Activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de Mn III

Oxydation biomimétique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII

Les travaux effectués au laboratoire par Michel Nguyen au cours de sa thèse ont permis de mettre au point un système d'oxydation in vitro de l'INH biomimétique de la catalase- peroxydase KatG. Celui-ci utilise un complexe de MnIII pour mimer l'activité manganèse- peroxydase de KatG. La réaction de l'INH avec le pyrophosphate de MnIII en présence de cofacteur NAD+ ou NADH permet d'obtenir des adduits INH-NAD présentant les mêmes données spectroscopiques (masse, UV)61,62 que ceux obtenus par réaction avec KatG.55-57 De plus ces adduits sont aussi des inhibiteurs compétitifs de l'enzyme InhA.61,63

Le rendement de la réaction de formation de ces adduits est bien meilleur avec ce système d'oxydation biomimétique qu'avec le système MnII/O2 et est comparable à celui obtenu avec

l'enzyme KatG (41%).56,57 Le pyrophosphate de MnIII présente deux intérêts par rapport au système enzymatique : la réaction est considérablement accélérée (15 minutes au lieu de plusieurs heures) et il permet d'éviter d'utiliser KatG dont la disponibilité est fluctuante. Ce système chimique simple permet donc d'obtenir des adduits INH-NAD rapidement et avec un bon rendement.

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Formation des adduits INH-NAD

Des études HPLC-SM61,62 ont permis une caractérisation plus précise des adduits formés au cours de l'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII en présence de NAD+ ou de NADH. Les chromatogrammes ont en fait montré la présence de six produits (dont deux très minoritaires) ayant une masse de 770 Da, quatre d'entre eux ayant la capacité de se déshydrater dans le spectromètre de masse. La déshydratation se produit entre le OH en position 7 et le NH, prouvé par des expériences de marquages isotopiques.62 Ces observations ont permis de proposer l'existence en solution d'un pool d'adduit isomères : en plus des deux composés de type céto-amides attendus 1 et 2, quatre autres composés de type hémiamidal cycliques 3-6 sont obtenus, issus d'une cyclisation intramoléculaire (Figure 7).

N O NH2 O N H ADP-ribose N H ADP-ribose NH N OH O N H ADP-ribose NH HO O N N ADP-ribose NH N _OH O N ADP-ribose NH N O H N ADP-ribose NH N O H 1, 2 4S et 4R 3, 4 4S7R et 4R7S 5, 6 4S7S et 4R7R 7, 8 7S et 7R 9 4 7 4 4 4 4 4 7 7 7 7 7

Figure 7 : Structure des adduits INH-NAD 1-9 (seul les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S des

composés 3, 4, 5 et 6 sont représentés).

La synthèse et la purification d'une quantité significative d'adduits INH-NAD par Sylvain Broussy au cours de sa thèse ont permis la caractérisation par RMN 1H et 13C des adduits les plus abondants : 1 et 2 céto-amides et 3 et 4 sous forme hémiamidal cycliques.64 La stéréochimie relative des carbones 4 et 7 des molécules 3 et 4 a aussi pu être déterminée par des expériences de ROE différence : les stéréoisomères 3 et 4 ont les deux noyaux volumineux pyridine et dihydropyridine en trans du cycle pyrrolidinone. La stéréochimie absolue a été déterminée par extrapolation des résultats enzymatiques (3 plus actif que 4) et par référence à l'adduit cristallisé avec InhA (le 4S), il a donc été proposé que 3 ait également une configuration 4S.

Dans le pool d'adduits INH-NAD analysé après purification, il est important de noter que la paire d'isomères majoritaires en solution est de nature cyclique trans (les produits 3 et 4).

Deux produits d'évolution des adduits INH-NAD ont également pu être identifiés et caractérisés par HPLC, HPLC-SM et RMN 1H et 13C.65 Il s'agit de produits d'oxydation 7/8 de type hémiamidal (2 épimères) et du produit de déshydratation 9 qui se forment spontanément. Les composés 7/8 avaient déjà été étudiés par Wilming et Johnsson,56 qui les avait décrits

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comme étant un produit unique de type céto-amide. En fait, le dédoublement des signaux observé en RMN 1H par Wilming et Johnsson pour 7/8 a été expliqué par Broussy et al65 comme étant du à la présence de deux épimères formés par cyclisation intramoléculaire menant à une structure de type hémiamidal cyclique et non à la formation de l'hydrate correspondant ou encore d'une possible intéraction de type π-π stacking. Finalement, le composé 9 provient d'une déshydratation des adduits cycliques 3-4 suivie d'une protonation.

Ces travaux montrent donc l'existence d'adduits INH-NAD cycliques majoritaires au sein du pool d'adduits. Ce pool composé majoritairement de forme cyclique a été capable d'inhiber efficacement l'enzyme InhA, alors qu'une structure ouverte a été proposée par Sacchettini pour l'inhibiteur sur la base d'une étude de cristallographie par diffraction des rayons X.55 En tenant compte de ces constatations, il serait légitime de s'interroger sur l'espèce responsable de l'activité inhibitrice : espèce cyclique majoritaire en solution ou espèce ouverte observée dans le cristal?

Formation des adduits INH-NADP

L'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII permet la synthèse d'adduits avec d'autres cofacteurs, notamment avec le NADP. Le pool d'adduits est constitué d'une famille d'adduits presque identiques aux adduits INH-NAD (Figure 8) avec l'ADP(P)-ribose à la place de l'ADP-ribose, ils seront notés 10 à 17. Ducasse-Cabanot et al66 ont montré que ces adduits INH-NADP étaient des inhibiteurs de l'enzyme MabA de M. tuberculosis (cf. III.2.2.).

Récemment, Vilchèse et al ont montré que l'adduit INH-NADP ouvert 4R (11) inhibait la dihydrofolate réductase (DHFR) de M. tuberculosis, une enzyme essentielle à la synthèse des acides nucléiques (cf. III.2.3).67

N O NH2 O N H ADPP-ribose N H ADPP-ribose NH N OH O N H ADPP-ribose NH HO O N N ADPP-ribose NH N _OH O 10, 11 4S et 4R 12, 13 4S7R et 4R7S 14, 15 4S7S et 4R7R 16, 17 7S et 7R 4 4 4 4 7 7 7 7

Figure 8 : Structures des adduits INH-NADP 10-17 (seuls les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S

45 Très récemment, Argyrou et al ont montré que le pool d'adduits INH-NADP était aussi un inhibiteur compétitif d'InhA avec une constante d'inhibition apparente Ki = 265 nM

(supérieure à celle observé pour le pool d'adduit INH-NAD).68