Etude des charges virales dans le lait maternel :

4.1. Design de l’étude :

Pour compléter l’étude des charges virales dans différents compartiments, nous avons

réalisé une étude cas-témoins nichée dans la cohorte DITRAME des charges virales dans le

lait maternel. Les cas étaient les femmes qui avaient transmis le virus à leur enfant durant le

post-partum et les témoins, des femmes non transmettrices sélectionnées de manière aléatoire,

et comparable pour le site (Abidjan versus Bobo-Dioulasso) et la prophylaxie donnée (ZDV

versus placebo). La transmission postnatale a été évaluée selon les résultats de PCR tels que

définis dans le tableau 1. Les échantillons de lait ont été obtenus par expression manuelle de

l’un ou l’autre des seins, en fin de lactation à J8, J45 et J90. Ces échantillons ont été

centrifugés à 2000 g durant 10 minutes - endéans les 5 heures après la collecte - pour séparer

lipides, phase aqueuse (lactosérum) et cellules. La couche lipidique a été éliminée, le

lactosérum stocké -80°C, et les cellules stockées à -80°C sous forme de culots secs après trois

lavages PBS. Une extraction de Boom et une amplification par RT-PCR selon la technique

Amplicor (cfr infra) ont été réalisées sur le lactosérum.

4.2. Comparaison statistique des CVlm entre T et NT et entre groupes de traitement :

Les comparaisons de mesures d’ARN-VIH entre T (postnatales) et NT et entre types

de prophylaxies ont été réalisées grâce au test non paramétrique de Wilcoxon. Ensuite, une

analyse univariée a estimé les odds ratio pour la transmission postnatale pour les valeurs des

CVlm à J8 et J45 post-partum, pour les différences de valeurs entre ces deux dates, pour les

valeurs de CVpl à J8 et la valeur médiane des CD4+ à l’inclusion. Les variables associées à la

TME (p<0,25), de même que les variables d’ajustement (site et prophylaxie) ont été intégrées

POU

Figure 23 : Principe de la technique du bDNA

Hybridation des Ces et LEs à

la cible et accrochage au puit ^{Hybridation du pré-}_{plificateur au LEs}

Ajout de

Dioxitane

Hybride les sondes de

marquage aux Hybride les

pré-amplificateurs aux amplificateurs

Add Lysis Buffer Acide nucléique Ajout du Tp de lyse

Dégradation de la membrane virale, dégradation des Rnases, et libération du RNA

Hybridation de la sonde cible et capture

Etape de pré-amplification

Etape d’amplification Etape des sondes de

marquage

Génération du

signal

Hybridation des Ces et LEs à la cible et accrochage au puit Hybridation du pré-amplificateur au LEs Hybride les pré-amplificateurs aux amplificateurs

Hybride les sondes de marquage aux amplificateurs

Ajout de Dioxitane et mesure de

dans un modèle multivarié. Une autre analyse multivariée a également été réalisée de manière

a évaluer les déterminants d’un accroissement de la CVlm entre J8 et J45.

5. Techniques utilisées pour les mesures des charges virales dans les

différents compartiments :

5.1 Etude des charges virales par la technique du DNA branché (Bayer-Chiron,

Quantiplex 340

^TM

, version 3.0, E. Walpole, MA, USA) :

Cette technique a été choisie pour la mesure des CVpl essentiellement parce qu’elle

procède par sondes (17 sondes qui se fixent dans la région pol du virus), qui sont elles-mêmes

amplifiées ensuite, et non pas par RT-PCR, pour laquelle le couple d’amorces utilisées peut

parfois ne pas – ou peu – s’accrocher, et créer ainsi de faux négatifs. Cette technique permet

donc une quantification non biaisée des sous-types non B (73).

