Para avaliar se os NCs dopados com Eu aplicados na maxila dos ratos se migraram para outro órgão, as imagens de fluorescência foram obtidas dos grupos tratados com NCs de TiO2. As análises mostraram que os diferentes tratamentos contendo NCs da amostra RB dopada com Európio aplicada na maxila dos ratos apresentaram diferenças estatísticas quanto a intensidade de fluorescência quando comparadas ao grupo controle e ao grupo tratado com sobrenadante dos NCs. O grupo com tratamento contendo apenas os NCs foi o que obteve maior fluorescência, acima de 2 milhões de pixels (Fig. 21-A), assim como no fígado porém com fluorescência menor que 1 milhão de pixels (Fig. 21-B). No pulmão não foi observada diferença entre o
69 controle e os tratamentos, estando a fluorescência entre os grupos em torno de 2 milhões de pixels (Fig, 21-C). No rim o grupo tratado com NCs foi o que obteve maior fluorescência (Fig. 21-D), mas não apresentou diferença estatística entre os outros tratamentos.
Figura 21 – Análise da intensidade de fluorescência nos diferentes órgãos dos ratos após aplicação de CTM-TAs e/ou NCs da amostra RB dopados com Európio na concentração de 50μg/ml. A) Intensidade de Fluorescência obtida na Maxila de ratos; B) Intensidade de Fluorescência obtida no Fígado; C) Intensidade de Fluorescência obtida no Pulmão; D) Intensidade de Fluorescência obtida no rim.
Os resultados também podem ser visualizados pelas imagens abaixo das peças anatômicas:
70 Figura 22 – Imagens da intensidade de fluorescência nos diferentes órgãos dos ratos após aplicação de CTM-TAs e/ou NCs da amostra RB dopados com Európio na concentração de 50μg/ml. A) Maxila; B) Fígado; C) Pulmão; D) rim.
A
B
C
71 A análise histológica foi realizada próximo das fossas nasais e mostrou que não ocorreu alteração em comparação ao grupo controle. Os animais que receberam os diferentes tratamentos na região da papila incisava mostraram aspectos histológicos similares ao grupo controle e ao grupo sem tratamento, ou seja, sem infiltrado inflamatório e com fibras colágenas organizadas, sem alteração em relação aos vasos sanguíneos (Fig. 23).
Figura 23 – Cortes histológicos próximo das fossas nasais dos ratos nos diferentes tratamentos onde não foi verificada alteração entre os grupos. Grupo I: controle; Grupo II: células-tronco mesenquimais associadas a 50μg/mL de NCs da amostra RB; Grupo III: 50μg/ml de NCs da amostra RB diluída em PBS; Grupo IV: sobrenadante das células-tronco mesenquimais associadas a 50μg/mL de NCs da amostra RB. Grupo V: sem tratamento.
72 Após análise histológica nos alvéolos, bronquíolos e artéria pulmonar observou- se que em nenhum dos grupos foi apresentado focos fibroblásticos e nem fibrose intersticial, conforme figura 23.
Figura 24 - Avaliação histológica de alvéolo, artéria pulmonar e bronquíolos dos grupos: Grupo I: controle; Grupo II: células-tronco mesenquimais associadas a 50μg/mL de NCs da amostra RB; Grupo
73 III: 50μg/ml de NCs da amostra RB diluída em PBS; Grupo IV: sobrenadante das células-tronco mesenquimais associadas a 50μg/mL de NCs da amostra RB. Grupo V: sem tratamento.
