Quantification de biomarqueurs protéiques dans des matrices biologiques complexes par spectrométrie de masse : développements et applications

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Quantification de biomarqueurs protéiques dans des

matrices biologiques complexes par spectrométrie de

masse : développements et applications

Jérémy Jeudy

To cite this version:

Jérémy Jeudy. Quantification de biomarqueurs protéiques dans des matrices biologiques complexes par spectrométrie de masse : développements et applications. Chimie analytique. Université Claude Bernard - Lyon I, 2014. Français. �NNT : 2014LYO10242�. �tel-01128206�

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N° d’ordre 242 - 2014 Année 2014

THESE DE L’UNIVERSITE DE LYON Délivrée par

L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

ECOLE DOCTORALE DE CHIMIE DIPLOME DE DOCTORAT

Soutenue publiquement le 17 Novembre 2014 Par

M. Jérémy JEUDY

Quantification de biomarqueurs protéiques dans des matrices

biologiques complexes par spectrométrie de masse :

développements et applications

Composition du jury

Mr. Arnaud SALVADOR Directeur de thèse

Mr. Jérôme LEMOINE Co-encadrant de thèse

Mr. Serge RUDAZ Rapporteur

Mr. Jean ARMENGAUD Rapporteur

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RESUME en français

Depuis les 10 dernières années, l’intérêt pour l’utilisation des biomarqueurs dans des études cliniques a grandement augmenté. La quantification des candidats biomarqueurs protéiques dans les échantillons complexes (comme par exemple le plasma) nécessite des analyses ciblées et multiplexées. Les méthodes immuno-enzymatiques représentent actuellement le standard pour leur quantification. Cependant, devant la nécessité d’obtenir des méthodes ciblées et multiplexées, les développements récents réalisés en spectrométrie de masse (MS) en font une alternative viable aux tests ELISA. Le travail présenté ici s’est penché sur les problèmes rencontrés sur ce type d’études protéomiques, et sur les solutions qui peuvent être explorées pour améliorer le débit d’évaluation des candidats biomarqueurs.

Les peptides à méthionine sont généralement évités en raison de leur sensibilité à l’oxydation. Cependant, il semblait intéressant d’étudier leur modification endogène pouvant affecter les processus biologiques. Une première évaluation de l’impact de l’oxydation des apolipoproteins dans le cas de la maladie d’Alzheimer, a permis de mettre de côté ce biomarqueur potentiel, et de faire apparaître un certain nombre de problèmes liés au prélèvement et au stockage des échantillons biologiques. L’évaluation de dispositifs DBS (Dried Blood Spot) et Vivid à partir d’un panel de 32 protéines sanguines a permis de fournir une première solution envisageable pour maîtriser ces problèmes.

Par la suite, un nouveau mode de quantification des peptides appelé MRM3 a été utilisé pour dépasser la complexité de la matrice biologique, et fournir une évaluation fiable des niveaux de concentration de 2 protéines plasmatiques, la C-Reactive protein et la TIMP-1, ainsi que 2 protéines urinaires, l’aquaporin-2 et la podocin. Pour améliorer la sensibilité d’analyse et réduire les coûts de solvants nécessaires aux analyses, l’évaluation d’une plate-forme de micro-chromatographie a été réalisée par comparaison à une plate-forme narrow-bore. Cette étude a permis de mettre en évidence l’impact important de l’effet matrice sur le processus analytique, nécessitant de développer de nouvelles stratégies de travail.

Enfin, afin de réduire la complexité de l’échantillon, l’évaluation de cartouches d’extraction en phase solide à base de large taille de pores a été réalisé, et un protocole développé a permis d’analyser avec succès des enzymes contenus dans un échantillon de lessive commerciale. De plus, la durée nécessaire à la préparation d’échantillons biologiques a pu être fortement réduite en combinant une digestion rapide assistée par température combinée au dessalage en ligne, afin de permettre l’analyse quantitative des protéines qu’il contient seulement quelques heures après son arrivée au laboratoire.

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TITRE en anglais

Quantification of protein biomarkers in complex biological fluids by mass spectrometry: developments and applications

RESUME en anglais

Over the past decade, interest in the use of biomarkers in clinical studies has greatly increased. Quantification of a candidate protein biomarker in complex samples (eg. plasma) requires targeted and multiplexed assays. Immunoassays are the gold standard for their quantification. However, with the need for targeted and multiplexed methods, recent developments in mass spectrometry (MS) make a viable alternative to ELISA. The present work has addressed the problems encountered in this type of proteomic studies, and solutions that can be explored to improve the workflow of candidate biomarker’s evaluation.

Methionine peptides are generally avoided due to their susceptibility to oxidation. However, it seemed interesting to study how their endogenous modifications could affect biological processes.

In a first time, apolipoproteins were dismissed as a potential biomarker of Alzheimer’s disease due to oxidation impact. In the same time, problems associated with biological sample collection and storage were highlighted. DBS (Dried Blood Spot) and Vivid device evaluation from a panel of 32 blood proteins has provided a first possible solution to overcome these troubles.

Thereafter, a new peptide quantification method called MRM3_{was used to overcome biological matrix} complexity. Reliable level determinations of 2 plasma proteins (C-Reactive protein and TIMP-1) and 2 urinary proteins (aquaporin-2 and podocin) were obtained. To improve sensitivity and reduce analysis solvent costs, performances of a micro chromatography platform were compared to a narrow-bore platform. This study highlighted the significant impact of the matrix effect on the analytical process, requiring new strategie development.

Finally, to reduce sample complexity, evaluation of wide pore solid-phase extraction cartridges has been achieved. A protocol was successfully developed to analyze enzymes contained in commercial laundry samples. Finally to optimize biological sample preparation time, heated-assisted digestion and online desalting step were successfully associated. Only few hours were then required for quantitative analysis.

DISCIPLINES : Chimie, biologie.

MOTS-CLES : Biomarqueurs protéiques, quantification, spectrométrie de masse, chromatographie liquide

INTITULE ET ADRESSE DE L’U.F.R. OU DU LABORATOIRE :

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UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1

Président de l’Université M. François-Noël GILLY

Vice-président du Conseil d’Administration M. le Professeur Hamda BEN HADID

Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire

M. le Professeur Philippe LALLE

Vice-président du Conseil Scientifique M. le Professeur Germain GILLET

Directeur Général des Services M. Alain HELLEU

COMPOSANTES SANTE

Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard Directeur : M. le Professeur J. ETIENNE

Faculté de Médecine et de Maïeutique Lyon Sud – Charles Mérieux

Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON

Faculté d’Odontologie Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS

Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Directeur : Mme la Professeure C. VINCIGUERRA

Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation Directeur : M. le Professeur Y. MATILLON

Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine

Directeur : Mme. la Professeure A-M. SCHOTT

COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE

Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. F. DE MARCHI

Département Biologie Directeur : M. le Professeur F. FLEURY

Département Chimie Biochimie Directeur : Mme Caroline FELIX

Département GEP Directeur : M. Hassan HAMMOURI

Département Informatique Directeur : M. le Professeur S. AKKOUCHE

Département Mathématiques Directeur : M. Georges TOMANOV

Département Mécanique Directeur : M. le Professeur H. BEN HADID

Département Physique Directeur : M. Jean-Claude PLENET

UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives Directeur : M. Y.VANPOULLE

Observatoire des Sciences de l’Univers de Lyon Directeur : M. B. GUIDERDONI

Polytech Lyon Directeur : M. P. FOURNIER

Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique Directeur : M. G. PIGNAULT

Institut Universitaire de Technologie de Lyon 1 Directeur : M. C. VITON

Ecole Supérieure du Professorat et de l’Education Directeur : M. A. MOUGNIOTTE

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Remerciements

La route est longue vers le titre de Docteur, et cette page est l’occasion de remercier de nombreuses personnes que j’ai pu croiser sur mon chemin, qui m’ont permis de m’épanouir tant professionnellement que personnellement. Merci à eux.

