Mécanismes de coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF-β dans la répression de la iNOS

Afin de chercher des pistes mécanistiques qui pourraient expliquer par quels moyens les isoformes TAp73 potentialisent l’effet répresseur du TGF-β sur l’induction de la iNOS, nous avons choisi de suivre l’état de phosphorylation de SMAD2 dans les cellules TAp73+/+ et TAp73^-/- dans différentes conditions. L’activation par phosphorylation de SMAD2 sur les résidus Ser465 et Ser467 est l’un des premiers évènements à initier la voie de signalisation du TGF-β. Elle se produit lors d’une interaction transitoire entre SMAD2 et le récepteur de type I au TGF-β (TβRI/ALK5) qui est lui-même phosphorylé par le récepteur TβRII après sa liaison au TGF-β. Cette phosphorylation de SMAD2 est un préalable à son association avec SMAD4 et à la translocation du complexe dans le noyau⁵⁴⁷. Dans les 3T3 TAp73^-/-, nous avons effectivement mesuré une forte accumulation de la forme phosphorylée de SMAD2 en réponse au TGF-β1 ajouté de façon exogène (avec un facteur 10 suite à un traitement avec 5 ng/ml de TGF-β1) (cf. Figure III-6D). Le traitement préalable des cellules avec le SB-525334 prévient totalement l’activation de SMAD2 par phosphorylation. Le niveau de phosphorylation augmente très rapidement après la stimulation avec le TGF-β1, et il atteint son maximum au bout d’une heure (cf. Figure III-6C). Ce niveau de phosphorylation est ensuite maintenu au moins pendant 8h.

Nous avons commencé par mesurer l’impact de la concentration en sérum (deux lots provenant de fournisseurs différents) sur le niveau de phosphorylation de SMAD2, 24h après l’induction de la iNOS dans les 3T3 TAp73+/+ et TAp73^-/- (cf. Figure III-6A/B). Les résultats montrent que le niveau basal de phosphorylation de SMAD2 dans un milieu de culture appauvri en sérum est très faible, et associé à une induction équivalente de la iNOS dans les cellules

TAp73^+/+ et TAp73^-/-. De façon très intéressante, le passage des cellules dans un milieu riche en sérum (10%) induit une accumulation significative de la forme phosphorylée de SMAD2 dans les 3T3 TAp73^+/+ (avec un facteur 3,10) qui ne se produit aucunement dans les 3T3 TAp73^-/-. Dans ces mêmes conditions, le SB-525334 ramène le niveau de phosphorylation de SMAD2 à un niveau semblable à celui observé dans le milieu pauvre en sérum. Ces résultats suggèrent que l’activation de la voie de signalisation du TGF-β par le TGF-β présent dans le sérum est amoindrie dans les 3T3 TAp73-/- lorsqu’ils sont cultivés de façon prolongée dans ces conditions. Ils peuvent être corrélés à la surexpression de la iNOS observée dans ces cellules dans des conditions où le milieu de culture est riche en TGF-β endogène présent dans le sérum ou produit par les cellules.

La totalité du TGF-β présent sous forme latente dans le sérum peut être activé grâce à la chaleur suite à une incubation préalable du sérum pendant 10 minutes à 80°C. En incubant les 3T3 avec ce sérum activé par la chaleur, nous avons observé une forte augmentation de la phosphorylation de SMAD2 à la fois dans les 3T3 TAp73^+/+ et TAp73^-/- (avec un facteur voisin de 6). Ceci démontre que la concentration en TGF-β latent présente dans le sérum est suffisamment importante pour activer efficacement SMAD2 par phosphorylation dans les deux types de lignées. Le SB-525334 inhibe complètement la phosphorylation de SMAD2 induite par le TGF-β activé par la chaleur.

A partir de ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que la perte d’effet répresseur du TGF-β sur l’expression de la iNOS constatée dans les cellules génétiquement déficientes en isoformes TAp73 pourrait provenir d’un déficit d’activation du récepteur ALK5 en réponse au TGF-β dans ces cellules. Nous avons donc entrepris de tester la sensibilité des 3T3 TAp73^+/+ et TAp73^-/- au TGF-β, en mesurant le niveau de phosphorylation de SMAD2 en réponse à des doses croissantes de TGF-β1 (après 1h de stimulation dans un milieu appauvri en sérum). Les résultats démontrent un niveau identique de phosphorylation de SMAD2 dans les cellules

TAp73+/+ et TAp73-/- en réponse à ces concentrations de TGF-β1 (cf. Figure III-6E/F). Le niveau de phosphorylation maximal de SMAD2 est atteint pour la même concentration en TGF-β1,

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soit 1 ng/ml, et une concentration de 100 pg/ml est suffisante pour parvenir à la moitié de ce niveau maximal dans les deux types de lignées.

Les résultats précédents suggèrent que si le niveau basal de phosphorylation de SMAD2 semble supérieur dans les 3T3 TAp73^+/+ lorsque les cellules sont cultivées de façon prolongée (24h) dans un milieu contenant une forte concentration en sérum, l’activation précoce (1h) de la voie en réponse à du TGF-β1 exogène ne semble en revanche pas altérée par la déficience en isoformes TAp73. Ces résultats suggèrent que les isoformes TAp73 pourraient moduler la réponse à long terme des cellules au TGF-β, mais ils ne permettent pas encore d’expliquer la perte d’effet suppresseur du TGF-β1 exogène utilisé en forte concentration (5 ng/ml) sur l’induction de la iNOS dans les cellules TAp73-/-, car dans ces conditions les niveaux d’activation par phosphorylation de SMAD2 sont identiques pour les deux génotypes après 1h de traitement.

Nous avons pu confirmer, par l’intermédiaire d’un dosage ELISA, que les différents lots de sérum utilisés lors de cette étude contiennent une quantité importante de TGF-β1 (≥500 pg/ml), suffisante pour expliquer l’effet répresseur du sérum sur l’induction de la iNOS et le fort niveau basal de phosphorylation de SMAD2 constatés dans les 3T3 TAp73^+/+ (cf. Figure III-7A). Nous avons aussi mesuré la production totale de TGF-β1 par les 3T3, que nous n’avons pas trouvé affectée par le statut de TAp73 : la production journalière s’élève à 65 pg/ml pour les cellules des deux génotypes (cf. Figure III-7B/C).

Afin de trouver une explication au déficit de dégradation de la protéine iNOS par le protéasome observé dans les 3T3 TAp73^-/-, nous avons décidé de suivre l’expression des gènes

Spsb1 et Spsb2. Ces deux gènes codent pour des protéines SOCS-box à domaine SPRY

(SplA/ryanodine receptor) qui servent de sous-unité de reconnaissance de la iNOS au sein de complexes E3 ubiquitine ligase de type ECS (cf. Introduction, partie 1.5.3). De façon très intéressante, nous avons constaté une forte induction de l’expression du gène Spsb1 en réponse au TGF-β1 dans les 3T3 TAp73^+/+ (avec un facteur 3,4 après 24h de traitement), qui n’a pas lieu dans les 3T3 TAp73^-/- (cf. Figure III-7D/E). Les isoformes TAp73 semblent ainsi nécessaires à l’induction de l’expression de SPSB1 en réponse au TGF-β1, ce qui pourrait expliquer au moins en partie la plus grande stabilité de la iNOS dans les 3T3 TAp73^-/-. Nous avons enfin remarqué que l’expression de Spsb2 n’est pas significativement modifiée par le traitement avec le TGF-β1, que ce soit dans les cellules TAp73^+/+ ou TAp73^-/-.

1.5 Conséquences fonctionnelles de la surproduction de