- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Maenhaut, C. (1992). Identification, caractérisation et régulation de l'expression de récepteurs contrôlant les G-protéines: les récepteurs de la thyrotropine, de l'adénosine A2 et de la sérotonine 5-HT 1D (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212926/3/9794e7b6-a6c8-493e-8fd5-f58f48e494c2.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.be).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.be).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
b -7^52
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire
Directeur : Pr J.E. DUMONT
IDENTIFICATION, CARACTERISATION ET REGULATION DE L’EXPRESSION DE RECEPTEURS CONTROLANT LES G-PROTEINES : LES RECEPTEURS DE LA THYROTROPINE,
DE L’ADENOSINE A2 ET DE LA SEROTONINE 5-HTu).
Thèse présentée en vue de Pobtention du grade de Docteur en Sciences Cmmiques
Carine MAENHAUT 1992
L< A a ■
h'A
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Nucléaire
Directeur : Pr J.E. DUMONT
IDENTIFICATION, CARACTERISATION ET REGULATION DE L’EXPRESSION DE RECEPTEURS CONTROLANT LES G-PROTEINES : LES RECEPTEURS DE LA THYROTROPINE,
DE L’ADENOSINE A2 ET DE LA SEROTONINE S-HT^).
Thèse présentée en vue de l’ohtention du grade de Docteur en Sciences Chimiques
Carine MAENHAUT 1992
C. MAENHAUT
THESE ANNEXE :
Plusieurs stratégies complémentaires peuvent être appliquées pour définir les protéines et gènes impliqués
dans la cascade mitogénique de l'AMP cyclique.
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d'abord à remercier le Prof. J.E. Dumont pour m'avoir accueillie dans son laboratoire et m'avoir donné la possibilité d'y effectuer cette thèse de doctorat. Ses conseils judicieux, ses
encouragements constants et son enthousiasme inébranlable ont permis 1'aboutissement de ce travail.
Je tiens également à exprimer toute ma gratitude au Prof. G. Vassart pour les nombreuses discussions gue nous avons eues, pour ses
suggestions pertinentes et son esprit critigue gui ont contribué de manière significative à la réalisation de ce travail.
Je voudrais aussi remercier Sylvia gui, avec sa bonne humeur
guotidienne, m'a guidée lors de mes débuts dans ce laboratoire et m'a initiée aux techniques de culture cellulaire et de Northern blotting, Martine, Isabelle, Catherine, pour leur amitié et 1'ambiance
sympathique qui règne au sein du groupe, et Claude, pour sa serviabilité constante et son amitié précieuse.
Toute ma reconnaissance va également à Jacqueline, pour la
collaboration étroite et très efficace que nous avons menée durant ces dernières années et grâce à laquelle nous avons pu ensemble avancer rapidement dans la réalisation de plusieurs parties de ce travail.
J'aimerais également associer à ces remerciements :
- Jason, Frédérick, Marc, Daniel et Marie-Jeanne dont les conseils et l'expérience m'ont été d'une aide considérable, et gui m'ont permis de démystifier le domaine de la biologie moléculaire.
- Serge Schiffmann, pour sa contribution à la caractérisation de RDC8 Stéphane, pour ses conseils en matière d'informatique; Christine Gervy, pour les dosages des hormones thyroïdiennes, et Jean-Marie Boeynaems pour ses critiques constructives lors de la rédaction des articles.
- Les Dr. E. Giraldo, E. Monferini, H. Ladinsky et A.P. Czernilofsky de la société Boehringer Ingelheim, qui m'ont fait bénéficier au sein de leur société de leur expérience pharmacologique des
récepteurs de la sérotonine. Pour sa disponibilité ainsi que pour la sympathie qu'il m'a témoignée lors de mon séjour à Milan, je tiens à remercier tout particulièrement Ettore Giraldo.
N*
- Yves, pour son aide précieuse et consciencieuse dans la culture des lignées cellulaires, ainsi que Marcel, Willy, Joseph, Johan et Naima pour le prélèvement des thyroïdes de chien.
