Expériences à l’échelle microscopique

2.2.2.1. Préparation de l’échantillon à observer

Les films de polymère contenant les fluorophores sont mis en forme par pressage à chaud comme pour les sources des empilements macroscopiques. Ils sont montés entre lame et lamelle. La continuité des indices optiques doit être respectée afin d’éviter tout biais optique supplémentaire. Pour cela on évite la présence de couche d’air entre le film polymère et la lame et entre le film et la lamelle. Les films de polymère peuvent être mis en forme par pressage à chaud directement entre la lame et la lamelle.

2.2.2.2. Principe de la mesure de la concentration en fluorophores par microscopie confocale à balayage laser

La description proposée ici est basée sur des coordonnées cylindriques (r,z) en considérant que des phénomènes similaires se passent à la même distance, r, de l’axe de la lentille. La généralisation à des coordonnées complètes en 3D est directe. Comme il est montré sur la figure III.5, la position z est la distance entre le plan confocal et la surface extérieure exposée au faisceau laser.

Dans un microscope confocal à balayage laser idéal, la concentration en fluorophores dans le volume confocal, notée C_{r z t, ,} , est supposé être proportionnelle à l’intensité mesurée par le photomultiplicateur, notée I_{r z t, ,} (équation (III.1)). En réalité, la sensibilité de la mesure, reliée au gain Κ_{r z, ,τ} , varie avec la position considérée en raison d’une excitation non homogène et des photons réémis dans la direction radiale. Suivant la direction z, la quantité de photons collectés varie avec z en accord avec la loi de Beer Lambert. De plus, un biais possible, noté b_{r z,} , doit également être considéré pour prendre en compte les irrégularités de surface ou les hétérogénéités de l’échantillon. Deux contributions supplémentaires sont aussi apportées : un bruit blanc, noté ^G

ε t, et un bruit de Poisson, noté ^P

ε t. Le bruit de Poisson est lié à la nature quantique de la lumière et aux transitions temporelles des fluorophores dans des états noirs, qui interviennent à de grandes échelles de temps [Basché, 1998].

Toutes les contributions sont combinées de façon linéaire :

ε ε

Κr z est supposé lié à la collimation du faisceau laser pendant le balayage et au processus d’atténuation quand le faisceau laser traverse la distance BD (figure III.5) pendant le balayage :

où P^eff, η et ze sont respectivement la puissance effective du faisceau laser, le rendement quantique de fluorescence et l’épaisseur du matériau.

Figure III.5 : Description géométrique du processus de balayage laser du microscope confocal. O est une source laser ponctuelle idéale. Le cône est généré par un balayage dans des directions différentes.

L’encart dans le coin supérieur droit détaille en particulier la région balayée.

Bien que l’équation (III.2) soit une forme simplifiée du réel chemin optique du laser (la lamelle couvre objet, l’huile, la lentille et le diaphragme ne sont pas représentés), elle s’ajuste de façon appropriée à nos données expérimentales. La figure III.6 présente les variations typiques de Κ_{r z,} avec la position dans l’échantillon. En accord avec les mesures effectuées dans des échantillons dont la distribution en fluorophores est uniforme, ze et z0 ont été estimées respectivement proches de 150 et 2 µm. En conséquence, un gradient radial en intensité est mesuré dans le volume confocal sans aucun gradient en concentration. Cet effet est dépendant de la lentille, du grossissement et de la qualité du montage de la lame échantillon (horizontalité de la surface externe, absence d’air). Il est maximum à faible grossissement et pour des mesures en profondeur (grandes valeurs de z). Au contraire du biais

,

br z qui peut aussi créer des gradients locaux en intensité, Κ_{r z,} ne dépend pas de la structure locale de l’échantillon. Ses effets peuvent donc être calibrés a posteriori sur un échantillon

différent avec des propriétés optiques similaires ou sur le même échantillon à des positions différentes.

Figure III.6 : Variations normalisées de

,

Κr z en accord avec l’équation (III.2) pour z_e = 2 µm et z₀ = 50 µm (ligne pointillée), 100 µm (ligne discontinue) et 500 µm (ligne continue).