La première personne à remercier serait probablement le Professeur Patrick Fauconnier de l’Université de Marne La Vallée. Savoir que l’on veut avancer dans le domaine de la Chimie est une chose, savoir dans quelle direction aller en est une autre. Il a su me donner goût à la Chimie Analytique et m’orienter dans cette voie, sans lui ce manuscrit n’existerait probablement pas.

Un grand merci également à mon directeur de thèse, Arnaud Salvador, ainsi qu’à mon co-encadrant de thèse, Jérôme Lemoine. Ils ont su à leur tour grâce à leurs enseignements et leur passion pour leur thématique, me transmettre le virus (contagieux) de la spectrométrie de masse et me donner envie de me lancer à fond dedans. Leurs conseils et leur patience ont toujours été des moteurs puissants pour faire avancer mes travaux, et ne rien lâcher avant d’en voir le bout. Merci pour toutes les discussions enrichissantes que l’on a pu avoir, ainsi que pour m’avoir permis de rencontrer de nombreuses personnes de cette communauté.

Je continuerai en remerciant Romain « tonton » Simon, qui malgré le boulot qu’il pouvait avoir, a toujours pris le temps de m’expliquer les choses et de me filer un coup de main. Je n’aurai certainement pas le niveau d’expertise MS que j’ai atteint aujourd’hui sans ses conseils.

Un grand merci également à Cathy, sans qui le labo ne tournerait probablement pas aussi bien. Sa gentillesse et sa patience ont été un véritable bonheur durant ces « presque » 4 ans passés dans l’équipe (même si il faut s’en méfier un peu -), et c’est en très grande partie grâce à elle que cette thèse a été si agréable.

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Merci à ma collègue Marion, qui outre ses conseils, a également pris beaucoup de temps pour relire mes proses pourtant parfaites ( -), et mettre le doigt sur ce qui n’allait pas. C’est en partie grâce à son aide que ce manuscrit veut dire quelque chose.

Cette thèse a été l’occasion de croiser de très nombreuses personnes, sans qui tout le travail mené n’aurait pas été si agréable. Merci tout d’abord à Quentin, qui si il ne se nommait pas déjà « Docteur », aurait certainement pu faire une percée fulgurante dans The Voice. Il se serait surement fait buzzer par Amélie d’ailleurs, grande fan de ses chants. Merci à Aurore, qui même si elle est passée à la concurrence, se rattrape grâce à notre passion commune de la photo. Merci à Alexandra, grande fan de Sébastien Patoche, qui a toujours su rester de bonne humeur face aux problèmes de chercheurs qu’on a pu avoir (ps : merci aussi pour la relecture assidue !). Merci à Blanblan, même si elle passe son temps à jeter des gros microbes et à grogner, on l’aime bien quand même et sa bonne humeur constante rattrape le coup. Merci à Romain (C.), parceque ça fait du bien de pas être tout à fait le seul Parisien du labo, alors quant en plus on se marre bien avec et qu’il a un don inné pour le déguisement, c’est bonheur, et on oublierai presque que c’est un éternel stagiaire. Merci également à Jordane pour les bons moments passés en sa compagnie, on lui pardonnerait presque de pas penser comme une chimiste ( -). Etant donné que j’arrive à me fatiguer tout seul, j’imagine ce que ça a dû être pour eux de supporter les blagues pas drôle d’un collègue comme moi pendant tout ce temps, ce qui rajoute encore à leur mérite-.

Un grand merci également à Claire Bordes et Yohann Clément pour leur aide précieuse dans le traitement et l’interprétation des données qui ont été récoltées tout au long des expériences réalisées, ainsi que pour avoir eu la patience de m’expliquer et me ré-expliquer des concepts qui refusaient (et refusent encore) de se loger dans ma tête.

La liste de personnes croisées au laboratoire et avec qui j’ai pu passer de très bons moments est encore longue, et j’en oublie certainement : Luke, Fabien, Sébastien, Céline, Leny, Doriane, Aurore, Jessica, Béatrice…

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3 D’un point de vue plus personnel, il me reste encore plusieurs personnes à remercier.

Tout d’abord Anne-Florine, qui a eu la patience de me supporter pendant cette thèse, en plus d’avoir la patience de vivre avec moi. Elle a toujours été un soutien indéfectible pendant les hauts et les bas, et a contribué pour beaucoup dans le fait de me permettre de vous livrer le pavé que vous avez entre les mains.

Enfin, un grand merci à mes parents. Peu importe la voie que je choisissais, ils m’ont toujours soutenu sans se poser de questions. C’est grâce à eux que j’ai pu faire les études que je souhaitais, et que je peux mener la vie que je mène aujourd’hui. Je ne pourrai jamais assez les remercier pour cela.

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Abréviations

AMBIC Ammonium BICarbonate AQUA Absolute QUAntification

BDD Base de données

CE Collisional Energy CV Coefficient de Variation

CUR CURtain Gas

DBS Dried Blood Spot DP Declustering Potential

DT Dwell Time

DTT Dithiotreitol

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EFS Etablissement Français du Sang ESI ElectroSpray Ionization

FDA Food and Drug Administration

IAM IodoAcetaMide

IS IonSpray voltage

iTRAQ isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation InVS Institut National de Veille Sanitaire

LID Laser Induced Dissociation LOQ Limit Of Quantification m-NBA Alcool Méta-NitroBenzylique

mg Milligramme

mL Millilitre

MRM Multiple Reaction Monitoring

MS Mass Spectrometer

ng Nanogramme

NIH National Institute of Health

mTRAQ non-isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation pg Picogramme

PSA Prostate Specific Antigen

PSAQ Protein Standard Absolute Quantification

PRISM high-Pressure, high-Resolution separations coupled with Intelligent Selection and Multiplexing

QCAT Quantification ConCATamer QqQ Triple quadripôle

S/B Signal sur Bruit SIM Single Ion Monitoring

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TEM TEMperature

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Table des matières

Remerciements ... 1

Abréviations ... 5

Table des matières ... 7

Liste des figures ... 15

Liste des tableaux ... 23

Liste des équations ... 25

Introduction générale ... 27

Chapitre 1 : Etude bibliographique ... 31

I. Les biomarqueurs protéiques : un long processus de validation ... 33

I.1. L’étude des biomarqueurs protéiques ... 33

I.2. Problèmes liés à l’utilisation de la matrice biologique ... 35

I.2.1. La complexité de la matrice biologique... 35

I.2.2. La variation inter-individus ... 37

I.2.3. La gestion des échantillons biologiques ... 39

I.3. Le processus de validation des biomarqueurs protéiques : quelle optique pour la quantification ? ... 40

II. Quantification de protéines par couplage LC-MS/MS ... 45

II.1. Le processus d’analyse de protéines par spectrométrie de masse ... 46

II.2. Stratégies de quantification de protéines en matrice plasmatique ... 48

II.3. La préparation de l’échantillon pour l’analyse ... 53

II.3.1. La digestion enzymatique ... 53

II.3.2. Utilisation de stratégies de simplification de l’échantillon ... 55

II.3.3. Dessalage et concentration des échantillons avant l’injection ... 58

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II.4.1. L’effet matrice ... 60

II.4.2. Le rendement d’ionisation de la source électrospray ... 62

II.4.3. La taille du système ... 64

II.4.4. La LC-2D et le PRISM: vers une séparation plus efficace des constituants ... 66

II.5. Ciblage par spectrométrie de masse ... 70

II.5.1. Instrumentation et stratégies utilisés pour l’analyse quantitative ... 70

II.5.2. Sélection du peptide cible pour le développement de la méthode ... 74

II.5.3. Optimisation des paramètres pour la quantification du peptide ... 77

II.5.4. Le choix des transitions utilisées pour la quantification ... 80

II.6. Stratégies de quantification par spectrométrie de masse ... 83

II.6.1. La quantification relative ... 84

II.6.2. La quantification absolue ... 85

II.6.3. Validation de la méthode quantitative : les recommandations de la FDA ... 90

Chapitre 2 : Analyse de modification post-traductionnelle : évaluation de l’oxydation des méthionines dans le cas de la maladie d’Alzheimer ... 93

