V. Autres énoyl-ACP-réductases et leurs inhibiteurs
V.3. Inhibiteur n'interagissant pas avec le cofacteur NAD
Enfin, une autre molécule, inspiré de la structure de l'INH, a elle aussi montré une activité inhibitrice de l'énoyl-ACP réductase InhA native et résistante à l'INH (InhA Ile21Val). En essayant de contourner les problèmes de résistance à l'INH liés aux mutations de KatG, Oliveira et al,136,137 ont étudié un analogue de l'INH contenant le motif cyanoferrate (Figure
19), avec l'objectif qu'il soit capable de s'oxyder sans KatG.
Ce composé a été testé sur InhA natif et le mutant Ile21Val INH-résistant. Comme espéré, ce composé ne nécessite pas d'activation par KatG pour inhiber InhA. La présence de NADH n'est pas nécessaire pour l'activité du complexe métallique. Ce complexe inorganique de fer est un inhibiteur de type "slow binding" d'InhA, comme les adduits INH-NAD (cf III.2.1.). Dans un premier temps, il avait été suggéré que ce FeII(CN)5(INH)3- ait le même site
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d'interaction que le cofacteur NADH, car les fortes concentrations en NADH protègent InhA de l'inhibition par FeII(CN)5(INH)3- et que la constante de vitesse d'inhibition de premier ordre
apparente est dépendante de la concentration en NADH. En effet, l'inhibition d'InhA par le complexe de fer apparaît être compétitive avec NADH. Cependant, des études plus récentes ont montré qu'il en était de même avec le substrat 2-trans-décénoyl-CoA, ce qui laisse envisager un mécanisme d'inhibition impliquant des interactions avec à la fois le site du substrat et du cofacteur. Les études de modélisations moléculaires n'ont pas permis de décrire avec précision le site de fixation de ce complexe, mais des études pour déterminer la structure tridimensionnelle du complexe binaire InhA-FeII(CN)5(INH)3- sont en cours.
O HN NH2 Fe CN CN NC CN NC 3-
69 Face à la résurgence actuelle de la tuberculose, le développement de nouvelles molécules à activité antimycobactérienne est indispensable.
Parmi les cibles potentielles, le complexe enzymatique FAS-II est un système modèle pour la conception de nouveaux antibactériens. En effet, ce complexe enzymatique, présent chez la mycobactérie, est absent chez l'homme. Ainsi, un médicament inhibant l'une des enzymes du cycle FAS-II (InhA, MabA, KasA, Dehydratase) serait sélectif vis-à-vis de M. tuberculosis et par conséquent moins toxique pour l'hôte.
Depuis plusieurs années, la recherche réalisée au sein de l'équipe contribue à une meilleure compréhension, au niveau moléculaire, du mécanisme d'action de l'INH, dans le but de concevoir de nouvelles molécules capables d'agir comme antituberculeux.
Dans l'optique de rechercher de nouveaux composés actifs apparentés à l'INH, trois stratégies peuvent être envisagées :
La première stratégie, la plus étudiée, est la synthèse d'analogues de l'INH où le noyau pyridine est remplacé par différents noyaux aromatiques. Bien que de nombreux travaux aient été réalisés dans ce sens et que de très nombreuses molécules aient été synthétisées, aucun nouveau médicament n'est né de cette approche.138-144
La deuxième stratégie est basée sur l'idée que le radical isonicotinoyle est la forme active de l'INH. Ainsi, la préparation de molécules capables de générer le radical isonicotinoyle plus facilement au cœur de la mycobactérie pourrait être intéressante.136,137 Contrairement à la première stratégie, cette approche est très peu exploitée.
La troisième stratégie, celle que nous avons choisie et mise en application, consiste à élaborer des molécules apparentées à l'adduit INH-NAD (inhibiteur direct d'InhA), plutôt qu'à l'INH lui-même.
Ainsi, nous nous sommes tout d'abord particulièrement intéressés à la synthèse d'analogues des adduits INH-NAD en tant qu'inhibiteur direct d'InhA. Ce travail se place dans la suite de la thèse de Sylvain Broussy qui avait commencé à développer des analogues simplifiés benzoylés de l'adduit INH-NAD. Cependant tous ces composés ont été inactifs.
Notre objectif est donc de récupérer l'activité en augmentant la complexité de la chaîne liée à l'azote du nicotinamide, ou encore par l'introduction du motif isonicotinoyle, pour se rapprocher d'avantage des adduits INH-NAD.
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Cette stratégie permettrait le contournement du problème de résistance lié à l'étape d'activation de l'INH par l'enzyme KatG. De plus, afin de contourner les résistances dues à des mutations du gène inhA, la synthèse d'adduits INH-NAD simplifiés au niveau de la chaîne lié à l'azote du nicotinamide (absence du motif ADP) permettrait d'éliminer les interactions au niveau du motif adénosine diphosphate (ADP) (Figure 20).
La synthèse ainsi que l'évaluation biologique de ces dérivés sont rapportées dans le chapitre I. INH KatG Mutations KatG Analogues adduit INH-NAD Mutations InhA NAD(H) Inhibition InhA INH activé Adduit
INH-NAD Analogues simplifiés adduits INH-NAD NAD(H) Inhibition InhA INH activé Adduit
INH-NAD NAD(H)
NAD(H) Inhibition InhA INH activé
INH activé Adduit INH-NAD Adduit INH-NAD Analogues simplifiés adduits INH-NAD Analogues INH-NAD Contournement résistances KatG Analogues simplifiés Contournement résistances InhA Analogues INH-NAD Contournement résistances KatG Analogues INH-NAD Contournement résistances KatG Analogues simplifiés Contournement résistances InhA Analogues simplifiés Contournement résistances InhA
Figure 20 : Stratégie mise en place au laboratoire pour la synthèse de nouveaux composés à
activité antituberculeuse potentielle, contournement des résistances liées à KatG et à InhA.
Dans un deuxième temps, une stratégie appelée bisubstrat a été mise au point dans le but de développer de nouvelles molécules plus affines pour InhA. Cette stratégie consiste à réunir au sein d'une même molécule des caractéristiques structurales du cofacteur et du substrat de l'enzyme InhA. Nous envisageons de greffer sur le nicotinamide-hémiamidal un résidu lipophile qui mimerait la chaîne alkyle hydrophobe du substrat alors que le noyau nicotinamide représenterait le cofacteur.
La synthèse de ces composés et l'évaluation de leurs activités inhibitrices de l'enzyme InhA et de la croissance bactérienne sont décrites dans le chapitre II.
Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique existant entre les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD. En effet, les adduits en solution, existent majoritairement sous formes cyclisées alors que les données des Rayons-X de l'adduit INH-NAD cristallisé au sein d'InhA montre une structure ouverte de type céto-amide.
Nous avons donc étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire (en collaboration avec Jean-Luc Stigliani). Les résultats obtenus sont exposés dans le chapitre III.
71 Enfin pour essayer de mieux comprendre ce phénomène (équilibre tautomérique), le chapitre IV présente des études de docking et de dynamique moléculaire réalisées sur l'enzyme InhA avec les différents adduits décrits en solution (en collaboration avec Jean-Luc Stigliani et Philippe Arnaud).