Etude bibliographique
Equation 3. Calcul de la concentration d'un analyte à partir de sa droite de calibration
ܥ݊ܿ݁݊ݐݎܽݐ݈݅݊݀݁ᇱ݈ܽ݊ܽݕݐ݁ሺ݁݊Ɋ ݃ ݉ܮΤ ሻ ൌ ݎ±݊ݏ݁ െ ͳͳͷͷǤʹ ͻͷͶͻ
Cette matrice blanche est le principal problème de cette méthode, dans le cas des échantillons biologiques elle est très difficile à obtenir, du fait de la présence de protéines endogènes. Pour certaines protéines spécifiques aux échantillons urinaires, il est possible de « simuler » une matrice blanche en préparant de l’urine synthétique, un mélange de sels et de plasma dilué pour atteindre une matrice de charge protéique proche de celle de l’urine. Cependant le cas de protéines se retrouvant uniquement dans l’urine est rare, et la plupart des protéines plasmatiques se retrouvent dans celle-ci. Il est également possible, lorsque des protéines liées au sexe du patient par exemple
y = 97549x + 1155,2 R² = 0,9999 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Réponse en uni tés arbi trai res Concentration du peptide (μg/mL)
87 sont ciblées, comme c’est le cas pour le PSA, propre à l’homme, d’utiliser une matrice plasmatique de femme pour réaliser un étalonnage externe. Il a été démontré qu’en réalisant une gamme de PSA dans du sérum de femme, et en mesurant l’aire d’un peptide rapporteur de cette protéine, il était possible de remonter à la concentration de cette protéine dans du sérum d’homme, et ce avec une très bonne corrélation avec les résultats obtenus par ELISA (R²=0.96) [49]. Cet exemple démontre que ce type de quantification est possible sur des échantillons biologiques, même si c’est un cas rare. Il est également possible d’utiliser des matrices proches de celle étudiée, provenant d’organismes différents pour estimer les quantités de protéines endogènes. En utilisant du plasma de rat par exemple, pour lequel les séquences protéiques et donc peptidiques diffèrent grandement de celle de l’humain, on peut réaliser une gamme de linéarité en ajoutant un peptide synthétique en quantité croissante. Même si ce n’est pas le cas idéal, l’effet matrice est relativement proche, et la réponse observée s’approche alors de celle obtenue dans le cas d’un plasma humain [123]. Cependant il s’agit plus d’une estimation de la concentration que d’une quantification précise, et les problèmes liés à la dérive de l’instrument sont toujours présents. C’est pourquoi l’étalonnage interne est essentiellement pratiqué.
b) Etalonnage interne
Dans cette méthode, un composé différent de l’analyte, sous forme de protéine ou de peptide rapporteur, mais possédant des caractéristiques physico-chimiques (masse, hydrophobicité, pKa..) très proches de celui-ci, est ajouté en quantité connue dans l’échantillon. Le but est de corriger un maximum de variations, liées à la préparation d’échantillon ou à l’analyse, en calculant le rapport des réponses de l’analyte et de son étalon. La plupart du temps, l’étalon correspond à l’analyte, modifié à l’aide d’isotopes lourds comme le carbone 13 ou l’azote 15. Avec les résolutions unitaires des quadripôles, il est possible de séparer 2 composés dont la masse diffère de 0.35 au minimum sur l’ion précurseur, et de 0.5 au minimum sur l’ion fragment. L’incrément de masse apporté par les étalons marqués, généralement de +6 Da, est suffisant pour distinguer l’analyte de son étalon sur un quadripôle, et ce pour les différents états de charge de l’ion précurseur (voir Figure 28).
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Figure 28. Séparation en masse du peptide de PSA et de son étalon marqué avec +6 Da pour les différents états de charge de l'ion précurseur.
Cela permet de construire un chromatogramme reconstruit par espèce, et de calculer l’aire sous le pic chromatographique pour chacun des composés.