I. Introduction ... 95

II. Matériel et méthodes ... 97

II.1. Réactifs et échantillons utilisés ... 97

II.2. Optimisation des paramètres MS/MS pour les peptides suivis ... 97

II.3. Digestion enzymatique des échantillons humains ... 99

II.4. Dessalage sur cartouche HLB ... 99

II.5. Plate-forme LC-MS/MS ... 99

II.6. Traitement des données ... 100

III. Résultats et discussion ... 102

III.1. Quantification de peptides à méthionine par spectrométrie de masse ... 102

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III.3. Influence des cycles de congélation / décongélation et impact d’antioxydants ... 106

III.4. Application du protocole développé à l’étude de la maladie d’Alzheimer ... 109

III.4.1. Cohorte exploratoire : analyse des échantillons de l’Institut Pasteur de Lille ... 109

III.4.2. Confirmation des observations : analyse des échantillons de la cohorte ApoEurope fournis par le CHU de Nancy ... 116

III.4.3. Nouvelle confirmation des observations et effet centre : analyse des échantillons de la cohorte AgeCoDe fournis par le CHU de Bonn (Allemagne) ... 123

III.4.4. Confirmation de l’effet centre : analyse des échantillons fournis par le CHU de Genève . 132 IV. Conclusions et perspectives ... 135

Chapitre 3 : Evaluation des dispositifs Dried Blood Spot et des membranes séparatives Vivd pour l’analyse de protéines sanguines ... 137

II.2. Dépôt des échantillons sur DBS / Vivid et récupération du matériel biologique ... 143

II.3. Digestion enzymatique ... 143

II.4. Protocole SPE de dessalage des échantillons ... 144

II.5. Chromatographie liquide micro-bore – Spectrométrie de masse... 144

II.6. Développement et optimisation de la méthode scheduled-MRM ... 144

III.1. Evaluation des performances quantitatives des cartes DBS et membranes Vivid ... 149

III.2. Analyse de l’échantillon à l’aide d’un puncher : vers une normalisation du prélèvement ? .... 152

III.3. Impact du sang total sur l’analyse de protéines plasmatiques ... 157

IV. Conclusions et perspectives ... 161

Chapitre 4 : L’utilisation de la MRM3_{comme réponse à la complexité des fluides biologiques :} application à la détection et quantification de biomarqueurs dans le plasma et l’urine ... 163

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II.3. Etape de dessalage sur HLB ... 168

II.4. Chromatographie liquide – spectromètre de masse ... 169

II.5. Optimisation des transitions MRM et MRM3 utilisées ... 170

II.6. Courbe de calibration MRM/MRM3 ... 170

III.1. Spécificité de détection de la MRM par rapport à la MRM3 ... 171

III.2. Linéarité de la réponse et performances comparées des modes MRM et MRM3 ... 175

III.2.1. Plasma sanguin : quantification de la CRP et TIMP-1 ... 177

III.2.2. Urine : quantification de la podocin et de l’aquaporin-2 ... 181

III.3. Optiques de développement pour les méthodes MRM3 ... 183

III.3.1. Capacités de multiplexage de la MRM et de la MRM3 ... 183

III.3.2. Sélection des ions en MRM3 ... 184

Chapitre 5 : Considérations techniques lors de l’utilisation de la micro-chromatographie pour l’analyse de protéines dans des fluides biologiques ... 193

II.3. Protocole SPE de dessalage des échantillons ... 197

II.4. Chromatographie liquide – spectrométrie de masse ... 198

II.5. Développement de la méthode scheduled-MRM et optimisation ... 200

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III. Résultats et discussions ... 201

III.1. Considérations techniques liées au système LC-ESI-MS/MS ... 201

III.1.1. Optimisation électrospray pour la plate-forme micro-bore ... 201

III.1.2. Performances liées au système chromatographique ... 204

III.1.3. Importance de l’effet matrice dans le processus électrospray ... 209

III.2. Comparaison des performances de chaque plate-forme ... 210

III.3. Impact de la matrice sur les résultats : courbes de calibration du PSA ... 218

Chapitre 6 : Développement d’un protocole de purification de protéines à l’aide de cartouches SPE à large taille de pores pour l’analyse de milieux complexes ... 225

II.1.1. Réactifs et échantillons utilisés ... 231

II.2. Digestion enzymatique initiale ... 231

II.3. Dessalage sur cartouche HLB ... 232

II.4. Plate-forme LC-MS/MS pour l’analyse quantitative ... 232

II.5. Plate-forme haute résolution pour l’analyse de protéines ... 234

III. Résultats et discussions ... 235

III.1. Evaluation du panel de cartouche avec une stratégie habituelle d’élution SPE phase inverse 235 III.2. Développement du solvant d’élution adapté ... 239

III.2.1. Etude du comportement des protéines standard sur une colonne chromatographique possédant une large taille de pore ... 239

III.2.2. Développement du solvant d’élution adapté aux cartouches de protéines en phase inverse ... 241

III.2.3. Evaluation de la compatibilité du solvant d’élution avec une digestion enzymatique ... 243

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III.3. Application du protocole développé à différentes matrices ... 252

III.3.1. Evaluation du protocole développé pour la quantification de protéines urinaires ... 252

III.3.2. Evaluation du protocole développé pour la quantification de protéines plasmatiques .... 255

III.3.3. Mise en place du protocole pour l’analyse d’échantillons contenant des enzymes mixées avec des surfactants : application aux lessives industrielles ... 258

Chapitre 7 : Combinaison de la digestion rapide de protéines associée à la SPE en ligne pour l’analyse rapide de candidats biomarqueurs dans les fluides biologiques ... 267

II.2. Digestion enzymatique de référence ... 272

II.3. Protocole SPE de dessalage des échantillons hors ligne ... 273

II.4. Chromatographie liquide micro-bore – Spectrométrie de masse... 273

II.5. Matériel utilisé pour les protocoles de digestion rapide ... 274

III.1. Accélération de la digestion par élévation de température ... 275

III.1.1. Influence du mode de chauffage : comparaison entre μ-ondes et chauffage conventionnel ... 275

III.1.2. Optimisation de la durée et de la température de digestion... 279

III.1.3. Optimisation de la quantité de trypsine utilisée et du nombre de cycles de digestion ... 284

III.1.4. Impact du choix du peptide sélectionné dans la structure de la protéine ... 288

III.1.5. Dénaturation des protéines assistée par solvant organique ... 290

III.1.6. Evaluation de la répétabilité de la méthode de digestion rapide ... 293

III.1.7. Linéarité de la méthode de digestion rapide ... 295

III.2. Utilisation de la SPE en ligne pour contourner les étapes de dessalage et de concentration de l’échantillon ... 298

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13 III.2.1. Principe de la SPE en ligne ... 298 III.2.2. Evaluation de l’impact de la matrice dessalé en ligne ... 301 III.2.3. Performance analytique des stratégies 2D et 1D ... 303 III.2.4. Effet mémoire lié au dessalage en ligne ... 305 III.2.5. Validation de la méthode développée : combinaison de la digestion rapide et de la SPE en ligne pour l’analyse rapide d’un panel de protéines plasmatiques ... 307 IV. Conclusions et perspectives ... 311 Conclusion générale... 315 Annexes ... 319 I. Courbes de saturation observée pour la totalité des 32 peptides suivis lors de l’injection de quantités croissantes de plasma sur le système narrow-bore. ... 319 II. Courbe de neutralisation par de la soude 1M de 5 μL d’AF présent dans 1 mL de H2O. ... 320 III. Cinétiques de digestion pour les 32 protéines suivies lors de l’étude, réalisées à 37°C et 50°C en bain thermostaté. ... 321 Communications écrites ... 323 Communications orales ... 325 Références bibliographiques ... 327

