Les régulations réciproques entre la iNOS et p53 ont fait l’objet de nombreuses études. La description relativement récente des deux homologues de p53 a ouvert de nouvelles perspectives dans ce domaine. Notre laboratoire a donc abordé il y a quelques années une analyse des interactions potentielles entre NO et p73, et c’est dans ce cadre qu’a été découverte l’induction de TAp73 par de fortes concentrations en NO. Le principal objectif de mes travaux fut d’étudier le rôle potentiel de p73 dans la régulation de l’expression de la iNOS. Nous disposions pour cela de cellules 3T3 de génotype sauvage ou issues de souris sélectivement déficientes pour les isoformes TAp73, ce qui nous permit d’étudier le rôle particulier de cette classe d’isoformes.
Il est à noter que, contrairement à ce qui a été démontré chez des macrophages de souris par exemple, la seule stimulation des récepteurs à l’IFN-γ ou au LPS est insuffisante pour induire efficacement la iNOS dans les cellules 3T3. Ceci confirme qu’il existe des propriétés d’induction du gène Nos2 spécifiques à chaque type cellulaire qui peuvent par exemple provenir de différences d’accessibilité des éléments de réponse du promoteur Nos2 aux facteurs de transcription ou de l’existence de voies de signalisation différemment activées selon le type cellulaire. De plus, et contrairement aux macrophages, les fibroblastes ne sécrètent que peu de cytokines proinflammatoires (ex : TNF-α et IL-1β) susceptibles d’agir de façon autocrine et paracrine pour amplifier la stimulation par les cytokines ajoutées dans le milieu de culture.
1 Régulation négative de l’expression de la iNOS
par les isoformes TAp73
Considérant le rôle répresseur de p53 sur le gène Nos2, nous envisagions initialement que si les isoformes TAp73 exerçaient un rôle analogue, nous devrions observer une augmentation de l’expression de la iNOS dans les cellules TAp73-/-.Nous avons en effet constaté une forte hausse de l’induction de l’expression de la iNOS dans les cellules 3T3 TAp73-/-. Cette surexpression a été observée à la fois au niveau de la quantité de transcrits Nos2 et de protéines iNOS, en réponse au traitement avec une combinaison d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-1β (ainsi qu’en substituant le LPS à l’IL-1β). Elle a pour conséquence une augmentation de la production de NO, reflétée par l’augmentation de la production de nitrite. Nos observations suggèrent que les isoformes TAp73 exercent un effet négatif sur l’induction de la iNOS qui n’avait encore à ce jour jamais été décrit.
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Il sera à l’avenir intéressant d’aborder la question du statut de p53 dans la régulation de la iNOS exercée par les isoformes TAp73, car les 3T3 sont des lignées immortalisées pour lesquelles il est probable que la voie de signalisation dépendante de p53 soit inactivée. A l’instar d’autres fonctions pour lesquelles les différents membres de la famille p53 présentent une redondance fonctionnelle, il est possible que le phénotype observé dans notre modèle cellulaire dépende strictement des isoformes TAp73 en raison d’une perte de fonction de la protéine p53. L’analyse de l’implication des isoformes TAp73 dans la régulation de la iNOS dans des lignées primaires permettra de répondre à ces questions. Des premiers résultats obtenus avec des MEFs primaires non immortalisés semblent cependant indiquer que le contrôle de l’induction de la iNOS par les isoformes TAp73 peut s’exercer en présence d’une protéine p53 fonctionnelle.
1.1 Coopération entre les isoformes TAp73 et le TGF-β
dans le processus de répression de la iNOS
Après avoir fait la démonstration que la surexpression de la iNOS observée dans les cellules TAp73-/- provenait d’une réponse différentielle à un facteur sécrété par les 3T3 eux-mêmes et présent dans le sérum de culture, nous avons rapidement suspecté une implication potentielle du TGF-β dans le phénotype observé. Les résultats de nos travaux permettent de conclure à une perte significative de l’effet répresseur du TGF-β sur l’induction de l’expression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/-. L’inhibition de la voie de signalisation dépendante du récepteur ALK5 permet en effet de rétablir un niveau identique d’induction de la iNOS dans les lignées des deux génotypes, tandis que le TGF-β apporté de façon exogène exerce un fort effet répresseur sur l’induction de la iNOS qui est perdu en quasi-totalité dans les cellules
TAp73-/-. Malgré tout, de nombreuses questions restent en suspens pour expliquer la synergie entre les isoformes TAp73 et le TGF-β à l’origine de ce phénomène.