L’étalon lourd étant ajouté en quantité croissante dans l’échantillon, et possédant le même facteur de réponse que l’analyte du fait de ses propriétés physico-chimiques identiques, un simple produit en croix suffit à remonter à la concentration du peptide endogène comme indiqué dans l’Equation 4 :
Equation 4. Calcul de la concentration d'un analyte d'après la réponse de son étalon marqué. ܥ݊ܿ݁݊ݐݎܽݐ݈݅݊݀݁ᇱ݈ܽ݊ܽݕݐ݁݁݊݀݃°݊݁ ൌ ܥ݊ܿ݁݊ݐݎܽݐ݈݅݊݀݁ᇱ±ݐ݈ܽ݊ ൈݎ±݊ݏ݈݁݀݁Ԣ݈ܽ݊ܽݕݐ݁
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Pour la quantification de protéines par spectrométrie de masse, trois approches ont été développées, chacune possédant ses avantages et inconvénients : PSAQ, QCAT et AQUA.
PSAQ (Protein Standard Absolute Quantification)
Pour prendre en compte les problèmes liés aux étapes de pré-digestion, et avoir une estimation du rendement de digestion d’une protéine, la méthode baptisé PSAQ a été proposée par Brun et al [124] en 2007. Dans la stratégie développée ici, l’étalon interne est une protéine recombinante, dont la séquence correspond à celle de la protéine ciblée, mais synthétisée à l’aide d’acides aminés marqués à l’aide d’isotopes stables. Elle est ajoutée en début de préparation d’échantillon en quantité connue, et va donc corriger la totalité des biais qui peuvent survenir, mais également fournir une
89 information sur le rendement de digestion. Ce type de quantification absolue est cependant assez rarement utilisé aujourd’hui, du fait de la difficulté à synthétiser des protéines entières marquées, qui soit à la fois purifiées et solubles, ainsi que du coût associé à l’utilisation de ces standards lors d’études à large échelle.
QCAT (Quantification ConCATamer)
Cette méthode consiste à concaténer différents peptides marqués par des isotopes stables (peptides AQUA) et à produire ainsi la protéine chimérique lourde [125].
Cet étalon est ajouté avant l’étape de digestion des protéines (éventuellement avant même l’étape de dénaturation) ce qui permet de corriger les pertes de protéines lors de ces manipulations. Avec cette stratégie, il est possible d’utiliser un standard qui fournit directement la totalité des peptides AQUA nécessaires à l’étude, en faisant un seul ajout de protéine standard. Il faudra cependant se méfier du fait que le rendement de digestion d’une protéine dépend de la structure et de la conformation de celle-ci, et qu’il faudra alors que celui lié à la digestion de la protéine chimérique soit proche des 100% pour éviter tout biais analytique. De plus, le rendement de digestion de la protéine endogène ne peut alors pas être corrigé par cet étalon, du fait de la différence de structure et de conformation.
AQUA (Absolute QUAntification)
La méthode AQUA a été introduite par le groupe de Gygi en 2003 [126]. Pour obtenir un étalon qui a rigoureusement les mêmes propriétés physico-chimiques qu’un peptide endogène, la synthèse de cet étalon est réalisée à l’aide d’acides aminés marqués avec des isotopes lourds comme 13C ou 15N. Il possède le même temps de rétention que le peptide endogène, s’ionise de la même façon, et par conséquent possède le même facteur de réponse, va être soumis de manière identique à l’adsorption que le peptide ciblé. La plupart du temps, il est ajouté directement après la digestion enzymatique, bien que van der Broek et al aient récemment démontré l’intérêt de l’ajouter avec l’introduction de la trypsine pour limiter les variations [127] tels que l’agrégation de peptides ou les clivages non trypsiques liés à des enzymes endogènes [128]. L’étalon marqué va alors corriger tous les biais de l’analyse en aval de la digestion enzymatique, mais pas ceux situés en amont (perte lors du stockage de l’échantillon, déplétion des protéines majoritaires, etc..). Il ne corrigera pas non plus le rendement de digestion, à la différence de la stratégie PSAQ développée précédemment : il sera alors nécessaire d’optimiser au mieux le signal final, dans le but d’avoir un rendement supposé de digestion proche des 100%.
