pour l’analyse de protéines sanguines
III.1. Evaluation des performances quantitatives des cartes DBS et membranes Vivid Vivid
La sensibilité importante des spectromètres de masse permet de détecter et quantifier des protéines au sein de mélanges complexes, avec des quantités très faibles d’échantillon, inférieur au microlitre injecté (voir Chapitre 5). Cette sensibilité importante est nécessaire à l’utilisation de cartes de collecte DBS et de membranes Vivid, en raison de la faible quantité d’échantillon déposée sur ces supports. Une goutte de sang de volume raisonnable possède un volume de 10 à 20 μL, le plasma la constituant représentant environ 50% de ce volume [161]. Il devient alors indispensable de maîtriser la quantité de protéines récupérées, puisque la moindre variation va alors impacter profondément les résultats observés.
Pour l’étude menée ici, il est important de s’assurer que la quantité de protéines récupérée après dépôt est toujours identique. Comme présenté plus loin dans les Chapitres 6 et 7, les protéines peuvent avoir des comportements très différents en raison de leurs caractéristiques hétérogènes, et il ne semblerait pas étonnant que le comportement d’adsorption sur les supports considérés diffère également. L’utilisation de standards peut permettre de déterminer avec précision ce que l’on nommera le rendement d’extraction, en utilisant des protéines standards, à la manière de ce qui se fait sur cartouche SPE en utilisant des peptides marqués. Cependant, maîtriser ce rendement d’extraction ne sera possible que si la manipulation s’avère suffisamment répétable, c’est-à-dire qu’elle affiche une variation limitée lors d’un certain nombre de réplicas (CVs < 15%, Chapitre 1, section II.6.3.).
Dans un premier temps, les dispositifs ont été évalués à partir de plasma humain, matrice plus stable et légèrement moins complexe que le sang total soumis à l’éclatement des hématies lors de cycles de congélation/décongélation, qui sera déposé par la suite. Cette matrice permettra dans un premier temps d’évaluer les performances des dispositifs étudiés, en termes de rendement de récupération et de répétabilité pour les protéines analysées. Afin d’évaluer la répétabilité du processus d’extraction, une comparaison a été réalisée entre :
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- 5 échantillons placés en solution, non soumis au dépôt et extraction sur support - 5 échantillons déposés sur cartes DBS
- 5 échantillons déposés sur membrane Vivid
Les échantillons sans extraction ont été préparés en ajoutant 10 μL de plasma humain à 990 μL du solvant d’extraction décrit dans la partie Matériel et méthodes. Pour les extractions, 10 μL de plasma humain ont été déposés au centre d’un spot DBS, ou à l’extrémité d’une membrane Vivid. Les protéines ont été ensuite extraites du support selon la procédure décrite précédemment. La suite du protocole (digestion, SPE..) a été commune pour les 15 échantillons préparés. Après analyse par la plate-forme LC-MS/MS, l’aire moyenne pour chaque peptide a été calculée, ainsi que les coefficients de variation associés. Le rendement moyen de chaque extraction a ensuite été estimé en calculant le rapport (aire moyenne sur support / aire moyenne sans extraction). La matrice étant strictement identique, ainsi que la totalité du protocole de préparation hors extraction, on peut faire l’approximation que ce rapport est assez proche du rendement d’extraction de chaque protéine.
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Tableau 14. Evaluation des performances analytiques pour les 2 supports d'extraction considérés.