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Liste des figures

Figure 1. Nouveaux cas de cancers en 2011, et mortalité associée (source InVS). ... 34 Figure 2. Illustration de la gamme dynamique de la matrice plasmatique d’après la concentration des protéines (d’après Anderson et Anderson [10]). ... 36 Figure 3. Les étapes de développement d’un nouveau biomarqueurs et paramètres associés (adapté de Rifai et al. [28]) ... 40 Figure 4. Objectifs recherchés selon la phase de développement poursuivie ... 45 Figure 5. Schéma du principe utilisé pour l'analyse de protéines par LC-MS/MS ... 46 Figure 6. Nomenclature proposée par Biemann pour identifier les fragments issus d’un peptide donné par spectrométrie de masse [36] ... 47 Figure 7. Procédure générale utilisée pour une préparation d’échantillon avec quelques méthodes proposées pour accélérer la digestion trypsique (d’après Hustoft et al. [57]) ... 54 Figure 8. Stratégies de purification de l’échantillon comparées ... 56 Figure 9. Schéma habituel de dessalage et concentration de l’échantillon avant son injection ... 58 Figure 10. Exemple de montage utilisé pour réaliser de la SPE en ligne sur la plate-forme analytique [69,70] ... 59 Figure 11. Illustration de l’impact de l’effet matrice sur le signal observé ... 61 Figure 12. Processus d’ionisation des composés au sein de la source électrospray ... 62 Figure 13. Mécanisme de rétention sur une phase stationnaire HILIC ... 63 Figure 14. Comparaison des systèmes chromatographiques couramment utilisés pour l’analyse de protéines par spectrométrie de masse. ... 65 Figure 15. Les 2 types de chromatographie bidimensionnelle utilisés en quantification de protéines par spectrométrie de masse (document Agilent) ... 67 Figure 16. Stratégie d’analyse multiplexée utilisant la LC 2D en mode « heart-cutting » ... 68 Figure 17. Stratégie mise en place pour l'analyse PRISM d'un échantillon biologique, d'après Shi et al. [90] ... 69 Figure 18. Schéma descriptif du rail analytique du spectromètre de masse 5500 Q-Trap (fourni par le constructeur ABSciex) ... 70 Figure 19. Illustration de la spécificité insuffisante de la MRM pour quantifier certaines protéines plasmatiques. ... 71

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Figure 20. Comparaison des modes d’analyse MRM et MRM3 utilisables sur un appareil de type Q-Trap. ... 72 Figure 21. Réponse comparée de 3 peptides présents à 250 ng/mL dans un échantillon ... 76 Figure 22. Résultat d’une recherche SRM atlas pour le peptide LSEPAELTDAVK (protéine de PSA). ... 78 Figure 23. Exemple de rampes d’optimisation de DP et CE, réalisées par infusion du peptide de synthèse LSEPAELTDAVK (protéine PSA) sur le 5500 QTrap. ... 79 Figure 24. Exemple de résultat SRM Collider, pour le peptide LSEPAELTDAVK (protéine PSA) dans du plasma humain, avec la résolution associée au 5500 QTrap (0.7 Da en Q1, 1 Da en Q3) ... 81 Figure 25. Exemple de l’utilisation de l’aire normalisée dans Skyline 1.4 pour détecter un pic chromatographique interféré dans un échantillon ... 82 Figure 26. Quantification relative permettant de distinguer 2 séries d’échantillons. ... 84 Figure 27. Exemple de droite de régression obtenue lors de la réalisation d’une gamme d’étalonnage (données arbitraires) ... 86 Figure 28. Séparation en masse du peptide de PSA et de son étalon marqué avec +6 Da pour les différents états de charge de l'ion précurseur. ... 88 Figure 29. Illustration d'une courbe de ROC et des points particuliers (en rouge). ... 101 Figure 30. Chromatogramme reconstitué obtenu en suivant les transitions de LSPLGEEMR (Apolipoprotein A-I) sous sa forme non-oxydée (a), et oxydée en solution et en source (b), lors de l’injection d’une solution standard du peptide à 1 μg/mL dans l’eau. ... 103 Figure 31. Répétabilité du protocole de digestion estimée en calculant les coefficients de variation obtenus sur le ratio d’oxydation, pour une série de 30 échantillons préparés sur 3 jours. ... 106 Figure 32. Stratégie utilisée pour l'analyse de l'influence des cycles de congélation/décongélation, en présence ou non d'antioxydants. ... 107 Figure 33. Impact de la congélation / décongélation et de la présence d’antioxydant dans l’échantillon sur le ratio d’oxydation observé. ... 108 Figure 34. Influence de l’âge des patients sur le ratio d’oxydation observé, dans le cas de l’apolipoprotein A-I (en haut) et l’apolipoprotein E (peptide SWFEPLVEDMQR) (en bas). ... 110 Figure 35. Influence du sexe du patient sur le ratio d'oxydation observé. ... 111 Figure 36. Influence de l'état du patient (sain ou alzheimer) sur le ratio d'oxydation observé pour chacune des protéines étudiées. ... 112 Figure 37. Répartition des ratios d'oxydation observés en fonction du génotype des échantillons considérés et de leur état pour les protéines de l’étude. ... 113

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17 Figure 38. Courbes de ROC correspondant à l'étude du ratio d'oxydation des échantillons de Lille, d'après leur état de santé. ... 115 Figure 39. Impact de l'état de santé du patient sur le ratio d'oxydation observé dans le cas de la cohorte ApoEurope pour chacun des protéines de l’étude... 118 Figure 40. Courbes de ROC correspondant à l'étude du ratio d'oxydation des échantillones de la cohorte ApoEurope, d'après leur état de santé. ... 120 Figure 41. Moyenne du ratio d'oxydation observé pour les protéines étudiées en fonction de la provenance des échantillons. ... 122 Figure 42. Evolution des ratios d’oxydation observés sur les QCs au fur et à mesure de l'étude menée sur la cohorte fournie par le CHU de Bonn. ... 124 Figure 43. Evolution du ratio d'oxydation des patients sains au fur et à mesure de l'étude menée sur la cohorte fournie par le CHU de Bonn. ... 126 Figure 44. Evolution du ratio d'oxydation des patients atteints d’Alzheimer au fur et à mesure de l'étude menée sur la cohorte fournie par le CHU de Bonn. ... 127 Figure 45. Courbes de ROC calculées pour l'étude sur la cohorte d'échantillons fournis par le CHU de Bonn. ... 129 Figure 46. Comparaison des résultats obtenus pour les patients sains issus de la banque ACD, aux patients Alzheimer issus de la banque GA d'une part, et de la banque ACD d'autre part. ... 131 Figure 47. Répartition des ratios d'oyxdation pour les échantillons du CHU de Genève, traités en aveugle. ... 133 Figure 48. Répartition des cancers les plus mortels en France, d'après l'Institut National de Veille Sanitaire (INVS). ... 139 Figure 49. Illustration d'une carte Dried Blood Spot et du puncher utilisé pour récupérer les échantillons. ... 141 Figure 50. Illustration d'une membrane séparative Vivid utilisée pour séparer les hématies et le plasma sanguin. ... 141 Figure 51. Localisation des punchs prélevés pour chaque spot DBS ou bande Vivid réalisée. ... 153 Figure 52. Répartition des protéines sur le support considéré, en fonction de la position du punch. ... 156 Figure 53. Impact du sang total sur le signal observé pour les peptides de Transferrin (a), de Complement factor B (b) et de Clusterin (c) suivis dans les analyses du sang de souris. ... 158 Figure 54. Evaluation de la répétabilité (N=3) observée lors de l'analyse du sang total de souris déposé sur DBS (bleu), sur Vivid (orange) et du plasma extrait sur Vivid (vert). ... 160

