II.1. Réactifs et échantillons utilisés
L’acétonitrile (ACN), le méthanol (MeOH) et l’eau (H2O) utilisés (tous de qualité LC-MS) ont été fournis par Fisher Scientific (Strasbourg, France). L’urée, le dithiothréitol (DTT), l’iodoacétamide (IAM), le bicarbonate d’ammonium (AMBIC), l’acide formique (AF) et la trypsine (type IX-S, pancréas de porc) ont été commandés chez Sigma-Aldrich (St. Quentin-Fallavier, France). Les peptides synthétiques utilisés ont été achetés chez Proteogenix (Oberhausbergen, France) avec des puretés supérieures à 95%. Les échantillons de plasma ou de sérum proviennent de différentes cohortes fournies par des organismes partenaires, leur provenance et constitution seront indiquées au fur et à mesure de ce développement. Le plasma humain utilisé pour les essais préliminaires et la constitution des contrôles qualité (QCs), à partir d’un pool de 3 donneurs sains hommes, a été fourni par l’Etablissement Français du Sang (EFS). Les échantillons ont été conservés au congélateur jusqu’au moment de leur préparation.
II.2. Optimisation des paramètres MS/MS pour les peptides suivis
Les paramètres utilisés pour suivre les peptides concernés par l’étude ont été obtenus en infusant des solutions contenant 200 ng/mL de chaque peptide dans un mélange H2O/ACN (90/10, v/v)
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contenant 0.5% AF, de la même manière que cela est décrit dans le chapitre bibliographique. La spécificité des transitions sélectionnées (3 transitions par peptide) a été contrôlée comparant le rapport des transitions en solution, à celui obtenu dans un échantillon de plasma EFS digéré selon le protocole ci-dessous. Le peptide LGADMEDVCGR correspondant à la forme E4 de l’apolipoprotein E a été ajouté à 200 ng/mL afin de pouvoir également contrôler la spécificité des transitions. La liste des paramètres obtenus pour les 42 transitions associées est donnée dans le Tableau 6 ci-dessous :
Tableau 6. Paramètres MS/MS associés aux 14 peptides suivis dans l'étude.
Protéine Q1 Q3 ID DP CE
Apolipoprotein A-I 516.3 416.2 LSPLGEEMR_y72+
65 23 516.3 621.2 LSPLGEEMR_y5+ 65 31 516.3 734.2 LSPLGEEMR_y6+ 65 31 524.2 847.2 LSPLGEEMR_ox_y7+ 81 23 524.2 637.0 LSPLGEEMR_ox_y5+ 81 29 524.2 750.0 LSPLGEEMR_ox_y6+ 81 25 Apolipoprotein A-IV 608.4 804.2 ALVQQMEQLR_y6+
96 31 608.4 516.3 ALVQQMEQLR_y82+ 96 25 608.4 676.2 ALVQQMEQLR_y5+ 96 35 616.4 524.2 ALVQQMEQLR_ox_y82+ 81 25 616.4 465.6 ALVQQMEQLR_ox_y7(-H2O)+ 81 33 616.4 416.1 ALVQQMEQLR_ox_y3+ 81 41 Apolipoprotein B 492.1 682.2 MGLAFESTK_y6+ 89 23 492.1 852.2 MGLAFESTK_y8+ 89 21 492.1 611.1 MGLAFESTK_y5+ 89 23 500.2 682.2 MGLAFESTK_ox_y6+ 89 23 500.2 318.1 MGLAFESTK_ox_y3(-NH3)+ 89 25 500.2 611.2 MGLAFESTK_ox_y5+ 89 25 Apolipoprotein D 646.8 961.2 MTVTDQVNCPK_y8+ 131 29 646.8 314.0 MTVTDQVNCPK_b3(-H2O)+ 131 29 646.8 518.0 MTVTDQVNCPK_y4+ 131 29 654.8 961.1 MTVTDQVNCPK_ox_y8+ 126 29 654.8 347.9 MTVTDQVNCPK_ox_b3+ 126 29 654.8 518.0 MTVTDQVNCPK_ox_y4+ 126 31 Apolipoprotein E 769.0 987.3 SWFEPLVEDMQR_y8+ 80 31 769.0 550.2 SWFEPLVEDMQR_y7(-NH3)+ 80 27 769.0 678.2 SWFEPLVEDMQR_y5+ 80 31 776.9 1003.5 SWFEPLVEDMQR_ox_y8+ 90 35,5 776.9 502.2 SWFEPLVEDMQR_ox_y82+ 90 35,5 776.9 694.3 SWFEPLVEDMQR_ox_y5+ 90 35,5 Apolipoprotein E (forme E4) 611.8 735.2 LGADMEDVCGR_y6+ 106 29 611.8 491.2 LGADMEDVCGR_y4+ 106 41 611.8 866.2 LGADMEDVCGR_y7+ 106 31 619.7 392.0 LGADMEDVCGR_ox_y3+ 121 35 619.7 606.0 LGADMEDVCGR_ox_y5+ 121 35 619.7 735.1 LGADMEDVCGR_ox_y6+ 121 33 Apolipoprotein L1 637.9 932.3 VNEPSILEMSR_y8+ 100 29 637.9 343.0 VNEPSILEMSR_b3+ 100 27 637.9 522.2 VNEPSILEMSR_y4+ 100 31 645.8 948.2 VNEPSILEMSR_ox_y8+ 116 27 645.8 343.0 VNEPSILEMSR_ox_b3+ 116 27 645.8 651.1 VNEPSILEMSR_ox_y5+ 116 31
99 Les transitions bleues se reportent aux transitions qui seront utilisées ensuite pour calculer le ratio d’oxydation des protéines (cf partie suivante).
