Description de l’étude DITRAME :

1. Description de l’étude DITRAME :

Il s’agit d’une étude clinique randomisée, en double-aveugle. Elle a commencé

d’abord par une étude de tolérance (phase II), puis fut prolongée par une étude d’efficacité

(phase III) incluant les observations de la phase II avec un suivi prolongé des patients. Le

protocole a été approuvé par les Comités d’éthique de la Côte d’Ivoire, du Burkina Faso, de

l’Hôpital Universitaire de Bordeaux et de l’ANRS.

1.1. Procédures d’inclusion :

Après counselling pré-test et signature d’un consentement éclairé, le test VIH fut

réalisé à partir d’un prélèvement de sang par un test commercial Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay (ELISA, Genelavia Mixt™, Diagnostics Pasteur, France or Murex

ICE 1-O-2™, Murex Biotech Ltd, UK). La confirmation et la discrimination VIH-1 et 2 ont

été réalisées par un test peptidique synthétique commercial ELISA (Peptilav 1-2™,

Diagnostics Pasteur). Les résultats furent donnés lors du post-test, en général après deux

semaines. Un test rapide discriminant était alors réalisé pour les femmes positives pour le

premier test (Multispot™, Diagnostics Pasteur). Les femmes qui remplissaient les critères

d'inclusion et acceptaient le principe de l'étude devaient revenir entre 36 et 38 semaines de

grossesse.

1.2. Prophylaxie ZDV ou placebo :

Les femmes inclues dans la cohorte ont reçu de la ZDV (250 mg deux fois par jour

pendant la phase II et 300 mg pendant la phase III) ou un équivalent placebo, jusqu’au début

du travail, ensuite, une dose unique per os de 500/600 mg jusqu’à l’accouchement et 500/600

mg par jour jusqu’à sept jours après l’accouchement. Aucun traitement n’a été donné au

nouveau-né.

1.3. Diagnostic PCR jusqu’à six mois et diagnostic sérologique ensuite :

Un prélèvement de sang du nouveau-né fut récolté dans des tubes microtainer EDTA

(Becton Dickinson) entre J 1 et J 8. Un à 2 ml de sang périphérique fut prélevé également à J

45, J 90 et J 180. Au laboratoire, nous avons séparé les PBMC sur gradient de Ficoll

(Histopaque™, Sigma, France). Après deux lavages PBS (phosphate buffered saline) les

cellules étaient comptées et stockées en culots secs à -70°C jusqu'à leur utilisation.

Ensuite, nous récupérions les cellules par centrifugation ; la lyse se faisait sur 10

⁷

cellules/ml avec de la protéinase K pendant 12 à 16 heures à 56°C, puis chauffage pour sa

désactivation à 95°C pendant 10 minutes. Le volume final était calculé de manière à avoir 2.5

10

⁵

cellules pour 20 µl. Une PCR nichée était ensuite réalisée avec trois couples d'amorces

spécifiques (Eurogentec™, Belgium) selon des techniques décrites par Rouzioux et al, (17).

Les régions amplifiées étaient les suivantes : gag (GAG881-882/SK38-39) et pol

(H1POL42-45/43-44 et POL001-004/002-003) du génome.

Dix µl d'amplicons après PCR nichée furent déposés sur gel d'agarose 2%, puis

visualisés sous UV après coloration au bromure d'éthidium. Tous les tests furent réalisés en

duplicate, avec des contrôles positifs et négatifs. La validation de la série testée par PCR

nichée ne pouvait être faite que grâce à un contrôle positif de la lignée 8 E5 avec un seuil de

détection de 5 copies provirales. Si l’échantillon était négatif pour l’amplification par les

amorces situées dans pol (les plus sensibles), la qualité de l’ADN était vérifiée par une PCR

HLA-DQα. La PCR était considérée comme positive si un signal positif était généré par au

moins deux des trois couples d’amorces utilisées.

Nous avons testé tous les échantillons collectés à J 180, ou plus tôt si celui de J 180

n’était pas disponible, selon ce principe. Si cet échantillon était positif, tous les échantillons

précédents étaient testés pour évaluer le « timing » de la transmission qui a été établi selon les

principes du tableau 2 (18). A Bobo-Dioulasso, les échantillons furent testés par la suite par

un test commercial qui s’est avéré aussi efficace que la PCR “maison”, et plus rapide. Il s’agit

d’un test RT-PCR à partir du plasma des enfants (Amplicor HIV Monitor™, version 1.5,

Roche Diagnostics Systems Inc, Branchburg, NJ, USA).