1.1.1 Effet des isoformes TAp73 et du TGF-β sur l’induction
transcriptionnelle du gène Nos2
Nos résultats montrent que le TGF-β et les isoformes TAp73 exercent une partie de leur effet répresseur en réduisant la quantité de transcrits du gène Nos2 en réponse au mix de cytokines utilisé pour l’induction. Il reste à déterminer si ces observations sont la conséquence d’une répression transcriptionnelle ou d’un mécanisme de déstabilisation post-transcriptionnelle des ARNm Nos2. Si plusieurs études font état d’une répression de la iNOS
par p53, le mécanisme sous-jacent reste aujourd’hui inconnu, et rien n’indique qu’il nécessite une coopération avec le TGF-β536,537. Dans la plupart de ces travaux, les auteurs suggèrent que la protéine p53 entrerait en compétition avec d’autres facteurs de transcription tels que NF-κB et AP-1 pour la liaison à des quantités limitées de coactivateurs transcriptionnels comme p300 et CBP551. Une multitude de facteurs de transcription (ex : NF-κB, IRF1, IRF3, STAT-1α) sont activés en réponse aux cytokines et concourent à l’induction de l’expression de la iNOS. Il sera nécessaire de mesurer l’impact du TGF-β et de la déficience en isoformes TAp73 sur leur état d’activation (par phosphorylation de résidus spécifiques) ainsi que sur leur capacité à stimuler l’activité du promoteur Nos2.
Il existe de très nombreux exemples de régulations croisées entre les voies de signalisation induites par l’IFN-γ, le TNF-α, l’IL-1β et le LPS d’une part, et la voie de signalisation du TGF-β d’autre part, au sein desquelles les isoformes TAp73 et leurs homologues pourraient s’immiscer pour moduler l’induction de la iNOS. Dans les macrophages RAW 264.7 par exemple, la répression transcriptionnelle de la iNOS par le TGF-β passe par une suppression de l’activation de STAT1 : le récepteur TβRI s’associe au récepteur IFNGR1 et le phosphoryle, ce qui empêche l’activation de STAT1 par phosphorylation326. Dans les macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse (BMDM), les macrophages péritonéaux et les macrophages associés à des tumeurs (TAMs), SMAD2 et SMAD3 sont nécessaires à la répression de la iNOS par le TGF-β, en limitant l’activation d’IRF3 et donc la production d’IFN-β en réponse au LPS qui contribue normalement à amplifier l’activation de STAT1328. En marge de la régulation de l’expression de la iNOS, le TGF-β réprime aussi la transcription génique dépendante de STAT1 dans les cellules épithéliales, en favorisant son interaction avec la protéine PIAS1 (Protein
inhibitor of activated STAT1), qui inhibe son activité transcriptionnelle552. A l’inverse, l’IFN-γ produit par les macrophages recrutés au niveau de lésions cutanées retarde le processus de cicatrisation en antagonisant la signalisation TGF-β des fibroblastes, via une réduction de l’expression de SMAD2 et une augmentation de l’expression de SMAD7553.
Il existe aussi des connexions entre la voie de signalisation du TGF-β et NF-κB, qui est un facteur de transcription au rôle capital dans l’induction transcriptionnelle de Nos2 et est activé dans notre modèle en réponse à l’IL-1β, au TNF-α et au LPS. Dans des fibroblastes de souris, NF-κB/RelA induit l’expression de SMAD7, qui inhibe la phosphorylation de SMAD2/3 en s’associant au récepteur TβRI554. Dans des cellules cancéreuses des voies aériennes supérieures, le TGF-β induit l’activation séquentielle de la kinase TAK1 (TGF-β-activated