- David et Christian pour leurs conseils en matière de radioactivité et pour les réparations de matériel.
- Cathérine, pour la dactylographie de ce travail et Danièle, pour leur gentillesse et leur serviabilité.
- Toutes les personnes gui, d'une manière ou d'une autre, ont contribué à la bonne réalisation de ce travail et à l'ambiance sympathique qui règne dans le laboratoire : Eric, Mireille, Christophe, Anne, Benoît, David, Valérie, Bernard, Fit, Marc, Marian, Thierry, Viviane, Christiane Dinsart ...
Enfin, je terminerai en remerciant ma famille pour ses encouragements, et j'aurai une pensée particulière pour André, qui m'a supportée tout au long de ce travail.
Ce travail a pu être réalisé grâce aux soutiens financiers de l'Institut pour 1'Encouragement de la Recherche Scientifique dans 1'Industrie et l'Agriculture, et du Fonds National de la Recherche Scientifique.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS
I. HISTORIQUE DU TRAVAIL... 1
1. Participation au clonage du récepteur de la TSH... 1
2. Caractérisation des récepteurs orphelins RDC4 et RDC8...5
3. Etude de la régulation des taux de iiiRNA codant pour le récepteur de la TSH...8
II. INTRODUCTION...12
1. Signalisation cellulaire... 12
2. Les récepteurs couplés aux G-protéines...17
2.1 Diversité des agonistes et des sous-types des récepteurs couplés aux G-protéines... 17
2.2 Structure des récepteurs couplés aux G-protéines.... 21
2.3 Site de liaison du ligand...22
2.4 Site d'interaction avec les G-protéines...23
2.5 Les G-protéines...25
2.5.1 Structure...25
2.5.2 Mécanisme d'action...2 6 2.6 Les systèmes effecteurs des G-protéines...28
2.7 L'arrêt du signal : désensibilisation et régulation négative de l'expression des récepteurs couplés aux G-protéines... 30
2.7.1 Désensibilisation hétérologue... 31
2.7.2 Désensibilisation homologue... 31
2.7.3 Régulation négative de l'expression des récepteurs ( "downregulation" )...33
2.8 Clonage de récepteurs orphelins... 34
2.9 Régulation de la croissance et de la différenciation cellulaires par les récepteurs à 7 domaines transmembranaires : une nouvelle classe de protooncogènes?... 35
3. Trois exemples de récepteurs couplés aux G-protéines : les récepteurs de l'adénosine, de la sérotonine et de la thyrotropine... 37
3.1 Les récepteurs de l'adénosine... 37
3.1.1 Classification des récepteurs de l'adénosine. 37 3.1.2 Action de l'adénosine et distribution des récepteurs de l'adénosine Al et A2...38
3.1.3 Clonage moléculaire et propriétés des récepteurs de l'adénosine... 39
3.2 Les récepteurs de la sérotonine... 39
3.2.1 Généralités... 39
3.2.2 Classification et structure des récepteurs de la sérotonine...40
3.2.3 Propriétés pharmacologiques des récepteurs de la sérotonine...41
3.2.4 Systèmes effecteurs des récepteurs de la sérotonine...42
3.3 Le récepteur de la thyrotropine...44
3.3.1 La thyrotropine... 44
3.3.2 Structure du récepteur de la thyrotropine.... 44
3.3.3 Relation structure - fonction...47
4. La thyroïde...50
4.1 Physiologie de la cellule folliculaire thyroïdienne. 50 4.2 Contrôle du métabolisme thyroïdien...51
4.3 Modèle in vitro de culture primaire de cellules thyroïdiennes de chien...52
III. BUT DU TRAVAIL...53
IV. METHODES EXPERIMENTALES...54
1. Culture de la lignée cellulaire Y1...54
2. Culture primaire de cellules thyroïdiennes de chien...55
3. Clonage et expression du récepteur 5-HT-j^q humain...55
3.1 Clonage et détermination de la séquence...55
3.2 Transfection des constructions pSVL-RHC4 2,3,4 dans les cellules CHO... 56
V. RESULTATS ET DISCUSSION... 58