Elle procède par technique sandwich d’hybridation de l’acide nucléique. Le VIH-1 est

tout d’abord concentré par centrifugation à partir du plasma. Une fois que l’ARN génomique

est libéré des virions, il est capturé sur un support solide (micropuits) par l’intermédiaire de

sondes de capture spécifiques constituées d’oligonucléotides de synthèse (figure 23). Une

série de sondes cibles permet de réaliser l’hybridation de l’ARN viral avec les sondes

Pré-Amplificateur. Les sondes de capture composées de 17 extendeurs de capture individuels, et

les sondes cibles composées de 81 extendeurs cibles individuels, se fixent à différentes

régions du gène pol de l’ARN viral. La sonde Amplificateur s’hybride au Pré-Amplificateur

en formant un complexe d’ADN branché (bDNA).

De nombreuses copies d’une sonde marquée à la phosphatase alcaline (PA)

s’hybrident ensuite avec ce complexe immobilisé. La détection est obtenue par incubation du

complexe avec un substrat chimioluminescent. L’émission de signaux lumineux est

directement proportionnelle à la quantité d’ARN du VIH-1 présente dans chaque échantillon,

et les résultats sont enregistrés en unités relatives de lumière (RLU) par l’analyseur. Une

courbe étalon est obtenue à partir de l’émission de signaux lumineux des étalons contenant

des concentrations connues de virus traité à la bêta propiolactone (BPL). Les concentrations

en ARN du VIH-1 des échantillons sont déterminées à partir de cette courbe étalon.

La luminescence émise est directement fonction du nombre de copies d’ARN VIH-1

par ml. Une courbe sigmoïde est utilisée pour relier le logarithme des RLU à la concentration

en ARN-VIH-1. Le logiciel de gestion des données utilise les RLU et les concentrations des

six Etalons pour déterminer le meilleur tracé de la courbe, et pour calculer la concentration en

ARN -VIH-1 de chaque contrôle et chaque échantillon de patient. Les critères d’interprétation

des résultats sont les suivants :

• La valeur la plus basse donnée par le test est 50 copies/ml.

• Les échantillons dont les valeurs sont inférieures à 50 copies/ml seront indiqués

comme en-dessous de la limite du test.

• Les échantillons avec une valeur égale ou supérieure à 50 copies/ml contiennent de

l’ARN HIV-1 au taux indiqué.

• Les échantillons dont les valeurs sont supérieures à 500 000 copies/ml sont au-dessus

de la limite supérieure de quantification et doivent être dilués pour qu’une valeur

quantitative puisse être obtenue.

Cette technique a été utilisée dans sa globalité (extraction + amplification du signal après

hybridation) pour la mesure des charges virales plasmatiques au Centre Muraz, de même

qu’elle a été utilisée pour les SCV après extraction de Boom (cfr point suivant)(uniquement

amplification du signal après hybridation).

5.2. Etude des charges virales par la technique Amplicor (Amplicor HIV Monitor,

version 1.5, Roche Diagnostics Systems Inc, Branchburg, New Jersey, USA):

Cette technique a été utilisée pour le diagnostic pédiatrique, après avoir été comparée à la

technique de PCR « home made », et validée par le laboratoire de virologie de l’Hôpital

Necker-Enfants Malades, notre laboratoire de référence pour l’étude DITRAME. Après avoir

fait ses preuves pour l’étude du timing de l’infection pédiatrique, nous l’avons utilisée pour la

mesure des CVlm après extraction de Boom.

L’ARN-VIH est extrait à partir de 200 µl de liquide biologique grâce à 600 µl d’un tampon de

lyse comprenant de l’isothiocyanate de guanidium auquel est rajouté une quantité connue

d’un standard interne constitué d’un ARN de Chlamydia pouvant être amplifié par les mêmes

amorces que le VIH et d’une taille similaire. L’ARN est précipité dans de l’isopropanol et

centrifugé à vitesse maximale (au moins 12.500 g) pendant 15 minutes à température

ambiante, lavé dans 1 ml d’éthanol à 70% et resuspendu dans 400 µl de diluant. 50 µl de

solution (équivalent de 25 µl de plasma) est rajouté au Master Mix pour la réaction de

RT-PCR. Celle-ci se fait dans la région gag du génome viral. Le Master Mix est constitué de

glycérol, d’acétate de potassium et d’acétate de manganèse, de dNTPs (dATPs, dCTPs,

dTTPs, dGTPs et de dUTPs – usage d’uracile-N-glycosylase pour éviter les contaminations),

