Hypothèse d'ouverture des adduits cycliques

Les adduits cyclisés sont majoritaires en solution, les adduits INH-NAD sont des inhibiteurs de type "slow tight binding" et comme nous venons de le montrer, l'adduit ouvert 4S est le plus affin pour InhA. A partir de l'ensemble de ces considérations, nous avons émis l'hypothèse suivante : l'interaction d'InhA avec l'inhibiteur INH-NAD pourrait se faire initialement avec la structure cyclique 3 (majoritaire en solution) qui se tautomériserait au sein d'InhA pour donner la forme linéaire 1 qui est énergétiquement plus favorable.

Il est intéressant de noter que l'hydroxyle de la tyrosine 158 est en interaction par liaison hydrogène avec l'hydroxyle tertiaire du motif hémiamidal du composé 3 (4S7R) (ONIOM) et avec l'atome de souffre de la méthionine 199 (AM1). L'étude de dynamique moléculaire confirme la proximité de l'hydroxyle de la Tyr158 et celui de l'hémiamidal. Dans plus de 39% des 5 ns finales de l'étude, ces groupements sont très proches dans l'espace, la distance moyenne est de 2,8 Å. Par contre pour l'adduit cyclique 4R7S, la liaison hydrogène impliquant l'hydroxyle de l'hémiamidal et la Tyr158 n'a pas été observée.

Nous proposons donc que la Tyr158 catalyse l'ouverture du cycle hémiamidal de l'adduit INH-NAD 3 (4S7R) pour donner l'adduit ouvert 1 (4S) (Schéma 43).

Dans ce modèle, la tyrosine joue un rôle critique dans le processus d'ouverture en tant qu'accepteur d'hydrogène. InhA déprotonnerait l'hydroxyle tertiaire de l'hémiamidal de l'adduit INH-NAD en utilisant le phénolate activé (par la Met 199) transitoire de la Tyr158. L'alkoxy formé serait ensuite converti en adduit ouvert 3 reprotoné par l'intermédiaire de la Met199.

149 N H O OH OH O ADP N NH O H N O OH OH O ADP H O N O O NH N H O OH OH O ADP N O NH2 O COOH NH2 O S COOH NH2 H Tyr158 Met199 δ+ δ+ COOH NH2 O S COOH NH2 Tyr158 Met199 H H COOH NH2 O S COOH NH2 Tyr158 Met199 H 6 3 N NH O H N O OH OH O ADP O COOH NH2 O S COOH NH2 Tyr158 Met199 H H

Schéma 43 : Ouverture de l'hémiamidal en céto-amide catalysée par la Tyr158.

Cette hypothèse d'ouverture catalysée par la Tyr158 a permis de rendre compte de la différence d'activité d'inhibition enzymatique des adduits 4S7R et 4R7S alors que les énergies d'interaction calculées étaient comparables. En effet, la Tyr158 ne catalyserait l'ouverture que du 4S7R pour donner l'adduit 4S le plus favorable énergétiquement.

V. Article

Publication à soumettre 2 : Binding of the tautomeric forms of isoniazid-NAD adducts to the active site of the Mycobacterium tuberculosis enoyl ACP-reductase (InhA): a theoretical approach. Jean-Luc-Stigliani, Philippe Arnaud, Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson and Jean Bernadou.

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VI. Conclusion

Les résultats théoriques que nous avons obtenus sont en accord avec les résultats expérimentaux63 et ceux de la littérature.22,56-58 L'adduit le plus favorable énergétiquement est la forme ouverte céto-amide 1 (4S). La seule différence retrouvée est sur l'énergie d'interaction des deux adduits cycliques 3 et 4 avec InhA, dans les calculs théoriques ils sont très proches alors qu'ils ont des activités bien différentes vis-à-vis d'InhA. Cette contradiction a pu être expliquée par une proposition de catalyse d'ouverture du cycle hémiamidal du composé 6 par la Tyr158 conduisant au dérivé 3 énergétiquement favorable. Ce qui explique la bonne inhibition d'InhA par 3.

Ce modèle pourra par la suite être utilisé comme outil de prédiction d'inhibition pour de nouvelles molécules. Il sera très utile dans la conception de nouveaux dérivés antituberculeux de type bisubstrat, à activité inhibitrice d'InhA.