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C’est la technique de quantification la plus utilisée actuellement pour la quantification absolue de protéines, en raison de la facilité à synthétiser les peptides lourds et du coût raisonnable de la synthèse.
Quoiqu’il en soit, peu importe la méthode de quantification choisie, l’analyse développée doit répondre à un certain nombre de critère pour être considérée comme valide d’un point de vue quantitatif.
II.6.3. Validation de la méthode quantitative : les recommandations de la FDA
Afin de s’assurer qu’une méthode développée peut être utilisée dans une optique quantitative, il est nécessaire de s’assurer que celle-ci fourni toujours les mêmes résultats lorsqu’elle est appliquée plusieurs fois sur un même échantillon. Il est également nécessaire que les résultats obtenus soient proches de la concentration réelle au sein de l’échantillon. Ainsi, un certain nombre de critères ont été définis par la FDA (Food and Drug Administration) américaine pour valider une méthode quantitative, à l’issu de workshops. Les paramètres détaillés ici peuvent être trouvé sur le document Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation (2013) [129].Afin de déterminer la concentration d’un analyte dans l’échantillon, il est nécessaire de construire une droite de calibration dans la matrice pour cet analyte. Elle est réalisée en plaçant des quantités croissantes de l’espèce ciblée dans une matrice blanche, et en analysant les différents échantillons constitués. Une droite de calibration comporte entre 6 et 8 points de concentration, répartis autour de la concentration endogène estimée de l’analyte, et faisant apparaître la LOQ. La LOQ peut être définie de 2 manières :
- Plus petite concentration pour laquelle le signal observé est 5 fois supérieur à celui observé dans un blanc (soit un rapport S/B=10)
- Plus petite concentration pour laquelle le coefficient de variation (CV) est inférieur à 20% et la valeur déterminée ne dérive pas de plus de 20% de la valeur réelle
La seconde définition est la plus utilisée dans les manipulations effectuées dans ce travail de thèse, en raison de la meilleure estimation « numérique » qu’elle propose. Chacun des paramètres qui la compose peut être défini pour le développement d’une méthode quantitative.
Le premier paramètre à prendre en compte est la répétabilité de la méthode. Il est nécessaire que celle-ci permette de toujours retomber sur les mêmes résultats. Cette répétabilité est estimée par l’intermédiaire du calcul des coefficients de variation (CV). Il est ainsi recommandé, que sur un
91 minimum de 5 réplicas, que la valeur de CV observée sur le résultat soit inférieure à 15%. Pour la valeur de concentration correspondant à la LOQ, cette valeur est tolérée jusqu’à 20%.
Le second paramètre est l’exactitude de la méthode. Il est nécessaire de s’assurer celle-ci permette de retrouver une concentration de l’analyte relativement proche de celle réellement présente dans l’échantillon. L’estimation de ce paramètre est faite en utilisant un échantillon dont la valeur réelle de concentration de l’analyte est connue (ajout de l’étalon dans une matrice blanche par exemple), et en la comparant à la valeur de concentration déterminée à l’aide de la méthode développée. Cette stratégie doit être répétée pour la totalité des points de gamme utilisés pour construire la droite de calibration, en utilisant 5 déterminations par point de concentration. La méthode sera validée du point de vue de l’exactitude si l’écart entre la valeur réelle et la valeur déterminée est en moyenne inférieure à 15%, et est toléré jusqu’à 20% pour le point de concentration correspondant à la LOQ.
Les paramètres décrits ci-dessus sont cependant ceux qui ont été définis par la FDA pour l’étude de drogues et médicaments dans les fluides biologiques. En effet, à l’heure actuelle il n’existe pas de réel consensus sur la quantification de protéines dans ces mêmes fluides, en tant que marqueurs biologiques. On tend cependant à y parvenir, comme le montre le Tableau 1, résultant d’une concertation d’un certain nombre d’experts du domaine de la quantification protéines par LC-MS/MS. Ainsi, en l’absence de réels critères de validation pour ce type d’études, il est courant de se baser sur ceux définis pour l’étude de drogues et de médicaments. Pour ces raisons, le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s’est basé en grande partie sur les critères définis dans cette section.
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