30 min à 60°C. Ensuite, la PCR a été réalisée par 4 cycles de [10 sec à 95°C ; 10 sec à 55°C ;

10 sec à 72°C], puis 26 cycles de [10 sec à 90°C ; 10 sec à 60°C ; 10 sec à 72°C], et pour

finir, 15 min à 72°C. La détection des amplicons de 142 pb VIH et du standard est réalisée par

colorimétrie après dénaturation par une solution de dénaturation, et dépôt en dilutions sériées

de raison cinq dans des micropuits « coatés » avec une sonde spécifique du VIH. La dilution

du standard ne se fait qu’une fois, dans des micropuits « coatés » avec une sonde spécifique

au standard. L’hybridation se fait pendant 60 min à 37°C. La microplaque qui contient les

produits hybridés spécifiques au VIH et au standard est ensuite lavée, et un conjugué

avidine-peroxidase rajouté pendant 15 min à 37°C. Après un nouveau lavage, un substrat composé

d’H

2

O

2

et de tétraméthylbenzidine est ajouté 10 min à température ambiante. La mesure de

densité optique (DO) peut alors se faire à 450 nanomètres après ajout d’un réactif qui permet

de stopper la réaction (H

2

SO

4

). Il s’agit ensuite de supprimer le « background » de densité

optique et de la multiplier par le facteur de dilution opérée. La formule suivante peut alors être

appliquée pour obtenir la mesure en ARN de l’échantillon considéré :

Nombre de copies d’ARN par millilitre de liquide considéré : (DO totale mesurée / DO du

standard mesurée) X nombre de copies du standard par réaction

5.3. Extraction particulière de l’ARN par la technique de Boom (Nuclisens Kit

Organon Teknika, Boxtel, NL) :

D’un point de vue technique, il a été démontré que le sperme contient des inhibiteurs

de PCR chez environ 40% des sujets testés, ce qui a justifié l’usage d’une extraction à l’aide

de silice pour les mesures d’ARN viral provenant de liquides autres que le plasma (331, 332).

Notre travail visait également à évaluer la qualité des extractions d’acides nucléiques réalisées

par cette technique.

La technique de Boom (commercialisée par Organon Teknika) profite des propriétés

de fixation des acides nucléiques par la silice ou le verre en présence d’agents chaotropiques

(333, 334).

Elle débute par une lyse par un tampon contenant de l’isothiocyanate de guanidium

(GuSCN) en présence de silice (50 µl de silice en solution étaient ajoutés à chaque

échantillon). Cette molécule GuSCN a des propriétés chaotropiques et est un agent puissant

de purification et de détection de l’ARN et de l’ADN grâce à ses capacités de lyse cellulaire

couplées à celles de potentiel d’inhibition des nucléases (335, 336).

L’ARN libéré se fixe à la silice et peut être isolé par centrifugation. Ensuite, le

complexe silice-ARN est lavé par un tampon contenant de GuSCN, puis deux fois par de

l’éthanol 70%, et ensuite par de l’acétone. Après séchage sur un bain à sec, les acides

nucléiques sont détachés à 56°C et élués dans 50 µl de tampon faiblement salin. Après

récupération, l’éluat contenant l’ARN est prêt pour l’amplification.

Nous procédions en rajoutant d’emblée le standard interne de la technique Amplicor,

puisque nous poursuivions, après extraction, par la technique d’amplification RT-PCR

Amplicor. Le fait de mettre le standard interne nous permettait de vérifier la qualité de notre

extraction de Boom. Cette technique a été utilisée pour éliminer les inhibiteurs de PCR

présent dans le lait maternel et les SCV et pour travailler sur un volume plus important que

ceux préconisés par la technique Amplicor. Dès lors, nous avons travaillé sur des échantillons

de lait maternel de 800 µl, mais des échantillons de sécrétions cervicovaginales de 20 µl à 5

ml.

6. Etude des surinfections chez l’adulte et des surinfections potentielles

Dans le document ETUDE DE DETERMINANTS DE LA TRANSMISSION DU VIH DE LA MERE A L’ENFANT AU BURKINA FASO (Page 195-200)