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Figure 55. Illustration de l'impact de la haute résolution pour distinguer des ions de masse proche. .... 166 Figure 56. Principe de fonctionnement de la MRM3, réalisée sur un appareil de type QTRAP. ... 167 Figure 57. Illustration du gain en spécificité apporté par la MRM3, comparativement à celle observée en MRM. ... 173 Figure 58. Illustration de l'apport de la MRM3 pour la quantification de protéines faiblement concentrées. ... 175 Figure 59. Stratégies utilisées pour la construction des droites de calibration réalisées en MRM et en MRM3. ... 176 Figure 60. Courbes de calibration obtenues en MRM et MRM3 pour les 2 protéines plasmatiques considérées... 177 Figure 61. Chromatogrammes reconstruit obtenus en MRM et MRM3 pour le peptide ESDTSYVSLK aux 2 valeurs de LOQ déterminées. ... 179 Figure 62. Chromatogrammes reconstruit obtenus en MRM et MRM3 pour le peptide GFQALGDAADIR aux 2 valeurs de LOQ déterminées. ... 180 Figure 63. Courbes de calibration obtenues en MRM et MRM3_{pour les 2 protéines urinaires considérées.} ... 181 Figure 64. Mise en place du découpage en séquences d'une analyse MRM3 pour augmenter les capacités multiplexes. ... 184 Figure 65. Stratégie d'optimisation usuelle en MRM, par infusion du peptide cible. ... 185 Figure 66. Spectres de fragmentation MS2_{et MS}3_{pour les 2 états de charge des ions précurseurs, et des} ions fragments primaires les plus intenses, pour les peptides APLTKPLK (a) et GPGGVWAAEAISDAR (b). ... 187 Figure 67. Comparaison des intensités des ions fragments secondaires générés en MRM3 selon l'état de charge de l'ion fragment primaire utilisé. ... 188 Figure 68. Comparaison de l’effet matrice observé dans le cas des méthodes micro (bleu) et narrow-bore (vert), avec une injection de 0.625 ng d’équivalent protéine chargé sur la colonne. Le ratio a été estimé en calculant l’aire de la transition y9+ du peptide LSEPAELTDAVK, ajouté à H2O+0.5% AF (a, b) ou du plasma digéré dilué par 40 (c, d). ... 199 Figure 69. Optimisation des paramètres de source avec l’utilisation de débits de 21 μL/min, avec les sondes de 50 μm et 100 μm, en utilisant une solution standard du peptide LSEPAELTDAVK à 100 ng/mL. Les paramètres IS (croix), TEM (cercle), CUR (triangle), et le débit (losange) ont été optimisés un à un, en conservant les autres paramètres constants. ... 202

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19 Figure 70. Signal observé pour une injection de solution standard de peptide LSEPAELTDAVK à 200 ng/mL, en utilisant la sonde de 50 μm (bleu) ou la sonde de 100 μm (rouge) de diamètre interne à 21 μL/min. ... 203 Figure 71. Chromatogrammes obtenus pour une injection de 5 μL de solution standard de peptide FPVHAALWGPEK à 1 μg/mL, en utilisant simultanément une détection par UV et MS/MS avec les plates-formes micro (bleu) et narrow-bore (vert). Le ratio des aires Micro / Narrow a été calculé et comparé entre les 2 systèmes de détection utilisés. ... 207 Figure 72. Signal observé pour l'ion précurseur tri-chargé du peptide FPVHAALWGPEK infusé à 100 ng/mL dans les conditions optimales utilisées sur les plates-formes micro (bleu) et narrow-bore (vert). ... 208 Figure 73. (a) Aire normalisée pour 7 peptides utilisés dans l’étude sur la plate-forme narrow-bore, lorsque la quantité de plasma chargée sur la colonne augmente. Courbes de saturation pour les système micro (b) et narrow-bore (c). Les courbes présentent l’aire normalisée moyenne pour les 32 peptides étudiés sur chaque plate-forme. Les flèches noires indiquent la quantité optimale de plasma à charger sur le système, sélectionné au début de l’inflexion de la courbe. ... 211 Figure 74. Phénomène supposé de compétition ayant lieu au sein d'une gouttelette formée au sein de la source électrospray, pouvant expliquer la saturation de signal observée lorsque la quantité de plasma injectée augmente. ... 213 Figure 75. Performances comparées pour 27 injections de 125 et 312.5 nL d’équivalent plasma chargés sur les systèmes micro et narrow-bore, respectivement. La répartition des CV pour les 32 peptides est étudiée, sur leurs temps de rétention (a) et sur l’aire mesurée (b). Les barres bleues et vertes représentent les CV pour les plates-formes micro et narrow-bore, respectivement. ... 214 Figure 76. Chromatogrammes reconstruits pour les systèmes narrow (en haut) et micro-bore (en bas). Les chromatogrammes reconstruits au centre comparent l’intensité absolue observée dans le cas où 125 nL de plasma humain digéré sont injectés sur les plates-formes narrow (bleu) et micro-bore (rouge), pour 4 des peptides étudiés. ... 217 Figure 77. Impact de l’effet matrice sur la saturation du signal observée pour chaque système, dans le plasma (a) et dans l’eau (b). Les carrés bleus et les cercles verts représentent respectivement les données pour les plates-formes micro et narrow-bore. Les points de données sortant de la gamme de linéarité sont représentés en rouge. ... 219 Figure 78. Signal observé pour la transition 636.8 / 943.5 (y9+) du peptide LSEPAELTDAVK, co-infusé à une concentration maintenue de 500 ng/mL dans la phase mobile, lors de l'injection de plasma sur les systèmes micro (bleu) et narrow-bore (vert). ... 220

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Figure 79. Stratégie de fractionnement conventionnellement utilisée pour l’analyse de protéines par spectrométrie de masse (à gauche), et stratégie de fractionnement en amont proposée dans cette étude (à droite). ... 228 Figure 80. Stratégie utilisée pour estimer les rendements d’extraction des protéines au sein des différents éluats, en s’affranchissant des efficacités de digestion. ... 236 Figure 81. Rendements d’extraction obtenus sur le panel de cartouches considéré, en utilisant une stratégie habituelle d’élution en phase inverse, menée à l’aide du mélange de 4 protéines. ... 237 Figure 82. Chromatogrammes obtenus en mode « Full Scan » sur le Q-Exactive à 35000 de résolution, lors de l’injection de lysozyme C (a), albumin (b), myoglobin (c), transferin (d) en solution à 5 μg/mL. .. 240 Figure 83. Evaluation de la précipitation des protéines plasmatiques en milieu ACN, à l’aide d’un mélange de 20 μL de plasma humain et de 1 mL de solvant contenant 10/20/30/40% d’ACN. ... 241 Figure 84. Mécanisme de réduction des ponts disulfures à l’aide de DTT, par l’intermédiaire de sa fonction thiol (pKa=8.3). ... 245 Figure 85. Stratégie de préparation des échantillons de référence, pour estimer les rendements d’extraction sur le panel de cartouches SPE étudié en s’affranchissant des efficacités de digestion. ... 248 Figure 86. Rendements d’extraction comparés sur le panel de cartouches SPE étudié, utilisant le solvant d’élution développé. ... 249 Figure 87. Rendements d’extraction observés pour 7 protéines urinaires dans les éluats de 1 à 3 mL d’urine déposés sur une cartouche Strata XL 100 mg. ... 253 Figure 88. Rendements d’extraction sommés, estimés par rapport à l’échantillon de référence, correspondant aux pertes observés lors du dépôt d’une quantité croissante d’urine sur la cartouche Strata XL... 254 Figure 89. Rendements d’extraction estimés dans l’élution de 100 μL d’équivalent plasma chargés sur une cartouche Strata XL 100 mg. ... 256 Figure 90. Rendement d’extraction observé sur la première élution, représenté en fonction de la taille de la protéine ciblée. ... 257 Figure 91. Exemple de surfactants présent dans une tablette de lessive commerciale Skip Active Clean. ... 259 Figure 92. Principe de l’analyse en mode « Top 10 » utilisée sur le Q-Exactive pour l’identification de protéines dans les échantillons traités, d’après Michalski et al. [223] ... 260 Figure 93. Exemple de l’analyse ciblée de la protéase Subtilisin savinase contenue dans la lessive commerciale Skip Active Clean préparée à l’aide du protocole développé sur Strata XL. ... 263

