à 37°C. Ces PBMC sont alors mélangées avec 150 ng de p24 de virus JRFL-Blam-Vpr. Plusieurs tubes sont préparés : 1 tube pour le contrôle sans virus, 1 tube pour le marquage tétramère contrôle avec CLIP (sans substrat), 1 tube pour le marquage tétramère Gag293 (sans substrat), et au moins deux tubes qui seront groupés à la fin de l’expérience pour l’évaluation de la fusion dans les cellules tétramères positives (avec virus et substrat).

Les mélanges virus / cellules ont été soumis en premier lieu à une spinoculation (2000 g, 1 h, 4°C). Les cellules ont ensuite été resuspendues puis incubées pendant 3 heures à 37°C. A l’issue de l’expérience, les cellules ont ensuite été centrifugées, puis resuspendues dans une solution de CCF2-AM préparée préalablement selon les instructions du fournisseur (Life Technologies) diluée dans du milieu C02 indépendant, ou seulement avec du milieu C02

indépendant pour les contrôles sans substrat.

Les cellules sont alors maintenues dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h. A la fin de la période d’incubation, les cellules sont lavées deux fois avec du RPMI 15% de sérum humain AB puis nous réalisons le marquage tétramère (cf section marquage tétramère). Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps, qui nous permettront de discriminer les cellules T CD4+ ainsi que les sous-populations mémoires (cf panel anticorps dans section anticorps). Les cellules sont par la suite lavées deux fois avec du PBA (PBS 1% BSA 0,09% azide de sodium) et fixées avec une solution PBS 2% paraformaldéhyde. Le pourcentage de cellules ayant fusionnées a été mesuré par cytométrie en flux avec un FACS Symphony (BD Biosciences). L’analyse des populations cellulaires infectées a été faite avec le logiciel FlowJo10.

Statistiques Analyse statistique sur cellule unique Comparaison de l’expression génique et protéique sur cellule unique, avec correction pour comparaisons multiples

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant MAST (v1.0.5) progiciel (1) issu du logiciel R (v3.3.3). Ce « package » est basé sur un modèle linéaire généralisé en deux parties : le modèle de hurdle adapté au bimodal et/ou aux données d’expression génique en cellule unique à inflation de zéro. Après un contrôle qualité des données, 25 cellules ayant des valeurs aberrantes ont été écartées de l’analyse. L’expression des gènes a été normalisée par rapport au contrôle GAPDH. L’analyse de l’expression des gènes et des MFI a été réalisée indépendamment. Pour chaque groupe de patient, le modèle hurdle a été utilisé pour détecter les différences d’expression entre les cellules Tet+ et Tet- (MFI ou gènes). Nous avons défini un modèle incluant le nombre de patients, le statut « tétramère » (Tet-, Tet+) et le statut « groupe de patient » (HIC, HAART), les interactions entre les deux dernières variables et les interactions entre le nombre de patients et le groupe de patients. Cette dernière interaction a été utile pour déterminer l’appariement entre les cellules provenant d’un même patient. Afin d’évaluer la différence d’expression pour chaque gène, nous avons défini des « vectors of contrats » et appliqué un test de Wald. Les p-values obtenues ont été ajustées en utilisant les procédures Benjamini et Hochberg (686).

Réseaux de co-expression de gènes entre les cellules uniques

Les réseaux de co-expression ont été inférés grâce au progiciel huge (687) (v1.2.7) de R basés sur des corrélations de spearman et des regroupements de nœuds en utilisant des mélanges de graphiques aléatoires Erdos-Renyi (688) proposé par le progiciel (v1.8). Cette approche permet de détecter les groupes de gènes qui sont positivement ou négativement corrélés.

Analyse Discriminante Linéaire

Une analyse “Analyse Discriminante Linéaire” (LDA) a été réalisée sur les expressions géniques et MFI en utilisant le progiciel MASS (v7.3-47) de R (689). La LDA est une

de variables (expression génique ou MFI) qui caractérise et sépare les 4 sous-groupes d’intérêt décrits en fonction du statut « groupe de patients » et « Tet » (Tet+ ou Tet-). De la même manière que l'analyse en composantes principales (PCA), la LDA recherche des combinaisons linéaires de fonctionnalités qui expliquent le mieux les informations contenues dans les données, à l'exception que la LDA vise explicitement à modéliser la différence entre les 4 classes d'intérêt en maximisant la variabilité entre les groupes, et en minimisant la variabilité au sein des groupes.

Autres analyses statistiques

Les analyses ont été effectuées avec le logiciel GraphPad Prism 6.0. Les différences de variables entre les groupes ont été analysées avec le test U de Mann-Whitney. Les corrélations ont été analysées avec le coefficient R. de Spearman. Toutes les différences significatives entre les groupes (P <0,05) ont été rapportées sur les graphiques de données.

B.6. Légende des figures

Figure 1: Les Contrôleurs du VIH présentent une forte proportion de cellules T CD4+ spécifiques de Gag293.

Analyse FACS des cellules T CD4+ spécifiques de Gag293 provenant de PBMC congelées de Contrôleurs du VIH (HIC, n=9) et de patients traités (HAART, n=9). (A) Graphique FACS en nuage de points représentatifs décrivant la stratégie de sélection des cellules T CD4+. Les cellules T CD4+ viables ont été sélectionnées de la manière suivante : CD20- CD14- Marqueur de viabilité- CD3+ CD4+ CD8-. (B) Graphique FACS en nuage de points représentatifs décrivant la stratégie de sélection utilisée pour réaliser une analyse des cellules T CD4+ mémoires spécifiques de Gag293. Panneau haut: Graphique FACS en nuage de points décrivant un marquage tétramère de HLA-DR chargé, soit avec un peptide contrôle CLIP (panneau gauche), soit avec le peptide immunodominant de la réponse VIH Gag293 (panneau droite). En vert, sélection des cellules négatives pour le marquage tétramère Gag293 (Tet-), et en orange, sélection des cellules positives pour le marquage tétramère Gag293 (Tet+). Panneau bas : Sélection des cellules mémoires (CD45RA-) pour la population Tet- (panneau gauche) et Tet+ (panneau droite). (C) Comparaison de la fréquence de cellules positives pour le tétramère Gag293 entre les Contrôleurs du VIH et les patients traités.

Les barres représentent les médianes. Les différences significatives (P<0,05) obtenues par le test statistique Mann-Whitney sont reportées.

Figure 2: Les cellules T CD4+ spécifiques de Gag sont activées et engagées dans une différenciation Th1 à profil cytotoxique

Analyse phénotypique sur cellule unique, de 371 cellules T CD4+ mémoires spécifiques du VIH et 360 cellules non spécifiques provenant de PBMC congelées de Contrôleurs du VIH (HIC, n=9) et de patients traités (HAART, n=9). Nous avons divisé ces cellules en quatre groupes, les cellules triées par marquage tétramère de HLA-DR chargé avec le peptide Gag293 (HIC CD45RA- Tet+: 191 ; HAART CD45RA- Tet+:180) et les cellules non spécifiques (HIC CD45RA- Tet-: 171 ; HAART CD45RA- Tet- : 189) (cf stratégie de tri présentée en Figure 1). L’expression ARNm de 44 gènes a été rapportée à l’expression ARNm de la GAPDH (post tri) et l’expression de 6 protéines à la membrane est représentée par leurs MFI détectées par cytométrie en flux (pendant le tri) (cf liste dans la section matériels et méthodes) par cellule. (A) Diagramme de dispersion des cellules dérivant de