2.2.2.3. Cinétique de photo-oxydation induite par le laser

En accord avec les lois de Kasha [1950], l’émission de fluorescence est générée par la relaxation d’un fluorophore dans un état excité, noté S1, vers son état fondamental, noté S0, qui est un autre état singulet de basse énergie. Avant l’émission, le niveau énergétique de l’état excité est affaibli par plusieurs mécanismes sans radiation comprenant des vibrations

intrinsèques à la molécule (relaxation adiabatique rapide) et des dissipations énergétiques avec l’environnement par friction. En plus des processus photophysiques, des interactions photochimiques interviennent à partir de S1. Les fluorophores en S1 et l’oxygène singulet fortement réactif peuvent réagir de façon irréversible dans des processus bimoléculaires et conduire à des espèces oxydées non fluorescentes [Eggeling et al., 1999]. Ce processus est appelé photoblanchiment. En raison du court temps de vie des états S1, il est aussi proposé que l’oxygène réagisse avec les fluorophores dans un état excité triplet de temps de vie plus long [Song et al., 1995]. Les longues durées de vie des espèces intermédiaires sont nécessaires pour permettre la diffusion de l’oxygène et par conséquence la collision entre l’oxygène et un fluorophore excité. Les durées de vie pour le blanchiment de la fluorescéine en solution aqueuse étant estimées supérieures à 1 µs [Imamura et Koizumi, 1955], des durées de vie plus longues sont attendues dans des matériaux hôtes cohésifs comme les polymères.

Les états triplet sont générés à partir des états S1 par croisements intersystèmes, ce processus étant favorisé par un couplage spin-orbite dans les molécules ayant des atomes lourds [Birks, 1970]. Les états triplet excités peuvent être en théorie thermiquement activés et retourner à l’état singulet excité puis à l’état fondamental en émettant de la fluorescence retardée [Song et al., 1997].

A partir des considérations précédentes, et comme les réactions entre fluorophores sont moins probables à faible concentration dans le polymère, la vitesse d’oxydation bimoléculaire de l’état singulet vers l’état triplet est écrite comme (en dépit du réel mécanisme de photo-oxydation) :

[ ] ^{= − ⋅}[ ] [ ]2 ^⋅

* _d O *

d F k F

dt (III.3)

où F* représente aussi bien un état singulet que triplet du fluorophore considéré.

Le photoblanchiment créé par un flux intense de photons est utilisé pour créer in situ un gradient de concentration en molécules fluorescentes. La variation avec le temps du profil de concentration créé est par la suite utilisée pour estimer le coefficient de diffusion. Le photoblanchiment induit par le faisceau laser pendant l’étape d’écriture du profil est toutefois une source additionnelle d’artefact en introduisant une atténuation du signal qui n’est pas reliée à la diffusion.

2.2.2.4. Profil typique de blanchiment 3D créé par le faisceau laser

Le processus de blanchiment étant pratiquement une cinétique d’ordre un (équation (III.3)), un faisceau laser Gaussien stationnaire crée par blanchiment un profil 3D Gaussien en exponentielle décroissante [Blonk et al., 1993] centré sur la position r,z :

⎡ ⎛ Δ Δ ⎞⎤ fluorescentes avant le blanchiment. s_r² et s_z² sont les variances de l’intensité laser respectivement suivant r et z.

Un profil de concentration typique créé par le faisceau laser est illustré sur la figure III.7. Avec les microscopes confocaux utilisant des lasers continus, la dispersion du blanchiment est maximale suivant z et minimale dans la direction radiale. Dans le plan confocal (suivant r), n’importe quelle forme peut être obtenue en contrôlant la puissance du faisceau laser entre 0 et 100 % pendant le balayage suivant r (avec des miroirs contrôlés) et/ou suivant z (avec une lentille contrôlée ou une surplatine micro-contrôlée). En accord avec la forme du profil blanchi généré par le faisceau laser, le retour de fluorescence est relié à un transport de matière en fluorophores non-oxydés suivant r (dans le plan confocal) ou z (dans la direction perpendiculaire au plan confocal). Afin de mesurer un coefficient de diffusion suivant r (dans le plan confocal), comme il a été choisi dans cette étude, le transport de matière doit intervenir uniquement dans la direction r. Le gradient de concentration suivant z est considéré minimal si la dimension caractéristique du profil dans le plan confocal (un point, une ligne, un disque, une grille, …) est inférieure à 0,1⋅sr. Une telle condition est obtenue en blanchissant plusieurs plans à plusieurs positions z ou en ouvrant le diaphragme pour augmenter sz.

Figure III.7 : Profil de concentration 3D créé par le faisceau laser pendant le photoblanchiment, décrit par l’équation (III.4), pour s_r² = 0,1, s_z² = 1,3 et kb = 1. Le plan confocal correspond à Δz = 0.

2.3. Identification des coefficients de diffusion