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21 Figure 94. Répartition des durées nécessaires à l’analyse d’un échantillon protéique par rapport à la durée totale, en négligeant le temps nécessaires aux manipulations (ajout de réactif, etc..). ... 269 Figure 95. Schéma du portoir utilisé dans l’appareil à μ-ondes et positions utilisées pour l’étude réalisée. ... 277 Figure 96. Comparaison du signal obtenu selon la position de l’échantillon dans le four à μ-ondes... 278 Figure 97. Cinétique de digestion à 37°C (bleu) et à 50°C (rouge) pour 5 protéines suivies lors de l’étude. ... 280 Figure 98. Comparaison des coefficients de variation sur l’aire associés aux digestions réalisées à 37°C ou à 50°C en 5 min... 283 Figure 99. Comparaison des résultats obtenus dans le cas d’une digestion rapide utilisant un ou deux cycles de digestion trypsique, à ceux obtenus sur une nuit avec un cycle. ... 286 Figure 100. Comparaison des répétabilités obtenues en fonction de la quantité de trypsine utilisée, de la durée de digestion et du nombre de cycle. ... 287 Figure 101. Illustration de l’importance du choix du peptide suivi lors d’une digestion rapide. ... 289 Figure 102. Répétabilité comparée du protocole de digestion « overnight » par rapport à celui de digestion rapide développé sur une série de 10 réplicats. ... 293 Figure 103. Paramètres de validation pour les courbes de calibration réalisées pour les 18 peptides suivis. ... 296 Figure 104. Courbes de calibration obtenues pour les 18 peptides suivis lors de l'étude. ... 297 Figure 105. Montage analytique 2D réalisé pour dessaler les échantillons en ligne. ... 299 Figure 106. Paramètres chromatographiques de la méthode de dessalage en ligne développée et exemple de chromatogramme résultant de l’analyse de 50 μL d’échantillon injecté en fin de digestion trypsique. ... 301 Figure 107. Comparaison de l’impact de la matrice sur l’analyse lorsque l’échantillon est dessalé en ligne par rapport au dessalage hors ligne. ... 302 Figure 108. Protocole analytique utilisé pour comparer l'analyse du plasma menée en 1D ou en 2D. ... 303 Figure 109. Signal comparé pour 6 peptides plasmatiques de l’étude, lors de l’injection de 858 nL d’équivalent plasma sur le système 2D avec dessalage en ligne, et sur le système 1D avec dessalage hors ligne. ... 304 Figure 110. Illustration de l’effet mémoire impliqué par le montage de dessalage en ligne après un triplicat d’injection de 858 nL d’équivalent plasma. ... 306

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Figure 111. Présentation des paramètres de validation obtenus lors de la combinaison du protocole de digestion rapide développé avec la méthode d’analyse 2D basée sur un dessalage en ligne de l’échantillon. ... 308 Figure 112. Linéarité observée lors de la combinaison du protocole de digestion rapide développé et du dessalage en ligne. ... 309 Figure 113. Apport du protocole analytique développé en terme de temps nécessaire à son exécution. ... 311 Figure 114. Intérêt de la MRM3 pour réduire la durée d'un gradient chromatographique dans le cas de l'étude du peptide SSPVVIDASTAIDAPSNLR de la Fibronectin dans le plasma digéré. ... 312

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Liste des tableaux

Tableau 1. Définition des différentes étapes de quantification d’un biomarqueur potentiel avec les caractéristiques associées (d’après Carr et al.[32] ... 43 Tableau 2. Comparatif de différentes études réalisées entre 2006 et 2014 portant sur la quantification de protéines en matrice biologique, sélectionnées pour les différentes stratégies mises en place. ... 49 Tableau 3. Liste des 20 protéines majoritaires présentes au sein du plasma sanguin [61] ... 57 Tableau 4. Nombre d'identifications possibles de protéines dans le plasma humain, selon le peptide de la protéine de PSA utilisé pour l'analyse (source BlastP). ... 75 Tableau 5. Panel de protéines constitué pour l'étude de l'impact de l'oxydation sur la maladie d'Alzheimer. ... 97 Tableau 6. Paramètres MS/MS associés aux 14 peptides suivis dans l'étude. ... 98 Tableau 7. Evaluation du ratio d'oxydation moyen et du CV associé (N=3) sur une solution standard analysée, et la même solution digérée avant analyse. ... 105 Tableau 8. Caractéristique de la cohorte de patients issus de l'Institut Pasteur de Lille. ... 109 Tableau 9. Provenance des échantillons européens issus de la cohorte ApoEurope. ... 116 Tableau 10. Répartition des échantillons fournis par le CHU de Bonn. ... 123 Tableau 11. Répartition des échantillons fournis par le CHU de Genève pour étudier l'efficacité du test indépendamment de l'effet centre. ... 132 Tableau 12. Liste des paramètres MRM utilisés pour étudier les 32 protéines de l'étude. ... 146 Tableau 13. Liste des transitions et des paramètres associés utilisés pour l'analyse du sang de souris. . 148 Tableau 14. Evaluation des performances analytiques pour les 2 supports d'extraction considérés. ... 151 Tableau 15. Evaluation de la répétabilité de prélèvement à l'aide du puncher... 154 Tableau 16. Comparaison du rapport des transitions du peptide de CRP (ESDTSYVSLK) en solution et dans la matrice plasmatique. ... 172 Tableau 17. Performances quantitatives comparées en mode MRM et MRM3 pour les 2 protéines plasmatiques étudiées. ... 178 Tableau 18. Performances quantitatives comparées en mode MRM et MRM3 pour les 2 protéines urinaires étudiées. ... 182 Tableau 19. Transitions et paramètres utilisés pour suivre le peptide de PSA dans les échantillons. ... 200

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Tableau 20. Comparaison des caractéristiques de colonnes régulièrement utilisées pour l’analyse de mélanges peptidiques. ... 205 Tableau 21. Concentration des pics comparée à la réponse observée pour les systèmes étudiés. Les concentrations ont été calculées comme indiqué par l’Equation 14 d’après les paramètres observés lors de l’analyse, les réponses ont été comparées en utilisant l’aire des pics chromatographiques. ... 216 Tableau 22. Caractéristiques des cartouches SPE utilisées lors de l’étude. ... 230 Tableau 23. Transitions utilisées pour les 4 protéines suivies lors de l’étude de développement préliminaire. ... 233 Tableau 24. Rendement moyens de digestion observés lors de la comparaison du protocole développé pour la digestion de protéines issues de la SPE et du protocole initial de digestion. ... 244 Tableau 25. Rendement de digestion observé à partir du nouveau solvant développé et des coefficients de variation sur l’aire observés, comparativement au protocole de référence. ... 246 Tableau 26. Rendements d’extraction observés sur les cartouches Strata XL, et coefficients de variation estimés sur 5 réplicats. ... 251 Tableau 27. Résultat des peptides identifiés par l'analyse de la lessive Skip Active Clean menée sur le Q-Exactive. ... 262 Tableau 28. Paramètres MS/MS utilisés pour l'analyse de la protéase Subtilisin savinase dans la lessive Skip Active Clean. ... 263 Tableau 29. Résultats comparés de la digestion assistée aux μ-ondes contre celle assistée par un bain thermostaté. ... 276 Tableau 30. Comparaison de l’aire obtenue dans le cas de la digestion à 37°C par rapport à celle menée à 50°C selon la durée de digestion considérée. ... 282 Tableau 31. Comparaison des rendements de digestion estimés selon la quantité de trypsine, le nombre de cycles et la durée utilisés. ... 285 Tableau 32. Impact de l’ajout d’un solvant organique lors de l’étape de dénaturation... 291 Tableau 33. Evaluation de la répétabilité inter-jours pour la méthode de digestion rapide développée. 294

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Liste des équations

Equation 1. Equations prédictives implantées dans Skyline 1.4 pour les paramètres analytiques d’un ion précurseur de rapport masse/charge donné, optimisées pour un appareil 5500 QTrap. ... 78 Equation 2. Calcul du Dwell Time associé à chaque transition dans le cas d’une analyse Scheduled-MRM. ... 83 Equation 3. Calcul de la concentration d'un analyte à partir de sa droite de calibration. ... 86 Equation 4. Calcul de la concentration d'un analyte d'après la réponse de son étalon marqué. ... 88 Equation 5. Calcul du ratio d'oxydation des apolipoproteins. ... 100 Equation 6. Calcul de l'effet matrice généré. ... 198 Equation 7. Calcul de la concentration maximale du pic chromatographique. ... 204 Equation 8. Calcul du volume de rétention du composé. ... 204 Equation 9. Calcul du facteur de rétention. ... 205 Equation 10. Calcul de l'efficacité de la colonne. ... 205 Equation 11. Forme développée du calcul de la concentration maximale du pic chromatographique. .. 205 Equation 12. Calcul du ratio des concentrations maximales du pic chromatographique. ... 206 Equation 13. Proportionnalité de la réponse en fonction de la concentration du composé... 206 Equation 14. Comparaison du gain théorique attendu et du gain observé. ... 206 Equation 15. Intensité d'un ion A+ dans un système de X composants... 209

