Les facteurs de transcription modulant l’expression de la iNOS

Les séquences promotrices du gène NOS2 de tous les mammifères présentent de fortes homologies au niveau de sites de liaison à de très nombreux facteurs de transcription. L’identification des éléments de réponse à ces facteurs de transcription a mis en évidence leur fréquente localisation au sein des ECR du promoteur. Seuls certains de ces sites putatifs (qui sont au nombre de 2700 environ d’après une analyse avec le logiciel MatInspector de la région de 20 kb flanquant en 5’ du gène humain) ont effectivement pu être impliqués dans la régulation de l’activité du promoteur (cf. Figure I-23). Leur répartition se concentre essentiellement à proximité de la boîte TATA (elle-même située à environ 30bp du site d’initiation de la transcription) ainsi que dans la région avoisinant -900 bp pour les promoteurs murins et humain.

Le facteur de transcription NF-κB constitue la cible centrale d’un grand nombre d’activateurs et d’inhibiteurs de l’expression de la iNOS, chez tous les mammifères202–204. La stimulation des récepteurs au LPS (TLR4), à l’IL-1β (IL1R1) et au TNF-α (TNFR2) engagent des voies de signalisation distinctes qui conduisent pourtant toutes à l’activation puis à la translocation nucléaire de NF-κB. L’activation de la sérine/thréonine kinase IKK, qui contrôle la dégradation de l'inhibiteur spécifique de NF-κB (IκB), est une étape critique dans ces voies d’activation. La liaison de NF-κB à des éléments de réponse spécifiques dans le promoteur

NOS2 entraîne l’induction de l’expression de la iNOS. Plusieurs molécules comme les

glucocorticoïdes et le TGF-β1 peuvent inhiber l’expression de la iNOS en bloquant l’activité de NF-κB (capture par des interactions protéine-protéine ; blocage de la translocation nucléaire ; inhibition de l’activité transactivatrice ; hausse de l’expression de IκB).

Figure I-24 : Induction de l’expression de la iNOS par la stimulation synergique d’un macrophage avec le LPS et l’IFN-γ. Le LPS est un composant de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Le LPS se lie à la LBP (LPS binding protein), qui le délivre à CD14, un récepteur de haute affinité au LPS. Le récepteur TLR4 (Toll like receptor 4) interagit avec le complexe CD14-LPS et active une cascade de signalisation intracellulaire via les protéines adaptatrices IRAK (Interleukin-1 receptor-associated kinase) et MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88). Ces adaptateurs activent à leur tour des molécules comme TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6), TAB1 (TAK1-binding protein 1) et p38. L’activation de TLR4 conduit aussi à la phosphorylation de IKK (Inhibitor of kappaB kinase), qui phosphoryle à son tour IκB et libère NF-κB. Ce dernier est alors transloqué dans le noyau où il se lie à des éléments de réponse spécifiques pour activer la transcription du gène NOS2. Les cytokines proinflammatoires comme l’IL-1β et le TNF-α activent également NF-κB. L’IFN-γ se lie au complexe récepteur IFNR1/IFNR2, qui active des kinases JAK (Janus kinases), conduisant à la synthèse STAT1α-dépendante d’IRF1. L’activation de STAT1α et d’IRF1 en réponse à l’IFN-γ fournit un boost synergique à l’induction par le LPS de la transcription de NOS2.

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Il faut remarquer que la combinaison de différents stimuli, qui agissent en synergie, est souvent nécessaire pour assurer une induction transcriptionnelle vraiment significative du gène

NOS2. Typiquement, sur des macrophages, le traitement avec du LPS en combinaison avec de

l’IFN-γ permet une induction bien supérieure à celle obtenue isolément avec chacun des stimuli (cf. Figure I-24). Chez la souris, les interférons (de type I -α/β- et de type II -γ-) et les produits d’origine microbienne (ex : LPS) sont les inducteurs prototypiques de la transcription de la iNOS, qui stimulent efficacement la libération de NO par les macrophages. Les IFNs provoquent la dimérisation de STAT1α (Signal transducer and activator of transcription

1alpha), l’expression d’IRF1 (Interferon-regulatory factor-1) puis la formation du complexe

ISGF3 (Interferon-stimulated gene factor 3), tandis que le LPS déclenche l’activation de NF-κB. Ces facteurs de transcription interagissent avec des sites de liaison spécifiques dans le promoteur du gène NOS2.

L’équipe de Farlik et ses collaborateurs a révélé les bases moléculaires sous-jacentes à l’induction synergique de la iNOS par les IFNs de type I et des composés microbiens, en utilisant des macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse infectées avec Listeria

monocytogenes²⁰⁵. Dans un premier temps, les composés bactériens interagissent avec des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMP =

Pathogen-associated molecular patterns) membranaires et cytosoliques qui déclenchent

respectivement l’activation de NF-κB et la production d’IFN-α/β. La liaison de NF-κB au promoteur de NOS2 conduit au recrutement de TFIIH (Transcription factor II human) et de sa sous-unité CDK7 (Cyclin-dependent kinase 7). La seconde étape est la formation et la liaison au promoteur NOS2 du complexe ISGF3, permettant le recrutement de l’ARN polymérase II et sa phosphorylation par CDK7. NF-κB et ISGF3 agissent ainsi de façon séquentielle et coopérative pour induire transcriptionnellement la iNOS.