1. Développement d'un test fonctionnel permettant la caractérisation de récepteurs couplés à l'adénylate cyclase, basé sur la réponse morphologique des cellules Y1 à une élévation du taux d'AMP cyclique (article 1)... 60
2. Identification du récepteur orphelin RDC8 comme récepteur A2 de l'adénosine (article 2)... 68
3. Identification du récepteur orphelin RDC4 comme récepteur 5-HT^^q de la sérotonine (article 3)... 79
4. Clonage et expression du récepteur 5-HT^q humain... 89
4.1 Clonage du récepteur 5-HTj^q humain... 89
4.2 Transfection permanente du récepteur dans les cellules CHO... 90
4.3 Détermination de la séquence des clones transfectés. 91 5. Régulation de l'expression du mRNA du récepteur de la TSH in vitro et in vivo, dans des thyrocytes de chien et humains et dans des tumeurs humaines (article 4 - article 5)... 94
VI. CONCLUSIONS ET RESUME... 109
VII. BIBLIOGRAPHIE 112
ABREVIATIONS
ACTH : hormone adrénocorticotropique ADN (DNA) : acide désoxyribonucléique
ADNc (cDNA) : acide désoxyribonucléique complémentaire ARN (RNA) : acide ribonucléique
ARNm (itiRNA) : acide ribonucléique messager
AMPc (cAMP) : adénosine 35'-monophosphate cyclique ATP : adénosine triphosphate
J3ARK : kinase du récepteur j3~adrénergique BME : milieu de base de Eagle
BrdU : bromodéoxyuridine
BSA : albumine sérique bovine CG : choriogonadotropine
CHA ; N®-cyclohexyladénosine
CHO : cellules ovariennes de hamster chinois CPA : N®-cyclopentyladénosine
5-CT : 5-carboxamidotryptamine C-terminale : carboxy-terminale CTX : toxine cholérique
DG : 1,2-diacylglycérol DIT ; diiodotyrosine
DMEM : modification du milieu de Eagle par Dulbecco EGF : facteur de croissance épidermique
FCS : sérum de veau foetal
FGF : facteur de croissance fibroblastique FSH : hormone folliculo-stimulante
GABA : acide gamma-aminobutyrique GDP : guanosine diphosphate
GH : hormone de croissance
GMPc : guanosine 35'-monophosphate cyclique GTP : guanosine triphosphate
GTPase : guanosine triphosphatase 5-HT : 5-hydroxytryptamine
IBMX : isobutylméthylxanthine IP3 : inositol 1,4,5-triphosphate kb : kilobase
kD ; kilodalton
KRB ; Krebs-Ringer bicarbonate LH : hormone lutéinisante
LSD : acide lysergique diéthylamide
5-MeOT : 5-méthoxytryptainine MIT : monoiodotyrosine
MMI : l-méthyl-2-mercapto-iinidazole, méthimazole NAD"*" : nicotinamide adénine dinucléotide
NECA : 5•-N-éthylcarboxamidoadénosine N-terminale : amino-terminale
8-OH-DPAT : 8-hydroxy-2-di-n-propyl-aminotétraline pb : paire de bases
PCR : réaction de polymérisation en chaîne
PDGF : facteur de croissance dérivé des plaquettes PGE]^ : prostaglandine El
PI : phosphatidylinositol
PIA : N^-phénylisopropyladénosine
PKA : protéine kinase A (dépendante de l'AMPc) PKC : protéine kinase C
PLC : phospholipase C PTU : propylthiouracile PTX : toxine pertussique
RDCX : "receptor dog cDNA niunber x"
SDS : sodium dodecyl sulfate
rT3 : reverse T3, 3,3',5'-triiodothyronine T3 : 3,5,3'-triiodothyronine
T4 : 3,3',5,5'-tétraiodothyronine, thyroxine TFMPP : m-trifluorométhylphénylpipérazine Tg : thyroglobuline
TPA ; 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate TPO : thyroperoxydase
TRH : thyrotropin releasing hormone
TSH : thyrotropine, thyroid stimulating hormone TSHr : récepteur de la thyrotropine
TSI : "thyroid stimulating immunoglobulins"
I. HISTORIQUE DU TRAVAIL
1
I. HISTORIQUE DU TRAVAIL
Le projet initial de notre doctorat consistait à étudier la régulation de la prolifération de la cellule thyroïdienne par la thyrotropine
(TSH) et la cascade de l'AMP cyclique. Ceci constituait la suite logique du mémoire, consacré à l'étude de la régulation de
l'expression du protooncogène c-myc dans les thyrocytes de chien.
