4. MESURE DU COEFFICIENT DE DIFFUSION DES MOLECULES
4.2. Méthode locale de mesure in situ basée sur le retour de fluorescence après
4.2.2. Expériences de retour de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)
Le principe d’une expérience de retour de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) peut se décrire en cinq étapes (figure I.29).
(a) Des sondes fluorescentes sont dispersées dans le polymère (disques colorés).
(b) Un faisceau laser de forte intensité est focalisé sur une région prédéfinie de l’échantillon (cercle pointillé).
(c) Sous l’effet du faisceau laser, les fluorophores présents à l’intérieur de cette région sont photo-oxydés en molécules non fluorescentes (disques blancs), c’est l’étape de blanchiment ou étape d’écriture.
(d) Les sondes blanchies (photo-oxydées) diffusent hors de cette région et les sondes fluorescentes diffusent vers l'intérieur (flèches).
(e) La fluorescence à l'intérieur de la région considérée augmente grâce à la diffusion dans et hors de la région blanchie ; cette augmentation est observée avec un faisceau laser de basse intensité, c’est l’étape de lecture.
Figure I.29 : Principe d’une expérience de retour de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) : (a) sondes fluorescentes dispersées au sein du matériau ; (b-c) étape d’écriture ; (d-e) étape de lecture.
Détails des étapes dans le texte.
Différentes techniques permettent de générer le motif utilisé dans la méthode FRAP (tableau I.18). Ces techniques se distinguent notamment par l’étape d’écriture qui génère le motif blanchi. L’étape d’écriture est brièvement décrite pour chacune de ces techniques :
La photomicrographie : Un faisceau laser intense est dirigé au travers d’une grille ("Ronchi ruling") dans l'objectif du microscope qui focalise une image projetée de la grille sur l'échantillon. Les molécules fluorescentes sont photoblanchies, formant un motif périodique constitué d’une alternance de raies sombres (molécules photoblanchies) et lumineuses (molécules fluorescentes).
L’interférométrie : Les sondes photoblanchissables sont sélectivement détruites dans les régions définies par les franges d’interférence constructives produites par deux faisceaux laser intenses croisés sur l’échantillon.
La microscopie confocale à balayage laser : Un microscope confocal à balayage laser permet d’obtenir une image par un balayage point par point grâce à un système de miroirs vibrants (galvanométriques) en x et y. Allumer et éteindre le faisceau, de façon contrôlée, lors du balayage laser, permet de dessiner n’importe quel motif souhaité. Une introduction à la microscopie confocale, à la fluorescence et au principe du FRAP peut être trouvée chez Sandison et al. [1994] et Valeur [2004].
Tableau I.18 : Exemples de techniques utilisant la méthode FRAP pour la détermination de D. Le plus petit coefficient de diffusion mesuré dans la référence citée est représenté par Dmin.
Techniques Milieux Diffusants Dmin
(m2·s-1)
fluorescents 10-15 Barton et McConnell, 1978 solution d’oxyde de
fluorescent 10-12 Braga et al., 2004 guar hydrogels FITC-dextran† 10-11 Burke et al., 2000 microscopie
confocale à
balayage laser poly(vinyl alcool) (PVA)
plastifié par la glycérine rhodamine B 10-17 van Keuren et Schrof, 2003 ‡
† fluorescéine isothiocyanate dextrane ; ‡ étude avec un microscope confocal bi-photons
Le transport diffusif a été caractérisé principalement dans des milieux biologiques, des environnements cellulaires et des solutions, et les valeurs de D ont été mesurées dans la gamme 10-8-10-15 m2·s-1 [Axelrod et al., 1976 ; Lawrence et al., 1994 ; Gribbon et Hardingham 1998 ; Carrero et al., 2003 ; Sniekers et van Donkelaar, 2005]. Des valeurs de D sont habituellement calculées à partir du taux de retour de fluorescence et du temps τ1/2
nécessaire pour retrouver la moitié de la fluorescence finale (figure I.30 d’après Klonis et al.
[2002]). Le coefficient de diffusion D est alors déduit de l’équation suivante [Axelrod et al., 1976], où ω est le rayon du faisceau laser à la surface de l’échantillon (1 e2 rayon gaussien) et τ le temps :
La figure I.30 met en évidence la présence d’une fraction immobile, observée lors d’expériences in vivo ou mettant en jeu des cellules, biomolécules et protéines interagissant entre elles ; ces molécules blanchies lors de l’étape d’écriture restent immobiles ou fortement ralenties par de nombreuses interactions au sein du système.
Figure I.30 : Analyse quantitative d’une expérience de FRAP : intensité de fluorescence en fonction du temps. L’intensité de fluorescence avant le photoblanchiment est normalisée à 1. τ0 correspond à l’instant où l’échantillon a été blanchi (étape d’écriture) et τ1 2 au temps nécessaire pour retrouver la
moitié de l’intensité A de la fluorescence finale.
La méthode FRAP appliquée à des processus de diffusion lents au sein des matériaux polymères denses nécessite des temps d’expérience assez longs s’il faut attendre le retour de la fluorescence jusqu’à un plateau. Il est aussi possible d’acquérir le début de la courbe de retour de fluorescence et d’utiliser un ajustement de la forme f t
( )
=A(
1−e−τt)
ou de forme plus complexe, incluant le degré de photoblanchiment [Klonis et al., 2002]. Divers modèles mathématiques permettent l’analyse des données [Periasamy et Verkman, 1998 ; Carrero et al., 2003]. Le microscope confocal à balayage laser est bien décrit dans la littérature, Zucker [2006] discute notamment de ses performances et des éventuels biais dus à l’appareillage, et Weiss [2004] présente les artefacts relatifs aux analyses quantitatives faisant intervenir le photoblanchiment. En revanche, très peu de travaux associent la méthode FRAP à la microscopie confocale pour déterminer le coefficient de diffusion de sondes fluorescentes au sein de matériaux polymères.Conclusions de la partie 4.
Cette partie à présenté des méthodes de détermination expérimentale des coefficients de diffusion des MTA, à différentes échelles d’observation. Les principes de la mesure expérimentale à partir d’études cinétiques et d’études de profils de concentration ont été détaillés. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux méthodes d’empilements de films (selon Roe et selon Moisan) : l’analyse de ces méthodes sera poursuivie dans la suite de
nos travaux (Chapitre IV – Résultats et discussions – Partie 4). De nombreuses techniques d’analyse quantitative des diffusants permettent le calcul de D. Ces techniques nécessitent toutefois une forte concentration en molécules diffusantes pour une détection aisée. La plastification du matériau par les diffusants doit être évitée (concentration en diffusant inférieure à 1000 mg⋅kg-1 de polymère). Les techniques permettant une évaluation in situ de D sont à privilégier puisqu’elles évitent la présence de solvants.
Une méthode de mesure in situ est plus particulièrement détaillée. Elle est basée sur le retour de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) après la création d’un gradient de concentration en molécules diffusantes photo-oxydables. C’est cette technique FRAP associée à la microscopie confocale que nous tenterons d’exploiter dans nos travaux afin d’évaluer des valeurs locales des coefficients de diffusion des MTA. Les propriétés de fluorescence alliées à la réduction de l’échelle d’observation devraient nous procurer une bonne détection du signal (et une meilleure précision des mesures) et des mesures locales plus rapides (permettant l’étude de molécules de masse plus élevée ou de plus faible diffusivité).