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Introduction générale

Les problématiques reliées au domaine de la santé représentent un enjeu majeur de la société actuelle, particulièrement dans le cadre du dépistage et le suivi thérapeutique de maladies graves telles que les cancers ou les maladies neuro-dégénératives. Il est nécessaire aujourd’hui de mettre au point de nouveaux outils et de nouvelles stratégies analytiques permettant d’attester de l’état physiologique d’un patient. Dans ce contexte, l’évaluation de marqueurs spécifiques doit être réalisée, idéalement dans des fluides biologiques facilement accessibles et peu invasifs, tels que le plasma sanguin ou l’urine. Parmi ces marqueurs, les protéines représentent une source de recherche importante, en raison de leurs rôles variés dans les processus biologiques. En effet, leurs actions peuvent aller de la catalyse de réactions chimiques, jusqu’à la structuration de la matière vivante. Leurs niveaux endogènes dans les fluides sont fortement liés à l’état du patient, considéré normal ou anormal, et il apparaît donc indispensable de disposer de méthodes permettant de doser de manière fiable leur concentration. Actuellement, l’une des méthodes de référence pour ce type d’étude est le dosage immuno-enzymatique, de type ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), permettant de quantifier notamment l’antigène spécifique de la prostate (PSA) à des niveaux très bas de concentration dans le plasma sanguin, de l’ordre du ng/mL. Ces tests reposent sur l’utilisation d’anticorps spécifiques, dont l’étape de développement nécessite une durée (plusieurs années) et un coût (plusieurs 100 k€) important, qu’il sera nécessaire de répéter autant de fois qu’un nouveau marqueur a besoin d’être quantifié. Il devient alors laborieux de développer des méthodes fortement multiplexées, nécessaires à l’évaluation et à la validation des candidats biomarqueurs.

Dans ce cas, il apparaît nécessaire de développer des méthodes alternatives de dosage, permettant d’étudier en simultané des dizaines voire des centaines de protéines au sein d’un échantillon biologique complexe. Dans ce contexte, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) est depuis quelques années une réelle alternative aux dosages ELISA. Le processus analytique utilisé dans ce cas passe une étape importante de préparation d’échantillon, servant notamment à fractionner les longues chaînes protéiques difficilement analysables par LC-MS/MS, en chaînes peptidiques plus courtes. Après une séparation chromatographique des peptides générés, ceux-ci sont analysés par un mode de suivi désigné par le terme MRM (Multiple Reaction Monitoring) permettant d’obtenir une spécificité importante, nécessaire à l’étude d’échantillons

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biologiques. La complexité de ces matrices demeure le principal challenge dans l’utilisation des méthodes LC-MS/MS aujourd’hui, en raison de la grande gamme dynamique de concentration qu’il peut exister au sein du plasma sanguin par exemple, limitant les possibilités de quantification des protéines minoritaires. De plus, l’étape de digestion renforce la complexité des échantillons, chaque protéine libérant alors quelques dizaines à milliers de peptides. Il devient alors difficile d’étudier des protéines situées aux alentours du ng/mL et en dessous, là où les méthodes immuno-enzymatiques permettent d’atteindre des niveaux de concentration proche du pg/mL.

Même si de nombreux développements sont réalisés depuis les dernières années pour la quantification MRM et son application à l’étude de matrices protéiques, elle demeure encore jeune et un certain nombre de paramètres demeurent mal maîtrisés. De plus, le processus analytique par LC-MS/MS est relativement chronophage en comparaison des méthodes ELISA. En effet, une préparation d’échantillon est nécessaire, afin de réduire la complexité de l’échantillon. Devant la nécessité d’évaluer rapidement de nouveaux candidats biomarqueurs, afin de lutter contre les maladies graves, cette technique fait apparaître un certain nombre de verrous technologiques qu’il est nécessaire de dépasser.

Ainsi, les objectifs de ce travail de thèse ont été d’identifier certains de ces verrous, et d’évaluer ou de proposer de nouvelles stratégies analytiques pour mener des études multiplexées de protéines présentent au sein de milieux biologiques. Ces développements s’avèrent aujourd’hui nécessaire pour accélérer le débit d’analyse des échantillons et l’évaluation de candidats biomarqueurs.

Dans une première étude, les problématiques liées à la gestion des échantillons biologiques seront abordées, en présentant un cas concret d’application de la LC-MS/MS à l’analyse de candidats biomarqueurs. Cette étude se fera par l’évaluation de l’impact de l’oxydation endogène d’un groupe de protéines, les apolipoproteins, dans le cas de la maladie d’Alzheimer. L’étude de modifications post-traductionnelles, difficile à réaliser par des tests ELISA classiques, pourra être menée avec succès sur plus de 1000 échantillons de patients, permettant ainsi d’illustrer la force des méthodes LC-MS/MS pour ce type d’analyses.

Un certain nombre de problématiques ressortiront de cette étude, démontrant la nécessité de proposer un mode alternatif de prélèvement et de stockage des échantillons biologiques. Ainsi, l’évaluation les dispositifs DBS (Dried Blood Spot) et Vivid sera proposée dans le cadre de l’analyse quantitative de 32 protéines plasmatiques, supposées reliées à des maladies cardio-vasculaires. Une illustration concrète du

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29 problème de complexité des matrices biologiques sera présentée lors de l’utilisation de sang total, démontrant la nécessité de développer des méthodes plus spécifiques.

Ainsi, l’utilisation d’un mode alternatif basé sur une analyse MS3, et désigné par le terme MRM3_{, sera} proposée pour résoudre ce problème de spécificité. Celui-ci permettra de valider avec succès des méthodes de quantification de protéines modérément voir faiblement concentrées dans des matrices plasmatiques (C-reactive protein et metalloproteinase inhibitor 1) ou urinaires (aquaporin-2 et podocin), en s’affranchissant des interférents. L’avantage de cette méthode de quantification sera de permettre de s’affranchir dans certains cas d’une préparation poussée de l’échantillon, permettant de réduire la durée et les coûts nécessaires.

Dans cette optique, une plate-forme chromatographique encore peu utilisée aujourd’hui pour l’étude de protéines, la micro-chromatographie, sera évaluée d’un point de vue quantitatif à l’aide du panel de 32 protéines. Même si celle-ci permettra d’atteindre les performances d’une plate-forme narrow-bore conventionnellement utilisée au laboratoire, cette étude fera apparaître l’impact important de l’effet matrice sur l’analyse LC-MS/MS. Outre les aspects d’interférences qui peuvent être partiellement résolus par l’utilisation de la MRM3, il apparaîtra nettement qu’une stratégie de purification de l’échantillon sera nécessaire pour réduire cet effet matrice.

Ainsi, une stratégie de fractionnement des échantillons en amont, c’est-à-dire avant la digestion enzymatique, sera évaluée. Cette étude basée sur l’utilisation de simples cartouches d’extraction en phase solide, permettra de mettre en évidence les avantages et les inconvénients de phases stationnaires possédant de larges tailles de pores pour l’analyse de protéines. Le protocole développé, même si il s’avèrera peu intéressant pour l’étude de protéines plasmatiques et urinaires, permettra d’analyser des enzymes contenues dans des lessives commerciales. Le développement de cette méthode sera fortement freiné par les durées nécessaires à la digestion enzymatique et à la concentration de l’échantillon, processus extrêmement chronophages.

Le processus de préparation d’échantillon représentant une étape fortement limitante dans le débit analytique par LC-MS/MS, aura donc besoin d’être optimisé. Il sera proposé de combiner l’utilisation de la digestion rapide, assistée par augmentation de température, à l’extraction en phase solide en ligne pour réduire fortement ce temps. Ce développement sera évalué par l’intermédiaire de l’analyse du panel de 32 protéines plasmatiques utilisé précédemment.

