La LC-2D et le PRISM: vers une séparation plus efficace des constituants

La chromatographie bidimensionnelle (LC-2D) repose sur l’utilisation de 2 colonnes chromatographique, proposant des mécanismes de rétention complémentaires, on parle d’orthogonalité [85]. Plus l’orthogonalité est importante, plus on peut espérer obtenir une séparation efficace des constituants [86]. L’intérêt de l’utilisation de ce type de systèmes pour les phases de découverte a été démontré [87], et permet d’obtenir un plus grand nombre d’identification des protéines constituant un mélange plasmatique.

67 Figure 15. Les 2 types de chromatographie bidimensionnelle utilisés en quantification de protéines par spectrométrie de masse (document Agilent)

La méthode dite « comprehensive » a pour but de séparer un maximum la totalité du mélange, avec le moins de pertes possibles [88]. Comme indiqué sur la Figure 15, l’analyse d’un échantillon fournira une « carte » des pics chromatographique, lié au temps de sortie sur la 1^ère et la 2^ème dimension, associé à une intensité. Un composé est généralement réparti sur plusieurs fractions, et l’intégration du volume de ce pic permet de réaliser une quantification. Ce type de stratégie semble idéal pour des développements analytiques de vérification des candidats biomarqueurs, cependant il n’existe pas à l’heure actuelle d’étude attestant de son apport dans le cas d’un plasma sanguin. Par ailleurs, l’utilisation de cette stratégie implique un gradient très rapide en 2^ème dimension, qui pourra s’avérer insuffisant pour séparer certains composés et bénéficier au mieux de la double dimension. Ce type de système est de plus difficile à mettre en place, et les phénomènes de dispersion ainsi que d’effet mémoire sont compliqués à contrôler [89].

La méthode dite « heart-cutting » va elle se focaliser sur une partie précise du chromatogramme, afin de récupérer dans la fraction de collecte la totalité du composé d’intérêt. Le principal avantage de cette méthode est de bénéficier d’un gradient plus étendu sur la 2^ème dimension, et permet de plus d’obtenir une plus grande répétabilité quantitative, en raison de la collecte du composé dans une seule fraction. C’est avec cette stratégie que l’on peut espérer obtenir la plus grande diminution de l’effet matrice au sein de l’échantillon, et donc espérer obtenir les limites de quantification les plus basses. Cette stratégie a été récemment démontré par notre laboratoire pour permettre de quantifier le PSA dans du plasma humain non fractionné sur un appareil d’ancienne génération

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(QTrap 4000), avec des limites de quantification équivalentes obtenues sur un appareil plus sensible (QTrap 5500). Cependant, l’utilisation de cette méthode limite fortement les capacités de multiplexage de la méthode développée, en raison d’une perte d’une partie de l’échantillon qui ne sera pas collectée, lorsque la séparation est réalisée sur la seconde dimension. Il est possible en revanche de réaliser l’analyse de plusieurs fractions sur une seule analyse pour augmenter cette capacité multiplexe, il faudra cependant que les analytes ciblés soient relativement séparés sur la 1^ère dimension. Le principe d’une telle méthode est présenté en Figure 16 :

Figure 16. Stratégie d’analyse multiplexée utilisant la LC 2D en mode « heart-cutting »

Cette stratégie ne sera bien entendu pas applicable à n’importe quelle analyse multiplexée, en raison des fractions de l’échantillon qui sont perdues, mais elle pourrait permettre d’atteindre les limites de quantification nécessaire pour certaines protéines, dont le signal est fortement atténué en raison de l’effet matrice, voire de supprimer la présence d’interférences dans leur pic chromatographique.

Une autre stratégie a récemment été proposée par Shi et al. [90,91], dénommée PRISM, pour high-Pressure, high-Resolution separations coupled with Intelligent Selection and Multiplexing. Son principe est présenté sur la Figure 17 ci-dessous.

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Figure 17. Stratégie mise en place pour l'analyse PRISM d'un échantillon biologique, d'après Shi et al. [90]

Cette stratégie repose sur l’orthogonalité de deux systèmes chromatographique, ici 2 phases C18 utilisées alternativement avec des phases mobiles basiques ou acides. La première séparation chromatographique, réalisée à l’aide d’une analyse longue (100 min ici) permet de fortement fractionner l’échantillon, dopé à l’aide d’étalons lourds (cf section II.6.2), en collectant l’éluat dans un différents puits toutes les minutes (A). La différence avec une stratégie SCX classique réside dans le fait qu’une petite partie de l’éluat (environ 10%) est continuellement analysée par un spectromètre de masse, permettant de déterminer dans quel puit est présent l’analyte ciblé d’après le temps de rétention observé lors de la première analyse. Une fois le puit ciblé, son contenu est analysé par un deuxième montage chromatographique pour réaliser une quantification (B). L’avantage de cette méthode est de permettre d’obtenir des échantillons grandement simplifiés, permettant d’abaisser l’effet matrice et par conséquent les limites de quantification, ainsi que de permettre de déterminer dans quel fraction se trouve l’analyte sans avoir besoin d’analyser la totalité de la plaque 96-puits. Les auteurs ont ainsi pu réaliser la quantification de PSA dans du sérum à des concentrations de l’ordre de 10 ng/mL, avec des résultats comparables à ceux obtenus avec un test ELISA. Cependant, cette stratégie souffre des mêmes inconvénients que le fractionnement SCX dans une optique de multiplexage important. Même si il est en effet possible de multiplexer légèrement la méthode en mixant plusieurs puits avant l’analyse, en mélanger un trop grand nombre ferait drastiquement remonter l’effet matrice de l’échantillon, rendant inutile la stratégie alors développée. En plus de

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cela, des dires mêmes des auteurs, cette méthode possède un débit analytique relativement limité, notamment en raison du gradient long nécessaire en début de méthode.

Le dernier maillon du schéma analytique concerne le spectromètre de masse en lui-même, dont les performances vont être importantes notamment en termes de spécificité, pour dépasser la complexité de la matrice plasmatique utilisée.