163 Le travail de recherche qui m’a été confié dans le cadre de cette thèse a été orienté selon deux axes principaux :

™ Le premier comprenait la conception de nouvelles molécules à propriétés potentielles antituberculeuses apparentées à la prodrogue isoniazide, antibiotique de première ligne utilisé dans le traitement de la tuberculose. L’activité attendue était basée sur l’inhibition de l'énoyl-ACP réductase InhA et l’espoir était de contourner les problèmes de résistances liés à la mutation des protéines KatG et InhA impliquées respectivement dans l’activation et comme cible de l’isoniazide. ™ Le second axe représentait une contribution à une meilleure compréhension de la

nature et du mode d’interaction des formes activées de l’isoniazide avec l’enzyme InhA. Une étude approfondie a été développée sur l'équilibre tautomérique entre les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD, responsables de l’activité biologique de l’isoniazide, ainsi que sur le rôle joué par ces différentes formes dans l'interaction avec le site actif de l'enzyme InhA.

L’activation oxydante de l’isoniazide en présence du cofacteur NAD conduit à des adduits INH-NAD où un résidu isonicotinoyle est fixé en position 4 sur le noyau nicotinamide. Notre travail a consisté à préparer des analogues simplifiés de ces adduits, notamment par simplification ou suppression de la partie ADP-ribose. La première stratégie a reposé sur l’hypothèse que l'introduction d'un groupement aroyle en position 4 du nicotinamide serait suffisante pour compenser la modification de la chaîne liée à l'atome d'azote du nicotinamide (simplification ou suppression du motif ADP-ribose). Aucun des composés synthétisés n'a été capable d'inhiber InhA à une concentration de 100 µM. Ceci a permis de conclure que l'addition d'un motif isonicotinoyle ou benzoyle n'a pas été à lui seul suffisant pour compenser la perte ou la simplification du motif ADP. Ainsi un changement de stratégie s'est avéré nécessaire.

La deuxième stratégie nommée bisubstrat, développée pour InhA pour la première fois, a consisté à réunir au sein de la même molécule des caractéristiques structurales relatives au substrat et au cofacteur. Plusieurs voies originales de synthèse de tels composés, en série pyridine, pyridinium et dihydropyridine, ont été mises au point au cours de ce travail. Plusieurs composés (119, 122, 123, 124 et 125) se sont révélés comme de bons inhibiteurs d'InhA, ce qui a permis de valider cette approche. De plus, au-delà de cette étude biochimique, des tests sur mycobactéries ont également montré que les composés 108, 109,

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119, 122 et 125 sont des inhibiteurs efficaces de la croissance de M. smegmatis et de M.

tuberculosis.

Bien que pour la plupart des composés un lien entre l'activité inhibitrice d'InhA et l'activité inhibitrice de la croissance mycobactérienne n'ait pu être démontré, ces deux activités semblent être étroitement corrélées pour le composé hémiamidal 119. En effet, ce composé 119 a été incapable d'inhiber la croissance de bactéries dépourvues de la protéine InhA ou un équivalent (absence de système FAS-II) et s'est montré sélectif (CI50M. smegmatis =

68 µM, CI50 E. coli > 5 mM et CI50 C. glutamicum > 5 mM).

Les premiers composés de type bisubstrat décrits dans ce travail présentent donc un grand intérêt dans le développement de nouveaux médicaments antituberculeux et serviront de base pour la conception de dérivés bisubstrat de seconde génération.

Le second axe de ce travail a permis d’approfondir nos connaissances sur la structure des adduits INH-NAD, notamment concernant l'équilibre tautomérique chaîne-cycle qu’ils présentent en solution, mais également dévoilé par certains de leurs analogues simplifiés.

Il a été montré que cet équilibre n'est pas observé pour les 1,2-dihydropyridines ainsi que pour les dérivés pyridinium, qui ont comme caractéristique commune de posséder les atomes de carbones α et β de l'enchaînement γ-céto-amide avec une hybridation sp2_{. Ces composés}

sont retrouvés exclusivement sous forme cyclique.

Au contraire, les analogues de type 1,4-dihydropyridine existent à l’état d’équilibre tautomérique chaîne-cycle, sensible notamment à la nature du solvant et à la nature du groupement aroyle fixé en position 4 du nicotinamide. Ceci a été montré aussi bien par les données expérimentales que par les résultats de calculs théoriques. L'adduit INH-NAD "biologique", considéré comme responsable de l’activité de l’isoniazide existe en solution en équilibre tautomérique entre forme cyclique majoritaire et forme ouverte minoritaire.