II.3. Digestion enzymatique des échantillons humains
Pour éviter une oxydation supplémentaire induite par une décongélation trop rapide des échantillons, ceux-ci ont été décongelés sur bain de glace avant leur aliquotage en vue de l’étude. Après une prise d’échantillon biologique de 40 μL (plasma ou sérum), 80 μL d’urée 8M préparé dans de l’eau déminéralisée ont été ajoutés, ainsi que 11 μL de DTT à 150 mM, préparé dans de l’AMBIC 50 mM. L’échantillon a été placé à 60°C dans un bain thermostaté pendant 40 min. Après retour à température ambiante, et ajout de 34 μL d’IAM à 150 mM, préparé dans de l’AMBIC 50 mM, l’échantillon a été placé à l’obscurité pendant 40 min, à température ambiante. Une fois celui-ci récupéré, 600 μL d’AMBIC 50 mM ont été rajoutés avant l’introduction de l’enzyme. La digestion a été réalisée par ajout de 20 μL de trypsine à 2 mg/mL, préparée dans de l’AMBIC 50 mM. L’échantillon a été incubé à 37°C dans un bain thermostaté pendant 16h, avant de stopper la digestion enzymatique par un ajout de 4 μL d’AF (soit 0.5% du volume total). L’échantillon a été centrifugé à 15.000 tr/min pendant 10 min avant son dessalage sur cartouche SPE.
II.4. Dessalage sur cartouche HLB
Les échantillons ont été dessalés en utilisant des cartouches d’extraction en phase solide Oasis HLB 3cc (60 mg), selon un mécanisme de phase inverse (Waters, Milford, MA, USA). Avant de déposer l’échantillon, les cartouches ont été conditionnées avec 1 mL de MeOH puis 1 mL d’H2O, contenant chacun 0.5% d’AF. Après dépôt, les échantillons ont été lavés en utilisant 1 mL d’un mélange H2O/MeOH (95/5 , v/v) acidifié avec 0.5% d’AF, et élués avec 1 mL de MeOH contenant 0.5% d’AF. Après concentration sous flux d’azote à 37°C pendant 4h environ, les échantillons ont été repris avec 800 μL d’un mélange H2O/MeOH (95/5 , v/v) acidifié avec 0.5% d’AF avant leur injection sur le système chromatographique (soit au final une dilution d’un facteur 20 par rapport au plasma initial). Le volume d’échantillon injecté sur la plate-forme analytique est de 5 μL.
II.5. Plate-forme LC-MS/MS
Les échantillons ont été analysés à l’aide d’un système micro-LC-MS/MS, composé d’une chaîne Eksigent ExpressHT (AB Sciex, Foster City, CA, USA) couplée à un QTRAP 5500, spectromètre de masse hybride triple quadripôle/trappe ionique linéaire (AB Sciex, Foster City, CA, USA). Le contrôle de l’instrument ainsi que l’acquisition des données ont été réalisés à l’aide du logiciel Analyst 1.6.2.
100
La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne Halo C18 (0.5 mm x 100 mm, 2.9 μm), fournie par Eksigent. Les phases mobiles utilisées sont constituées de H2O+0.5% d’AF pour la phase mobile A, et ACN+0.5% d’AF pour la phase mobile B. La méthode employée utilise un gradient linéaire allant de 5% de B à 20% de B en 6 min, suivi d’une phase de lavage et d’équilibrage, menant à un temps total de 8 min d’analyse, avec un débit de phase mobile de 21 μL/min. Le spectromètre de masse a été étalonné avec une solution de polypropylène glycol avant le début des analyses selon le protocole fourni par le constructeur. La résolution des quadripôles Q1 et Q3 a été ajustée à 0.7 +/- 0.1 Th sur la largeur à mi-hauteur. L’analyse MS a été menée en mode positif, avec une tension de spray de 5000V. Le gaz de nébulisation, le gaz rideau, et le gaz auxiliaire ont été fixés à des valeurs de 17, 35 et 19 psi, respectivement. La source Turbo V utilisée avec un capillaire de spray de 50 μm de diamètre interne a opéré à 250°C.
Pour chaque peptide suivi, et chaque forme associée (oxydée ou non), 3 transitions ont été suivies, soit un total de 42 transitions. Afin de conserver un temps de résidence (dwell time, DT), l’analyse a été réalisée en mode scheduled-MRM. Le temps de cycle a été fixé à 0.5s avec une fenêtre de temps de 60s.
II.6. Traitement des données
Les résultats obtenus ont été traités par l’intermédiaire de Skyline 2.1 (MacCoss Lab, Université de Washington).
Afin d’estimer le taux d’oxydation des protéines étudiées, un ratio d’oxydation a été calculé pour chaque peptide, selon la formule suivante :