Mais, à l'époque, l'objectif le plus important du laboratoire était le clonage du récepteur de la TSH. Il avait donc été décidé de
réorienter sur ce sujet une grande partie des recherches de
l'I.R.I.B.H.N. Ainsi, alors que le sujet de notre travail était à l'origine d'étudier les gènes exprimés spécifiquement lors de
l'activation de la cascade cAMP, c'est finalement sur l'étude du
premier maillon de cette chaîne, le récepteur de la TSH, qu'a démarré cette thèse de doctorat.
1. PARTICIPATION AU CLONAGE DU RECEPTEUR DE LA TSH
Plusieurs stratégies visant à cloner ce récepteur avaient déjà été poursuivies auparavant dans le laboratoire mais sans succès. Parmi celles-ci, citons le criblage d'une banque d'expression à l'aide d'autoanticorps dirigés contre le récepteur de la TSH présents chez les patients atteints de la maladie de Graves. Aucun clone
correspondant au récepteur de la TSH n'a pu être isolé par cette méthode, vraisemblablement parce que les épitopes reconnus par les autoanticorps sont de nature conformationnelle (Libert et al., 1991a);
une autre méthode utilisée a été le criblage par homologie de la même banque d'expression à l'aide de sondes d'oligonucléotides basées sur les séquences conservées des récepteurs couplés aux G-protéines (voir introduction).
En parallèle, nous avons entrepris le clonage du récepteur de la TSH en utilisant un système d'expression fonctionnelle. Il comportait la construction d'une banque de cDNA dans un vecteur de clonage
permettant une synthèse in vitro d'ARN messagers recombinants, qui devaient ensuite être microinjectés afin de tester l'expression fonctionnelle du récepteur (élévation des taux d'AMP cyclique en
réponse à la TSH). Après fractionnement par étapes de la banque, nous devions isoler finalement un clone cDNA particulier correspondant à ce récepteur. Cette méthodologie avait été mise au point et utilisée
2 avec succès lors du clonage du récepteur de la substance K (Masu et al., 1987). Dans ce cas, après microinjection des ARN recombinants dans des oocytes de Xénope, la présence du récepteur avait été
détectée par des mesures électrophysiologiques.
Cette stratégie a par la suite été utilisée par différentes équipes pour cloner d'autres récepteurs (récepteur de la sérotonine 5-HT^^ç^
(Julius et al., 1988); de la substance P (Yokota et al., 1989); de la bombésine (Spindel et al., 1990); de la TRH (Straub et al., 1990); de
la bradykinine (McEachern et al., 1991) ...). Toutefois, si elle s'avère extrêmement efficace pour cloner des récepteurs activant l'hydrolyse du phosphatidylinositol biphosphate (comme c'est le cas pour tous les récepteurs nommés ci-dessus), grâce à la grande
sensibilité des mesures électrophysiologiques, l'application de cette méthode à l'identification de récepteurs couplés à l'adénylate cyclase
s'avère peu performante. Dans le cadre du clonage du récepteur de la TSH, il nous fallait donc commencer par développer un système
d'expression analogue, rapide et si possible aussi sensible que celui des oocytes de Xénope, mais permettant d'identifier des récepteurs couplés à l'adénylate cyclase.