74 5 DISCUSSÃO
A Nanobiotecnologia é considerada a única fusão de biotecnologia e nanotecnologia pela qual a microtecnologia clássica pode ser incorporada a uma abordagem biológica molecular real. Essa nova união científica pode facilitar a pesquisa, integrando aplicações tecnológicas de ponta e nanotecnologia em questões biológicas contemporâneas [51]. Com estas perspectivas, se torna importante a utilização de nanopartículas no viés biológico. Por este motivo, esse trabalho teve como objetivo avaliar os diferentes NCs de TiO2, sintetizados pelo Instituto da Física da UFU para uso na bioengenharia tecidual, quanto ao seu potencial de aglomeração, viabilidade celular, internalização celular, migração celular e produção de metabólitos em ensaios in vitro. Após a escolha da melhor amostra de nanocristal, os ensaios in vivo foram realizados para avaliar seu comportamento quanto a localização em diferentes órgãos.
Diversos estudos, “in vitro” e “in vivo”, têm mostrado resultados promissores no beneficiamento da medicina regenerativa utilizando a terapia celular associada aos biomateriais. Independentemente da metodologia para a síntese/fabricação do
75 biomaterial, devem ser consideradas características biológicas bem aceitas como viabilidade celular (citotoxicidade), capacidade de migração e alteração tecidual. Um controle rigoroso sobre esses aspectos é uma ferramenta poderosa para modular o destino celular, orientando o comportamento e a resposta celular in vitro e in vivo. Na regeneração de um tecido danificado é necessário que o local da injúria forneça suporte à migração, proliferação e diferenciação de células indiferenciadas[52].
O ensaio do DLS foi importante para determinar a estabilidade dos aglomerados dos NCs quando dispersos em diferentes soluções. As suas propriedades físico- químicas podem tornar-se muito diferentes das propriedades dos mesmos materiais com diferentes dimensões. Assim, pode-se dizer que as propriedades dos nanomateriais de uma determinada substância dependem também do tamanho, pois determinam seu comportamento, podendo ser totalmente diferente, como se tratasse de uma nova substância [53], principalmente quando na presença ou ausência de soro, pois ele modula a eficiência de internalização e os efeitos adversos dessas NPs [54]. Os resultados referentes a amostra RB se destacaram porque os seus aglomerados dispersos em meio completo (DMEM+BSA+SFB) apresentaram uma maior estabilidade, o que é extremamente importante na sua associação às CTM-TAs com finalidades terapêuticas. Em outros trabalhos ao preparar os NCs adicionado ao BSA observou-se a estabilidade no tamanho dos aglomerados, comprovados pela análise de DLS [44, 55]. Quanto a viabilidade celular, em alguns estudos, a forma anatase promoveu maiores danos celulares com alterações morfológicas severas, como: ruptura dos filamentos de actina e da membrana celular [56]. O Comitê de Avaliação de Risco (RAC) da Agência Europeia de Produtos Químicos (ECHA) concluiu, em junho de 2017, que o TiO2 (em todas as suas formas) deve ser classificado como suspeito de ser cancerígeno humano (categoria 2) por inalação [57]. Porém, nossos resultados mostraram que a metodologia utilizada para a síntese e preparo dos NCs não promoveram nenhuma redução da viabilidade das CTM-TAs, pois a adição de peptídeos, proteínas e macromoléculas nos meios (por exemplo, albumina sérica bovina - BSA ou soro fetal bovino - SFB) indicam que os NCs se mantém em um estado disperso estável, o que também pode facilitar o contato com as células [57].
Em estudos de genotoxicidade in vitro realizados com NPs de TiO2, os pesquisadores utilizaram vários tempos de incubação, variando geralmente de 1 a mais de 24 horas e nenhuma resposta genotóxica dependente do tempo foi identificada [58].
76 Esses resultados estão de acordo com os resultados obtidos nesse estudo, onde os NCs da amostra RB tiveram um comportamento padrão de internalização pelo ensaio de localização, pois quanto maior a concentração dos NCs, maior quantidade de NCs foram detectados no citoplasma das células e sua presença não foi observada no núcleo.
Em um levantamento de estudos com NCs foi verificado que não há nenhuma pesquisa com a forma RB (rutilo-brookita), por isso há a necessidade de mais pesquisas deste nanocristal, já que essa combinação foi a que apresentou melhores resultados in
vitro nesse estudo.
