RESULTATS EXPERIMENTAUX
1 Implication des isoformes TAp73 dans la régulation de l’expression de la iNOS
1.5 Conséquences fonctionnelles de la surproduction de NO induite par la déficience en isoformes TAp73
1.5.1 Renforcement de la réponse antioxydante dépendante
de Nrf2 et de NO dans les 3T3 TAp73
-/-Comme cela a été décrit dans l’introduction, les fortes concentrations en NO peuvent induire l’activation de multiples facteurs de transcription tels que p53 et HIF-1. Le facteur de transcription Nrf2 (facteur apparenté à NF-E2) est lui aussi un effecteur activé par l’activité iNOS. Il coordonne l’expression d’un grand nombre de gènes impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques et qui protègent les cellules d’un stress oxydatif (ROS) ou nitrosant causé par une forte concentration en NO et en ses dérivés.
Malgré la forte augmentation de la production de NO par les 3T3 TAp73-/-, nous n’avons pas constaté de hausse de leur mortalité en comparaison avec les 3T3 TAp73+/+. C’est la raison pour laquelle nous avons fait l’hypothèse d’un renforcement de la réponse cytoprotectrice dépendante de Nrf2 dans ces cellules. Pour évaluer les conséquences éventuelles de la perte d’expression des isoformes TAp73 sur l’activation de Nrf2, nous avons mesuré par RT-qPCR l’induction de l’expression de plusieurs gènes cibles classiquement activés par ce facteur de transcription dans les 3T3 TAp73+/+ et TAp73-/-, en réponse au mix de cytokines proinflammatoires. L’expression des gènes codant la sulfirédoxine (Srxn1), l’hème oxygénase 1 (Hmox1), la NADPH quinone déshydrogénase 1 (Nqo1) et la sestrine 2 (Sesn2) a été analysée 24h après le début de la stimulation cytokinique des cellules 3T3.
Les résultats présentés sur la Figure III-8 montrent tout d’abord que, comme cela était attendu, la stimulation des cellules 3T3 TAp73+/+ avec une combinaison d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-1β a pour conséquence d’induire de façon substantielle l’expression des quatres gènes cibles de Nrf2 analysés : l’expression de Hmox1 est multipliée par 5,2, celle de Srxn par 2,2, celle de Nqo1 par 3,7 et celle de Sesn2 par 2,1 (cf. Figures III-8C/D/E/F respectivement). Ceci suggère que le facteur de transcription Nrf2 est bien activé dans cette lignée de fibroblastes en réponse à une stimulation par les cytokines proinflammatoires qui induisent l’expression de la iNOS. De façon remarquable, nous avons constaté qu’une augmentation importante de l’induction de ces gènes cibles de Nrf2 apparait dans les 3T3 TAp73-/- en réponse au traitement par le mix de cytokines dans un milieu riche en sérum (5%). Après 24h, l’expression du gène
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Hmox1 dans les cellules 3T3 TAp73-/- est multipliée par 26, celle de Srxn par 4,3, celle de Nqo1 par 6,8 et celle de Sesn2 par 3,1. Le niveau basal d’expression de ces différents gènes est très comparable pour les deux génotypes, ce qui implique que leur niveau d’expression relatif est très largement supérieur dans les cellules TAp73+/+ à l’issue des 24h de stimulation, avec un ratio TAp73-/- vs TAp73+/+ culminant par exemple à 10 pour Hmox1.
Pour déterminer si l’augmentation de l’induction de ces gènes cibles de Nrf2 dans les 3T3
TAp73-/- est bien la conséquence d’une surproduction de NO, nous avons mesuré leur expression après 24h de traitement avec le mix de cytokines en présence d’un inhibiteur de l’activité iNOS. L’aminoguanidine (2 mM) a été choisie car elle permet d’inhiber en totalité l’activité enzymatique de la iNOS (cf. Figure III-8A), mais aussi car elle n’a pas d’effet sur l’expression du gène NOS2 (cf. Figure III-8B) et ne présente pas de toxicité à cette concentration. L’analyse par RT-qPCR de l’expression des gènes Hmox1, Srxn et Nqo1 montre que le traitement des cellules avec l’aminoguanidine prévient en totalité leur induction par le mix de cytokines (cf. Figure III-8C/D/E). Ceci démontre donc que la hausse de leur induction par le mix de cytokines dans les 3T3 TAp73-/- est bien la conséquence de la surproduction de NO dans ces cellules. Nous n’avons pas observé de perte de l’induction du gène Sesn2 lors du traitement avec l’aminoguanidine, ce qui suggère que son induction par le cocktail de cytokines dans les 3T3 TAp73-/- ne dépend apparemment pas de la synthèse de NO (cf. Figure III-8F). En conclusion, nous pouvons donc affirmer que les isoformes TAp73 limitent fortement l’expression de gènes cibles de Nrf2 dont l’induction est dépendante de la production de NO.