C'est ainsi que nous avons mis au point un test fonctionnel qui
utilise la réponse morphologique aisément détectable des cellules Yl, lignée de cellules adrénocorticales de souris (Schimmer et al., 1981) aux agents qui augmentent leur taux de cAMP (ACTH, forskoline, choléra toxine, ...) : les cellules d'aspect polyhédral et bien étalé
s'arrondissent lorsque le taux de cAMP croît. Le récepteur de la TSH étant couplé positivement à l'adénylate cyclase, nous avions donc postulé que si, par suite de la microinjection du iiiRNA correspondant,
le récepteur de la TSH s'intégrait dans la membrane de ces cellules, l'addition de TSH dans le milieu d'incubation devait provoquer cet arrondissement.
Après une première caractérisation des cellules (sensibilité à la forskoline et au cAMP, identification des récepteurs endogènes
activant l'adénylate cyclase, ...) nous avons testé l'efficacité de ce système. Pour cela, nous avons microinjecté dans les cellules Yl un ARN messager codant pour le récepteur / puis traité ces
cellules par de 1'isoprotérénol, un agoniste de ces récepteurs.
Seules les cellules microinjectées montrèrent les modifications
morphologiques typiques d'une augmentation du taux de cAMP, suggérant donc qu'elles ont été capables de traduire l'ARN microinjecté.
d'incorporer la protéine correspondante dans leurs membranes et d'effectuer un couplage avec le système Gg-adénylate cyclase.
Ces résultats sont exposés et discutés dans l'article 1 : "An efficient screening morphological test for the identification and characterization of cyclic AMP-coupled hormone receptors".
Nous avions ainsi créé un test fonctionnel sensible et rapide pour identifier l'ARN messager de tout récepteur couplé positivement à l'adénylate cyclase pour autant que ce récepteur ne soit pas exprimé naturellement dans les cellules Y1. Afin d'identifier le récepteur de la TSH, nous avons donc entamé, en collaboration avec F. Libert, le fractionnement d'ARNm poly(A) de thyroïdes de boeuf, et la
microinjection des dix fractions obtenues dans les cellules Yl, afin de repérer celle contenant un ARN codant pour le récepteur de la TSH.
Malheureusement, aucune modification reproductible n'a pu être mise en évidence en réponse à la TSH. La méthode n'est vraisemblablement pas assez puissante pour détecter les ARN messagers rares dans les
préparations obtenues. Nous étions limités par le volume maximal d'injection et par la concentration maximale d'ARN utilisable.
Des essais de microinjection dans des oocytes de Xénope, réalisés dans le laboratoire du professeur J. Rossier à Paris (Unité de Physiologie Nerveuse, CNRS, Gif-sur-Yvette) ont également été négatifs.
Entre-temps, devant l'échec de l'ensemble des tentatives de clonage, F. Libert a alors développé une nouvelle stratégie, basée cette fois sur l'homologie existant au sein des domaines transmembranaires des différents récepteurs couplés aux G-protéines connus et utilisant la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). L'amplification par PCR nécessite la synthèse de deux amorces ("primers"), adjacentes au segment d'ADN à amplifier et consiste en une succession de cycles
(étapes d'incubation de quelques minutes à une température donnée) comportant une dénaturation thermique de l'ADN, une hybridation des amorces avec leur séquence complémentaire, et une élongation des amorces hybridées en présence d'une DNA polymérase thermostable.
Chaque amorce s'hybride sur une des deux fibres d'ADN de la séquence à amplifier et leur orientation est telle que la polymérisation
s'effectue dans la région comprise entre les deux. Il en résulte ainsi une accumulation exponentielle du fragment. Dans un premier temps, F. Libert a utilisé des oligonucléotides dégénérés basés sur des séquences consensus des domaines transmembranaires III et VI des
3
4 récepteurs adrénergiques, sérotonergiques, cholinergiques
muscariniques et de la substance K, ce qui lui a permis d'amplifier sélectivement et de cloner quatre nouveaux récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux G-protéines : RDCl, RDC4, RDC7,
RDC8 (Libert et al., 1989a). Aucun d'entre eux ne présentait toutefois la spécificité d'expression tissulaire attendue pour le récepteur de la TSH. L'objectif du laboratoire étant avant tout le clonage de ce récepteur, la caractérisation des récepteurs orphelins avait alors été postposée.
