Calcul du Dwell Time associé à chaque transition dans le cas d’une analyse Scheduled- Scheduled-MRM

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Dans ce mode d’acquisition, il sera indispensable d’avoir d’excellentes performances chromatographiques, en terme de répétabilité des temps de rétention et de largeur de pics, pour pouvoir utiliser les capacités multiplexes à leur maximum. D’une manière générale, la chromatographie utilisée peut avoir un impact énorme sur les résultats observés, comme détaillé en section II.4.

II.6. Stratégies de quantification par spectrométrie de masse

La quantification de protéines par spectrométrie de masse peut être relative ou absolue. Dans le premier cas, on compare le taux d’expression des protéines entre au moins deux conditions, éventuellement à l’aide d’un marquage isotopique différent dans chaque échantillon. La quantification absolue permet quant à elle de déterminer avec précision la concentration exacte de la protéine au sein de l’échantillon, grâce à l’ajout d’étalons marqués stables.

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II.6.1. La quantification relative

Dans cette approche, on va comparer le signal obtenu dans au moins deux séries d’échantillons, généralement une série témoin, et une série possédant des caractéristiques particulières (pathologie, âge, sexe, etc…). Un exemple de ce qui peut être observé est présenté en Figure 26 :

Figure 26. Quantification relative permettant de distinguer 2 séries d’échantillons.

Cette quantification est possible avec ou sans marquage de l’échantillon (iTRAQ, mTRAQ, etc..). Le travail développé ici s’est concentré sur la quantification relative dite « label free » pour des raisons pratiques [118].

On se contente avec cette stratégie de faire subir à l’échantillon une digestion enzymatique usuelle, et d’analyser le mélange digéré sur le spectromètre de masse. Aucune réaction supplémentaire de marquage n’est effectuée, et aucun ajout d’étalon n’est fait. C’est la méthode la moins onéreuse qui est souvent privilégiée dans les phases de découverte en protéomique. La quantification peut se faire selon deux approches, la mesure de l’aire sous un pic chromatographique ou le décompte de spectres :

- Dans le premier cas, un balayage en masse est effectué sur les ions précurseurs, préférentiellement à l’aide d’un appareil haute résolution pour conserver une spécificité suffisante. Lorsque l’intensité d’un précurseur est suffisante, celui-ci est fragmenté pour permettre d’identifier le peptide correspondant en interrogeant une base de données. En extrayant le signal (XIC) correspondant à un ion précurseur particulier, il est possible d’obtenir un pic chromatographique intégrable, et de relier l’aire à l’abondance du peptide dans l’échantillon. Pour que cette stratégie soit applicable, il est nécessaire de posséder un

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Mesure réal is ée (uni té arbi trai re) Témoins Pathologie X

85 appareil de résolution suffisante, d’avoir des temps de rétention répétables et un bruit de fond limité. Un traitement poussé des données est souvent nécessaire pour réaliser ce type de quantification, qui permet entre autre de réaligner les chromatogrammes pour intégrer les bons pics chromatographiques.

- Lorsque l’approche du décompte de spectres est utilisée, un balayage en masse est effectué comme pour l’intégration du pic chromatographique. En partant du principe que le nombre de spectres de fragmentation réalisés pour un peptide est d’autant plus important que le peptide est abondant puisque les ions minoritaires ne sont jamais fragmentés, il est possible de relier ce décompte à l’abondance du peptide. Le groupe de Mathias Mann a ainsi proposé une méthode pour estimer la quantité de chaque protéine : il s’agit du calcul de l’indice d’abondance protéique (PAI). Pour une protéine donnée, cet indice est le rapport entre le nombre de peptides observés sur le nombre de peptides potentiels (sur une gamme de masse donnée). Cet indice a ensuite été modifié exponentiellement pour prendre le nom d’emPAI par la relation : emPAI = 10^PAI – 1. Une bonne corrélation a été obtenue entre cet indice et la concentration absolue de 46 protéines provenant de neuroblastes de souris (r = 0.93) [119]. D’autres techniques de décompte des spectres ont introduit des facteurs correctifs permettant de tenir compte de la probabilité d’observer un peptide [120] ou de la taille totale de la protéine [121].

Un certain nombre de logiciels commerciaux ou libres sont disponibles afin de quantifier les analytes en « label free ». Une liste de ces logiciels peut être trouvée dans la revue de Neilson et al [122].

La principale limitation de cette méthode de quantification est la non-possibilité de corriger les biais et dérives liés au protocole de préparation et d’analyse, notamment la dérive liée au spectromètre de masse, qui peut survenir au cours d’un encrassement ou d’une perte de la calibration de l’appareil.

II.6.2. La quantification absolue

Le but recherché est ici de savoir avec précision quelle quantité de protéine est contenue dans un échantillon, principalement pour définir un seuil limite à partir duquel un patient est considéré comme atteint d’une pathologie. Cette quantification est nécessaire dans le cas du développement d’un test de dépistage. Elle peut se faire par étalonnage externe, et la plupart du temps par étalonnage interne.

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a) Etalonnage externe

La plupart du temps utilisé lors de dosages par adsorption, émission ou fluorescence moléculaire comme l’UV et l’ELISA, cette méthode a l’avantage d’être relativement simple à mettre en place et peu coûteuse. Elle consiste en la réalisation d’une gamme d’étalonnage de l’analyte ciblé, un peptide dans le cas qui nous intéresse, en utilisant une matrice blanche, où l’analyte n’est pas présent de façon endogène. Il en résulte une relation linéaire liant la réponse observée à la quantité d’analyte présent dans l’échantillon, comme le montre la Figure 27 :

Figure 27. Exemple de droite de régression obtenue lors de la réalisation d’une gamme d’étalonnage (données arbitraires)

Il est alors possible pour tout échantillon inconnu de remonter à la concentration du peptide dans celui-ci en utilisant la relation :