Après avoir démontré que la surexpression de la iNOS dans les 3T3 TAp73-/- a pour conséquence de renforcer l’induction de gènes sous la dépendance de Nrf2 et assurant une adaptation au stress nitrosant et oxydant, nous avons voulu savoir si ce phénomène était aussi dépendant de la signalisation par le TGF-β. Nous avons pour cela réalisé une série d’expériences similaires aux précédentes en analysant l’effet d’un traitement avec du TGF-β1 exogène et avec l’inhibiteur sélectif d’ALK5 (SB-525334). Les résultats indiquent que le TGF-β1 exogène permet de réduire l’accumulation d’ARNm Nos2 en réponse à la stimulation par le mix de cytokines de 34% dans les 3T3 TAp73+/+, tandis qu’il n’a pas d’effet significatif sur les 3T3 TAp73-/- (cf. Figure III-9A). De façon intéressante, ces variations d’expression du gène
Nos2 se répercutent directement sur le niveau d’induction des gènes cibles de Nrf2 analysés
dans les mêmes conditions : les inductions de Hmox1, Srxn et Nqo1 sont respectivement réduites de 66%, 30% et 64% par le TGF-β1 dans les cellules TAp73+/+, alors qu’elles ne sont
pas affectées dans les cellules TAp73-/- (cf. Figure III-9B/C/D).
De même que le traitement des cellules avec le SB-525334 supprime l’effet négatif exercé par les isoformes TAp73 sur l’induction du gène Nos2 (cf. Figure III-9A), il permet aussi de rétablir un niveau identique d’induction des trois gènes cibles de Nrf2 testés (cf. Figure III-9B/C/D). L’inhibition de la voie de signalisation dépendante d’ALK5 permet en effet de multiplier l’expression de Hmox1 par 7,9, celle de Srxn par 6,2 et celle de Nqo1 par 5,4 dans les 3T3 TAp73+/+ en comparaison aux mêmes cellules non traitées. D’un autre côté, le traitement des 3T3 TAp73-/- avec le SB-525334 n’a aucun effet significatif sur l’induction de
Hmox1 et Nqo1 par le mix de cytokines, et seulement un faible effet sur celle de Srxn (facteur
2,1). L’expression de la protéine HMOX1 a aussi été suivie par Western-Blot dans ces conditions, et elle confirme les résultats obtenus par RT-qPCR sur les variations des niveaux de transcrits Hmox1 : la protéine HMOX1 apparait fortement induite par le mix de cytokines et très surexprimée dans les cellules 3T3 TAp73-/- lorsque ces dernières sont cultivées en présence d’une forte concentration de sérum (cf. Figure III-9E). Le traitement avec le TGF-β1 exalte ce différentiel d’expression tandis que le SB-525334 permet de rétablir, dans les 3T3 TAp73+/+, une expression similaire de HMOX1 à celle observée dans les 3T3 TAp73-/-. En conclusion, toutes ces données indiquent que la coopération entre les isoformes TAp73 et la voie de signalisation du TGF-β permet de moduler la réponse génique dépendante de Nrf2 par l’intermédiaire de leur effet répresseur sur l’induction de la iNOS.
Afin de montrer la pertinence du choix des gènes cibles de Nrf2 que nous avons choisi d’étudier, nous avons analysé l’induction de ces gènes dans des macrophages dérivant de cellules de moelle osseuse de souris Nrf2+/+ et Nrf2-/-. L’induction de la iNOS dans ces macrophages BMDM est réalisée par un traitement des cellules avec du LPS (100 ng/ml) et de l’IFN-γ (10 U/ml) pendant 24h, à l’issue de leur différenciation. La dépendance à la production de NO de l’induction des différents gènes cibles analysés a aussi été testée en traitant les cellules avec différents inhibiteurs de NO synthases : l’aminoguanidine (AG), la S-éthyl thiourée (SEITU) et l’ester méthylique de N-Nitroarginine (L-NAME).
Les résultats que nous avons obtenus montrent une très forte induction des gènes Hmox1 (facteur 22,3), Srxn (facteur 5,0), Nqo1 (facteur 2,3) et Sesn2 (facteur 6,8) dans les BMDM
Nrf2+/+ en réponse au traitement avec le LPS et l’IFN-γ (cf. Figure III-10A/B/C/D). Alors que la iNOS semble induite de façon similaire dans les BMDM Nrf2+/+ et Nrf2-/-, comme en atteste
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la production de NO2- identique pour les macrophages des deux génotypes (cf. Figure III-10E), l’induction des quatre gènes testés est très fortement réduite dans les BMDM Nrf2-/- : réduction de 92% pour Hmox1, de 73% pour Srxn, de 63% pour Nqo1 et de 93% pour Sesn2. Ceci suggère que Nrf2 est en grande partie responsable de l’induction de ces quatre gènes en réponse au traitement avec le LPS et l’IFN-γ. De façon similaire à nos expériences sur les 3T3, l’inhibition de l’activité iNOS avec les trois inhibiteurs différents permet d’inhiber l’induction des gènes
Hmox1, Srxn et Nqo1 par le traitement avec le LPS et l’IFN-γ, mais pas celle de Sesn2. Ces
résultats démontrent que si ces quatre gènes sont bien des cibles du facteur de transcription Nrf2, seuls Hmox1, Srxn et Nqo1 sont transcriptionnellement activés en réponse à une forte production de NO par les macrophages.