L'étude par calcul théorique de l'interaction de ces deux formes (et de certains stéréoisomères) avec le site actif de l'enzyme InhA a montré que la structure chaîne est énergétiquement la plus favorable, ce qui est cohérent avec le fait que cette forme chaîne ait pu être cristallisée au sein de l’enzyme InhA. Toutefois l'ensemble des résultats expérimentaux et théoriques nous a permis de soulever l'hypothèse suivante : la forme cyclique de l'adduit INH-NAD, majoritaire en solution, pourrait interagir dans un premier temps avec le site actif d'InhA puis dans un second temps subirait une ouverture du cycle hémiamidal catalysée par la Tyr158 d'InhA conduisant à la forme chaîne céto-amide,

165 énergétiquement plus favorable, qui constituerait donc la forme ultime responsable de l’inhibition de l’enzyme. Les méthodes et procédés développés dans cette étude pourront par la suite être utilisés comme outil de prédiction d’activité et seront très utiles dans la conception de nouveaux dérivés antituberculeux de type bisubstrat.

A la fin de ces trois années de travail, de nombreuses pistes de recherche paraissent ouvertes.

Le problème des résistances prédomine actuellement dans l’utilisation des agents antituberculeux et notamment de l’isoniazide. Aussi, il serait naturellement intéressant de tester les composés bisubstrats inhibiteurs d'InhA sur des enzymes InhA mutantes (par exemple : Ser94Ala) pour vérifier si ces dérivés simplifiés au niveau du motif lié à l'atome d'azote du nicotinamide mais possédant un mime du substrat sur le fragment aroyle sont capables de contourner le problème de résistance lié à InhA. Cette approche va de pair avec une approche théorique pour laquelle les études de modélisation déjà réalisées ont permis de dégager des méthodes de calcul adaptées.

D'autre part, il serait également nécessaire de tester les composés inhibiteurs de la croissance mycobactérienne sur des souches de mycobactéries INH-résistantes.

La majorité des inhibiteurs (ceux sous forme hémiamidal) synthétisés au cours de cette thèse sont un mélange de deux énantiomères. La synthèse des deux énantiomères séparés permettrait de déterminer leurs activités propres.

Les différentes voies de synthèse que nous avons développées et le savoir-faire acquis dans les différentes séries de composés préparés doivent permettre des modulations structurales importantes et variées telles que le remplacement des liens C-O et C-C par des liens C-S ou C-N, le changement de la taille et de la position de la chaîne, l’introduction d'insaturations sur la chaîne ou le choix d’autres groupements hydrophobes.

Ainsi la conception et la synthèse de nouveaux inhibiteurs de type bisubstrat guidées par le recours à la modélisation moléculaire et avec l’aide précieuse de nos partenaires biologistes devraient permettre dans l’avenir d'approfondir les relations structure-activités et laissent espérer l’obtention de dérivés à activité antituberculeuse d’intérêt dans la série originale de composés que nous avons développée.

PARTIE EXPERIMENTALE

COMPLEMENTAIRE

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Remarques générales

Le diméthylformamide est séché sur tamis moléculaire 4 Å ou sur CaH2. Le

tétrahydrofurane a été distillé sur sodium en présence de benzophénone comme indicateur. L'acétonitrile est distillé sur hydrure de calcium. La pyridine et la diisopropylamine sont séchées sur KOH. Les autres réactifs et solvants utilisés proviennent de fournisseurs standards de produits chimiques et ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Chromatographie sur colonne : silice 60 Merck (0,063-0,200 mm). Chromatographie sur couche mince : feuilles d'aluminium recouvertes d'un gel de silice 60 F254 Merck. Révélation :

fluorescence UV (λ = 254 nm).

Point de fusion : Electrothermal Digital 9100 melting point apparatus (Méthode à capillaire)

Infra-rouge : Perkin-Elmer modèle Spectrum GX 2000. Les huiles sont enregistrées entre deux pastilles de NaCl (film de produit pur). Les solides sont enregistrés en pastille de KBr. Les fréquences (nombre d'onde) principales sont exprimées en cm-1_.

Résonance magnétique nucléaire : RMN 1H et 13C : Bruker AM250 et Avance 300 ; RMN 31P : Bruker AC200. Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés par rapport au triméthylsilane. Les notations sont : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet ou quintuplet), dd (doublet de doublet), ddd (doublet de doublet de doublet), dt (doublet de triplet), m (massif ou multiplet).

Spectrométrie de masse : TSQ 7000 Thermo Electron (DCI/NH3) ; Nermag R10-10H

(FAB et IE) ; API 365 SCIEX Perkin-Elmer (ESI). Les spectres de masse haute résolution ont été effectués au Centre d'Etude Structurale et d'Analyse des Molécules Organiques (CESAMO) à Talence ou à l'Université Paul Sabatier.

La dénomination des produits a été définie en utilisant le logiciel de nomenclature ACD/Name Nomenclat IUPAC.

La numérotation des structures, qui ne suit pas la règle IUPAC, a pour unique objectif de faciliter la description des spectres RMN.

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CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUE DES ADDUITS