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Avant de présenter les résultats obtenus, il est nécessaire de rappeler les principes de l’analyse de protéines par spectrométrie de masse, et les difficultés rencontrées dans le contexte de l’étude de biomarqueurs.

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Chapitre 1 :

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I. Les biomarqueurs protéiques : un long processus de validation

La notion de biomarqueur a rapidement été utilisée dans plusieurs domaines, notamment le domaine de l’écologie et le domaine médical. Un biomarqueur, quelques soit sa nature, se définit selon Atkinson et al. par une « caractéristique biologique mesurable, liée à un processus normal ou non » [1].

Ainsi, en écologie, on désignera par le terme de biomarqueur, toute caractéristique permettant d’attester de la présence d’un agent polluant dans l’environnement. Il pourra tout autant s’agir du nombre d’oiseaux d’une certaine espèce dans une région donnée, de la quantité de lichen sur les arbres d’une forêt ou de la couleur du pelage des animaux.

Dans le domaine médical, qui nous intéresse plus particulièrement ici, la notion de biomarqueur est liée la plupart du temps au niveau de concentration d’une espèce chimique au sein d’un fluide biologique, comme le sang ou l’urine. Il peut s’agir de petites molécules, dont le niveau varie en fonction de l’hygiène de vie du patient comme son taux de Vitamine C par exemple, mais également de molécules de taille plus importante, comme les protéines.

Ces molécules présentent un grand intérêt pour le domaine médical, puisque leur concentration dans les fluides biologiques, facilement accessibles, va énormément varier selon l’état de santé du patient considéré, ses caractéristiques génétiques, son métabolisme, etc... Le travail développé dans ces travaux de thèse s’est axé sur l’étude de ces protéines.

I.1. L’étude des biomarqueurs protéiques

Dans le domaine de la santé, un biomarqueur peut permettre (i) une détection plus précoce d’une maladie, (ii) d’augmenter la sélection des patients qui répondent préférablement à des cibles thérapeutiques et (iii) un suivi en temps réel ou même une prédiction de l’efficacité d’un traitement.

Face à l’augmentation du nombre de maladies graves comme les cancers par exemple, il est devenu nécessaire de développer de nouveaux tests permettant de dépister de façon précoce ce type de pathologies.

Lors de la dernière étude de l’Institut National de Veille Sanitaire (InVS) datant de 2010, on prévoyait en effet 1000 nouveaux cas de cancers par jour pour l’année 2011, aboutissant à près de 150 000 décès la même année, comme le montre la Figure 1 ci-dessous :

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Figure 1. Nouveaux cas de cancers en 2011, et mortalité associée (source InVS).

Le taux de mortalité des cancers développés est relativement important, en raison d’un dépistage tardif, ayant lieu généralement à l’apparition des premiers symptômes (cancer des poumons par exemple). Ce dépistage tardif est en partie lié au caractère invasif et peu agréable des tests disponibles (toucher rectal pour le cancer de la prostate, mammographie douloureuse pour le cancer du sein..) [2].

L’utilisation des biomarqueurs peut également permettre de comprendre le processus pathologique lié à une maladie particulière, dans le but de chercher une cible à traiter. Actuellement, cette stratégie est fortement utilisée dans le cas de la maladie neurodégénérative la plus représentée, la maladie d’Alzheimer [3]. Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement curatif disponible pour cette maladie, en raison notamment d’un manque de connaissance sur ses origines. Il est admis que cette maladie se déclare plus souvent avec l’âge, mais le reste des facteurs mis en cause ne sont qu’à l’état de supposition. On pourrait citer par exemple la mise en cause du peptide bêta-amyloïde, du stress oxydant ou du déficit immunitaire [4–6].

Il existe donc ici un réel besoin de développer de nouveaux tests permettant d’étudier facilement et efficacement ces pathologies. Dans cette optique, des recherches ont été effectuées, et continuent d’être menées, pour déterminer les protéines qui présentent un intérêt clinique pour la caractérisation de ces maladies.

Il en a résulté un certain nombre de bases de données (BDD), pour certaines publiques, qui continuent d’être alimentées de jour en jour par les nouvelles données obtenues de différents laboratoires. Ces données sont essentielles à l’élaboration des tests de quantification de biomarqueurs.

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35 On peut distinguer différentes catégories de BDD, recensant différentes informations :

- les bases recensant les séquences protéiques et les modifications de structures déjà observées (ex : Uniprot, http://www.uniprot.org/)

- les structures tridimensionnelles (ex : PDB, http://www.rcsb.org/pdb/) - les fonctions enzymatiques (ex : ExPASy, http://www.expasy.org/) - etc…

On peut également trouver un certain nombre de données liées à l’observation de peptides protéotypiques issus des protéines dans les fluides biologiques (ex : GPMdb, http://gpmdb.thegpm.org/). Ces données, liées à l’utilisation de la spectrométrie de masse pour caractériser les protéines, seront discutées dans la suite du manuscrit.

Les études protéomiques à large échelle ont permis de dégager des listes importantes de candidats biomarqueurs [7]. Le problème actuel réside dans nos capacités à évaluer l’intérêt de ces biomarqueurs pour diagnostiquer un certain nombre de pathologies. L’étude des protéines dans les fluides biologiques se heurte à la complexité de ces matrices, rendant très difficile l’estimation de leurs niveaux de concentration.

I.2. Problèmes liés à l’utilisation de la matrice biologique

I.2.1. La complexité de la matrice biologique

Le plasma sanguin représente aujourd’hui la source de biomarqueurs potentiels la plus intéressante, en raison de sa grande concentration et diversité en protéines, des fortes variations qui peuvent exister lors de la contraction d’une pathologie donnée, et de sa facilité à l’obtenir par l’intermédiaire d’une simple prise de sang [8]. Malheureusement, sa forte complexité peut rapidement poser des problèmes lors du développement de la méthode de quantification.

Le plasma correspond à la fraction liquide du sang, c’est-à-dire celle qui a été débarrassée des cellules (hématies, plaquettes et leucocytes) après ajout d’anticoagulant et centrifugation. Le plasma représente 55% du volume total de sang. Le nombre de protéines contenues dans le plasma sanguin est aujourd’hui évalué à environ 20 000 [9], avec une concentration totale comprise entre 60 et 80 mg/mL. Une des problématiques de la quantification de protéines dans le plasma sanguin est liée à la large gamme dynamique de concentration de ces protéines, présentée sur la Figure 2 :

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Figure 2. Illustration de la gamme dynamique de la matrice plasmatique d’après la concentration des protéines (d’après Anderson et Anderson [10]).

Malgré cet étalement de la gamme dynamique, 90% de la quantité totale de protéine correspond à une vingtaine de protéines [11], l’albumin représentant à elle seule une concentration de l’ordre de 40 mg/mL. Ainsi, la concentration des autres protéines du mélange s’étale de plusieurs centaines de μg/mL (Fibrinogen) à seulement quelques pg/mL pour les moins concentrées (Interleukins). Cette importante gamme dynamique présente dans les matrices biologiques, et plus particulièrement celle du plasma sanguin, va impacter les différents niveaux de l’étude de biomarqueurs, du prélèvement de l’échantillon à l’analyse des résultats. Il a alors été nécessaire de développer des méthodes très spécifiques, permettant d’atteindre des niveaux très bas de quantification.

La méthode de référence pour le dosage de protéine, appelée ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), repose sur l’utilisation d’une paire d’anticorps spécifique de la protéine à doser, et va s’avérer très efficace pour surpasser cette complexité et quantifier des protéines à des niveaux très bas de concentration [12–15]. Même si les récents progrès dans ce domaine ont permis le développement de méthodes possédant un degré de multiplexage correct, de l’ordre d’une trentaine de protéines en simultané [16], la phase de développement de la paire d’anticorps s’avère longue et coûteuse, et

Analyse directe sans préparation ou purification Analyse après purification / fractionnement / enrichissement Enrichissement par immuno-capture