Rendements (aire échantillon / aire référence)
Sans extraction (N=5) Extraction DBS (N=5) Extraction Vivid (N=5) Protéine CV Moyenne CV Moyenne CV P01008|ANT3_HUMAN 9.9% 136% 5.5% 125% 6.8% P02652|APOA2_HUMAN 5.9% 130% 3.9% 123% 3.2% P00738|HPT_HUMAN 11.1% 85% 8.0% 92% 8.1% P02765|FETUA_HUMAN 9.8% 94% 7.0% 87% 6.3% P08697|A2AP_HUMAN 6.5% 58% 6.8% 65% 5.2% P18428|LBP_HUMAN 10.8% 53% 8.6% 49% 6.2% P25311|ZA2G_HUMAN 13.5% 97% 7.1% 87% 12.4% P00742|FA10_HUMAN 9.2% 62% 4.9% 73% 6.6% P04196|HRG_HUMAN 9.6% 94% 8.7% 89% 8.3% P01024|CO3_HUMAN 6.5% 65% 4.1% 72% 4.2% P01009|A1AT_HUMAN 5.1% 118% 4.8% 98% 6.7% P05546|HEP2_HUMAN 6.6% 84% 5.7% 94% 6.1% P02649|APOE_HUMAN 6.2% 66% 6.2% 55% 11.3% P02774|VTDB_HUMAN 6.4% 115% 4.7% 99% 2.8% P00736|C1R_HUMAN 8.8% 73% 6.4% 82% 9.6% P19827|ITIH1_HUMAN 9.4% 79% 5.5% 85% 7.3% P02787|TRFE_HUMAN 6.2% 103% 4.9% 110% 4.6% P27169|PON1_HUMAN 6.7% 82% 6.2% 94% 5.9% P01019|ANGT_HUMAN 9.3% 74% 6.2% 60% 7.5% P10909|CLUS_HUMAN 11.8% 88% 8.8% 75% 9.4% O14791|APOL1_HUMAN 8.7% 69% 7.8% 72% 9.7% P02790|HEMO_HUMAN 9.7% 93% 7.1% 106% 7.7% P04114|APOB_HUMAN 9.8% 23% 6.5% 17% 6.8% P01011|AACT_HUMAN 11.2% 70% 5.0% 77% 6.4% P02743|SAMP_HUMAN 17.8% 72% 8.9% 54% 9.4% P0C0L5|CO4B_HUMAN 11.5% 74% 6.8% 88% 7.1% P43652|AFAM_HUMAN 12.8% 94% 7.0% 112% 7.1% P02768|ALBU_HUMAN 2.3% 105% 1.9% 112% 2.0% P00747|PLMN_HUMAN 7.3% 63% 5.3% 55% 8.4% P00751|CFAB_HUMAN 6.0% 80% 4.0% 82% 6.8% P02656|APOC3_HUMAN 10.2% 138% 6.9% 149% 8.0% P02647|APOA1_HUMAN 14.7% 119% 8.1% 109% 5.7%
Le Tableau 14 présente les résultats obtenus en termes de rendement d’extraction, et de répétabilité sur l’aire observée.
Comme on peut le constater, le fait d’ajouter une étape d’extraction par l’intermédiaire des cartes DBS ou des membranes Vivid génère une perte de la quantité de protéines obtenu, le signal obtenu au final étant plus faible que dans l’échantillon de référence (rendement inférieur à 100%). Cependant, avec des rendements supérieurs à 70% de façon générale, ils peuvent être considérés relativement corrects. Quelques valeurs sont cependant plus étonnantes, puisque présentant des rendements bien supérieurs à 100%, comme c’est le cas pour l’antithrombin-III (ANT3_HUMAN) ou l’apolipoprotein A-II (APOA2_HUMAN). Comme il sera développé dans le Chapitre 7, le signal obtenu
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pour une protéine après digestion peut dépendre fortement de l’efficacité avec laquelle elle a été dénaturée. Il est possible qu’ici l’interaction avec le support, et la mise en contact avec le solvant organique, permette d’exposer davantage les sites de digestion par la suite, fournissant alors un rendement de digestion accru. On pourrait également avancer une autre hypothèse, lié à la capacité du support à retenir des composés malgré l’extraction réalisée. Si ce phénomène se produit, il est possible que l’effet matrice se retrouve réduit et le signal des peptides suivis se retrouve amplifié.
On peut également constater que le protocole d’extraction développé ici permet d’obtenir une très bonne répétabilité, puisqu’on peut observer des CVs inférieurs à 10% sur carte DBS ou membrane Vivid. Malgré une récupération des protéines déposée qui semble alors incomplète, la faible variation observée permettra de remonter efficacement à la quantité de protéine totale, à condition de connaître le rendement d’extraction pour la protéine considérée.
Même si la répétabilité semble bonne dans l’étude menée ici, un problème reste cependant à considérer : la quantité de protéines déposées sur le support. Ici, 10 μL ont été déposés à chaque fois, mesurés de façon précise à l’aide d’une pipette. On est alors certain que la même quantité de protéines a été placée sur le support. En pratique, cela s’avère beaucoup plus difficile, puisque le volume de la goutte de sang prélevée au bout du doigt ne sera pas maîtrisé avec précision. Même si la totalité du spot DBS ou de la bande Vivid ont été utilisés ici, l’échantillon est généralement prélevé sur un punch de 3mm de diamètre, en utilisant un puncher. Il semblait nécessaire de contrôler que cette procédure permettait bien de prélever la même quantité de matrice à chaque punch.