1.4. Diagnostic par sérologie :

A partir de 9 mois, le diagnostic s’est fait par sérologie, selon le même principe que

pour les mères (test ELISA, Genelavia Mixt™, Diagnostics Pasteur, Paris, France ou Murex

ICE 1-O-2™, Murex Biotech Ltd, Dartford, UK). La confirmation sur le même échantillon

s’est faite par ELISA (Peptilav 1-2™, Diagnostics Pasteur). Si ces tests étaient positifs et que

la PCR n’avait pas été réalisée, à partir de 15 mois, ces tests étaient également considérés

comme critère de diagnostic de l’infection pédiatrique. Les enfants qui n’avaient pas de

diagnostic PCR et ne pouvaient être suivis au-delà de six mois avaient un statut indéterminé.

1.5. Analyses statistiques de l’efficacité de la ZDV sur la diminution de la TME :

La taille de l’échantillon qui était nécessaire pour l’étude (n=780) a été calculée pour

une diminution estimée de 40% du taux vertical de transmission à six mois, pour un taux

initial de TME estimé à 25%, avec une erreur de type 1 de 5% (two-sided test), une puissance

de 90% et 20% de perdus de vue (20). Une analyse intermédiaire était prévue à partir de 500

observations. Comme les inclusions furent stoppées à partir de février 1998 (résultats de

l’étude thaïlandaise qui a montré l’efficacité de la ZDV sur la PTME), l’étude fut arrêtée

après analyse par le DSMB. Les comparaisons entre groupes furent réalisées par un test t de

Student et par un test non paramétrique de Mann-Withney pour les variables quantitatives, et

des test χ² et de Fisher pour les variables qualitatives. La probabilité d’infection à un âge

donné, de l’allaitement, et la mortalité de l’enfant ont été estimés par la technique de courbe

de survie de Kaplan-Meier et comparaison par log rank test. Un modèle multivarié de Cox a

été utilisé pour étudier l’efficacité relative de la ZDV exprimée comme 1 – le ratio aléatoire.

Dans le cas de jumeaux, un seul enfant était considéré pour l’analyse.

2. Etude des charges virales plasmatiques :

2.1. Design de l’étude :

L’étude des charges virales libres dans le sang a consisté en une étude cas-témoin

nichée dans la cohorte DITRAME. Des femmes ayant transmis le virus à leur enfant ont été

considérées comme les cas, et comparées à des femmes n’ayant pas transmis le virus. Deux à

trois contrôles furent sélectionnés par cas, comparable pour la phase de l’essai (II ou III), le

site de l’étude (Bobo-Dioulasso versus Abidjan) et la prophylaxie (ZDV versus placebo).

L’ARN VIH plasmatique a été mesuré grâce à la technique du DNA branché (bDNA) avec un

seuil de détection fixe de 50 copies/ml (Bayer-Chiron, Quantiplex 340

^TM

, version 3.0, E.

Walpole, MA, USA) (voir description de la technique en infra).

2.2. Comparaison statistique des CVpl entre T et NT et entre groupes de traitement :

Les CVpl ont été exprimées en log10 de manière à obtenir une courbe normale ; les

moyennes et écart-types ont été évaluées et des comparaisons entre T et NT et entre groupes

de traitement ont été faites par le test t de Student. Les différences absolues entre J8

post-partum et l’inclusion, et leur évolution entre ces deux dates ont été étudiées également. Les

variables décrites comme associées à la TME habituellement, et qui étaient disponibles pour

Tableau 25 : Avantages et limites des techniques de prélèvements (prélvts) SCV

Méthodes de

prélvts

Avantages Limites

Sno-strip  wick (Tampons)

Echantillons de fluides muqueux Faible volume d’échantillon (environ 8 µl)

Weck-Cel  Sponge (éponge)

Permet d’évaluer le virus libre primaire

Diminue le seuil de détection de l’ARN VIH

Volume précis L’éponge doit être pesée directement

avant et après prélvt Situation du prélvt précise

Cytobrush/swab (Ecouvillons)

Permet de collecter plus de cellules que les deux types précédents

Irrite la muqueuse Permet de détecter plus d’ARN et

d’ADN VIH que Sno-strip

Contamination sanguine à cause de l’irritation de la muqueuse

Volume peu précis

Lavage Volume important Dilution du liquide vaginal

Permet l’aliquotage Difficile à standardiser

Prélvt de virus libre comme proviral Ne permet pas une localisation du prélvt aussi précise que les autres types

Aspiration directe Pas de dilution Volume limité

Pas de biais sur le seuil de détection de l’ARN et de l’ADN viraux

Plus difficile à réaliser que les autres prélvts

Localisation précise du prélvt

notre analyse ont été intégrées à une analyse univariée, en plus des variables étudiées. Celles

associées à la TME (p <0,25) furent reprises dans une analyse multivariée.

Dans le document ETUDE DE DETERMINANTS DE LA TRANSMISSION DU VIH DE LA MERE A L’ENFANT AU BURKINA FASO (Page 187-193)