La liaison de l’IFN-γ au récepteur aux IFN de type II provoque l’activation de JAK2, une tyrosine kinase cytosolique de la famille Janus. La phosphorylation de STAT1α, par JAK2 directement ou par la PKC activée via la PI3K en réponse à JAK2, entraîne son homodimérisation et sa translocation nucléaire. L’activité du promoteur NOS2 est stimulée après fixation de STAT1α à des séquences GAS (γ-interferon activated site)206,207. L’activation parallèle des kinases ERK1/ERK2 induite par l’IFN-γ assure une activation complète de STAT1α (phosphorylation du résidu Ser727). De plus, STAT1α induit transcriptionnellement IRF1, dont le rôle est essentiel dans l’induction de la iNOS par l’IFN-γ dans les macrophages

murins. La liaison directe d’IRF1 au promoteur de NOS2 n’a été décrite jusqu’aujourd’hui que chez la souris.

De multiples autres facteurs de transcription proinflammatoires ont pu être impliqués dans l’induction transcriptionnelle de NOS2, bien que leur influence varie considérablement en fonction de l’espèce et du type cellulaire concerné. Parmi ces facteurs de transcription figurent AP-1, HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1) et Oct-1 (Octamer-1). Le complexe AP-1 est issu de l’hétérodimérisation de c-Fos et c-Jun induite par les voies des MAPK ERK, tandis que HIF-1 est un facteur de transcription stabilisé en conditions d’hypoxie. La faible saturation en oxygène est une caractéristique des sites inflammatoires et des tissus tumoraux. Elle induit une stabilisation de la sous-unité α du facteur de transcription HIF-1, qui stimule l’expression de gènes améliorant l’oxygénation des tissus et favorisant la résolution de l’inflammation. L’hypoxie seule est un faible inducteur de l’expression de la iNOS, mais une forte synergie opère entre HIF-1α et l’IFN-γ ou les agonistes des TLR (Toll-like receptors)-3/4/9 pour activer le promoteur de NOS2, au travers d’une coopération avec NF-κB208.

L’activité du promoteur NOS2 peut aussi être réprimée : des récepteurs nucléaires comme les récepteurs aux glucocorticoïdes forment des complexes avec STAT1α, AP-1 et NF-κB, ce qui inhibe leur activité transactivatrice²⁰⁹. De plus, ils entrent en compétition avec eux pour la liaison à des coactivateurs transcriptionnels (ex : CBP et p300). Il existe aussi des situations où AP-1 inhibe l’activité du promoteur NOS2 humain en se fixant sur une séquence Silencer dite AP-1-like²¹⁰. Le suppresseur de tumeur p53 et le TGF-β (pour ce dernier via le complexe TCF11/MafG chez l’Homme) répriment également l’expression de la iNOS. Les mécanismes mis en cause dans cette régulation seront abordés en détail au cours des prochains chapitres.

Le tableau ci-après (Tableau I-2) récapitule l’effet des principaux facteurs de transcription régulant l’expression de la iNOS, et les types cellulaires dans lesquels leur implication a été décrite pour la première fois¹⁸⁹.

Tableau I-2 : Principaux facteurs de transcription régulant l’expression de la iNOS. L’effet positif ou négatif des différents facteurs sur le niveau d’induction de la iNOS est indiqué par les flèches, ainsi que les lignées cellulaires dans lesquelles ces effets ont été décrits pour la première fois.

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Facteur de transcription ^{Activité du}

promoteur ^{Cellules (Espèce)}

Activating protein-1 (AP-1)

↑

↓

A549 (Homme)

DLD-1, A549, HUVEC (Homme)

CCAAT-enhancer box binding protein (C/EBP)

↑

Forkhead box O3A (FOXO3A)

↑

Glucocorticoid receptor-α,-β (GR-α,-β)

↓

Hypoxia-induced factor-1 (HIF-1)

↑

Cardiomyocytes (Rat)

Hepatocyte nuclear factor-4α (HNF-4α)

↑

Heat shock factor 1 (HSF1)

↑

Interferon regulatory factor 1 (IRF1)

↑

RAW 264.7 (Souris)

Krüppel-like factor 6 (KLF6)

↑

COS-7 (Vervet vert) Nuclear factor of activated T cells (NF-AT)

↑

Nuclear factor-IL6 (NF-IL6)

↑

Nuclear factor-κB (NF-κB)

↑

RAW 264.7 (Souris)

Octamer factor 1 (Oct-1)

↑

RAW 264.7 (Souris)

Tumor suppressor p53 (p53)

↓

Fibroblastes de derme (Souris) Peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPAR- γ)

↓

RAW 264.7 (Souris)

Retinoic acid receptor-α / Retinoic X receptor-α (RAR-α/RXR-α)

↑

↓

HeLa, HepG2, A549 (Homme)

Gliobl. T98G / U87MG (Homme) Cellules de Küpffer, VSMCs (Rat)

Sma and MAD protein 2/3 (SMAD2/3)

↓

Signal transducer and activator of transcription 1α (STAT1α)

↑

↑

Macrophages (Souris)

1.5.3 La régulation transcriptionnelle et