Tenant compte de l'absence d'introns au niveau de la région codante, observée pour la plupart des récepteurs couplés aux G-protéines, M.
Parmentier a répété la même approche d'amplification sélective avec d'autres couples d'oligonucléotides dégénérés (correspondant aux zones transmembranaires II et VII) sur de l'ADN génomique humain. Il a
ainsi isolé onze clones codant pour des récepteurs potentiels, parmi lesquels ne se trouvait pas le récepteur de la TSH mais dont l'un présentait des caractéristiques de séquences particulières et était majoritairement transcrit dans les ovaires. Cette localisation était compatible avec 1'idée que ce clone pouvait correspondre au récepteur de la FSH ou de la LH. La grande ressemblance entre les hormones TSH, FSH et LH nous suggérait que les récepteurs de ces hormones devaient être très homologues. Ce clone FSH ou LH a alors été utilisé pour isoler d'une banque de cDNA thyroïdiens de chien, par hybridation croisée, un cDNA correspondant à un transcrit spécifique de la
thyroïde (Parmentier et al., 1989). L'identité entre ce cDNA et celui du récepteur de la TSH a été fournie grâce à son expression dans
différents systèmes. Nous avons ainsi montré que la microinjection des cellules Y1 avec son ARNm recombinant a conféré aux cellules
microinjectées un phénotype de réponse à la TSH (arrondissement suite à l'élévation des taux de cAMP intracellulaires) (Parmentier et al., 1989; article 1). L'identification fut ensuite confirmée par la microinjection de l'ARN dans des oocytes de Xénope et la mesure de l'augmentation des taux de cAMP dans ces oocytes en réponse à la TSH, ainsi que par des expériences de liaison de TSH marquée sur des
cellules Cos-7 transfectées.
Notre laboratoire étant ainsi parvenu, après de multiples
frustrations, à cloner le récepteur de la TSH, les nouvelles lignes de recherche résultant du clonage du récepteur de la TSH ainsi que des nombreux récepteurs orphelins (quatre canins et onze humains) ont été
5 partagées entre les différents chercheurs impliqués. Pour notre part, nous avons entrepris la caractérisation de deux des quatre récepteurs orphelins de chien, RDC4 et RDC8, en collaboration avec J. Van Sande, ainsi que l'étude de la régulation de l'expression du mRNA du
récepteur de la TSH. Ceci constitue l'essentiel de notre thèse.
2. CARACTERISATION DES RECEPTEURS ORPHELINS RDC4 ET RDC8
a) Identification de RDC8 comme récepteur A2 de l'adénosine
Parmi les quatre récepteurs orphelins, RDC7 et RDC8 présentent de grandes similitudes de séquence. Ils constituent une nouvelle sous- famille parmi les récepteurs couplés aux G-protéines, caractérisée par la présence d'une très courte extrémité aimino-terminale dépourvue de sites potentiels de glycosylation.
RDC8 est transcrit principalement au niveau des neurones du striatum, localisation cellulaire compatible avec celle d'un récepteur de la dopamine DI (Schiffmann et al., 1990). Nous nous sommes dès lors attachés dans un premier temps à confirmer ou à infirmer cette
hypothèse selon laquelle RDC8 pourrait effectivement correspondre à un récepteur dopaminergique. L'absence dans ce récepteur du résidu
aspartate chargé négativement dans le troisième domaine
transmembranaire, qui est conservé dans tous les récepteurs qui lient des amines cationiques, plaidait toutefois contre cette hypothèse.