O ensaio de wound healing (cicatrização de feridas) é particularmente adequado para estudos de migração direcional de células e sua regulação por interação celular com matriz extracelular (MEC) e interações célula-célula. [59, 60], envolve interações dinâmicas entre vários tipos de células, com moléculas da matriz extracelular e produção regulada de mediadores solúveis e citocinas [61]. A utilização do NC RB, na concentração de 50 μg/ml, aumentou a migração das CTM-TAs após 24 horas, o que sugere que esses NCs estimulam a secreção de fatores que podem facilitar a migração dessas células para o tecido alvo, podendo ser um componente essencial no desenvolvimento de terapêuticas aprimoradas para a regeneração tecidual.
O estudo da utilização de NCs de TiO2 associados a CTM-TA com objetivo de regeneração óssea é extremamente importante, pois pode gerar tratamentos mais eficazes, além disso alguns estudos já demonstraram um alto potencial para o design de novos biomateriais e scaffodls com base na anatomia do osso [62].
A metabolômica tem ocupado um lugar importante na bioanálise e na investigação biomédica nos últimos anos, posicionando-se como a mais recente das tecnologias “ômicas” [63]. Na análise de espectrometria de massa foi encontrado no modo positivo os componentes 437, 706 e 202 e no modo negativo o componente 339, ambos nas amostras A e AR.
A identificação dos metabólitos fosfoenfingolipídios subclasse ceramida fosfoetanolamida demonstrou que os NCs estimulam a produção de substâncias importantes para a sobrevivência e proliferação celular.
A produção de substâncias análogas às bases esfingóides pode levar a novos agentes antibacterianos, antifúngicos, anticâncer, anti-inflamatórios, imunossupressores, entre outros. Sabendo que as CTM-TAs tratadas com NCs de TiO2 produzem esses metabólitos, essa informação abre novas perspectivas para a aplicação
77 destes NCs, podendo ser futuramente utilizados como agentes antibacterianos, antifúngicos, anticâncer, anti-inflamatórios, imunossupressores, entre outros.
Já foi verificado que a maioria das células inoculadas por via intravenosa foram encontradas localizadas nos pulmões, sugerindo o aprisionamento celular nesse órgão e sendo um fator limitante para a entrega de células [64].
Nesse estudo, com a aplicação local de CTM-TAs não foi observado nenhum aprisionamento destas células no pulmão, rim ou fígado pelas imagens de fluorescência, mas sim restrita ao local da aplicação (maxila), como foi verificado pelas imagens de fluorescência, apresentando redução de efeitos secundários.
Os nanomateriais, para fins de regeneração, podem ser aplicados localmente sendo utilizados como material de enchimento ou como revestimentos de superfícies, sozinhos ou associados a células-tronco. Esses biomateriais podem influenciar o comportamento celular direcionando e induzindo diversos processos celulares, como o aumento da migração celular encontrado nesse estudo, que pode potencializar uma terapia celular, por facilitar a migração de células ao tecido alvo.
6 CONCLUSÃO
Os NCs de TiO2 das diferentes amostras (A, AR, RA e RB) e concentrações (5, 50, 100 e 200 μg) não reduziram a viabilidade das CTM-TAs, apresentaram localização citoplasmática e dispersão estável, bem como aumentaram a migração das CTM-TAs, o que pode auxiliar em uma terapia celular na medicina regenerativa. Além disso, as CTM- TAs associadas aos NCs de TiO2 liberam metabólitos identificados como fosfoenfingolipídios subclasse ceramida fosfoetanolamida, que são fundamentais para a sobrevivência e proliferação celular, bem como em processos inflamatórios e angiogênese.
Perspectivas Futuras
Identificação dos metabólitos para melhor compreensão do mecanismo de ação dos NCs, bem como novos estudos destes NCs talvez incluídos em alguma estrutura ou
79 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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