Pour caractériser RDC8, nous avons utilisé le test fonctionnel que nous avions mis au point ; afin d'identifier son ligand, l'ARNm RDC8 a été microinjecté dans les cellules Y1. A notre grande surprise, ceci résulta en un arrondissement spontané des cellules injectées, avant toute addition d'agoniste dans le milieu. Supposant que ce phénomène était la conséquence de la présence de 1'agoniste du
récepteur dans le milieu d'incubation (composant du sérum, acide aminé ...), nous avons progressivement éliminé tous les éléments du milieu de culture, pour finalement travailler simplement en tampon de Krebs- Ringer bicarbonate, sans parvenir à supprimer cet effet spontané. Ces résultats suggéraient que RDC8 codait pour un récepteur qui dans les conditions expérimentales utilisées, se comportait comme un activateur constitutif de l'adénylate cyclase. Des mesures de concentrations en CAMP dans des oocytes de Xénope microinjectés par l'ARNm RDC8 avaient
6 confirmé cet effet.
Comme le cAMP est dans la cellule thyroïdienne un signal positif de fonction, croissance et différenciation, nous nous sommes intéressés à savoir si la microinjection de l'ARNm RDC8 dans des cellules
thyroïdiennes quiescentes pouvait entraîner la mise en marche du programme de mitogénèse. Les résultats obtenus montraient que les
cellules injectées entraient effectivement en phase de synthèse d'ADN.
Ce travail a été prolongé in vivo dans notre laboratoire par la démonstration que l'expression spécifique de ce récepteur dans la thyroïde de souris transgéniques induisait une hyperfonction
(hyperthyroïdie) et une prolifération cellulaire (goitre) (Ledent et al., 1992).
Toutefois, cette constitutivité du récepteur n'excluait nullement
l'existence d'un agoniste naturel, endogène, sécrété par les cellules.
Aussi, lorsque S. Schiffmann eut démontré une colocalisation
cellulaire des récepteurs de l'adénosine Al et du mRNA de RDC7, ainsi que des récepteurs de l'adénosine A2 et du mRNA de RDC8, nous avons testé et démontré dans les cellules Y1 que RDC8 codait effectivement pour un récepteur de l'adénosine A2. Nous étions finalement parvenus à éliminer une grande partie des effets morphologiques spontanés en diluant considérablement l'ARN microinjecté, et dans ces conditions, l'addition d'adénosine pouvait induire un arrondissement des cellules microinjectées, tandis que l'addition de l'antagoniste 8 p-sulfophé- nylthéophylline maintenait les cellules étalées. Des mesures
d'activité adénylate cyclase dans des membranes d'oocytes injectés avec l'ARNm RDC8 réalisées par J. Van Sande et C. Massart, ainsi que des mesures de constantes de liaison d'un agoniste A2 sélectif (CGS 21680) effectuées par F. Libert sur des membranes de cellules Cos-7 transfectées par l'ADN RDC8 ont définitivement démontré l'identité entre le récepteur RDC8 et celui de l'adénosine A2.
Ces résultats sont présentés et discutés dans l'article 2 : "RDC8 codes for an adenosine A2 receptor with physiological constitutive activity".
Par la suite RDC7 a été caractérisé comme étant un récepteur de l'adénosine Al (Libert et al., 1991b). Le fait que la plupart des cellules libèrent normalement de l'adénosine pourrait expliquer la constitutivité "physiologique" du récepteur. Toutefois, nous n'avons
pas écarté l'existence éventuelle d'une certaine "constitutivité structurelle" du récepteur.
7
b) Identification de RDC4 comme récepteur 5-HT^q de la sérotonine
La séquence du récepteur RDC4 présentant une forte homologie avec celle du récepteur de la sérotonine 5-HT-|^^ (Libert et al., 1989a), nous avons abordé la caractérisation de ce récepteur en microinjectant l'ARN messager correspondant dans les cellules Yl, et en examinant la sensibilité des cellules injectées à la sérotonine. De fait, la
sérotonine induisait dans les cellules microinjectées la réponse
morphologique typique conséquente à l'élévation des taux de cAMP. Des mesures d'augmentation des taux de cAMP en réponse à la sérotonine réalisées par J. Van Sande et C. Massart dans des cellules Cos-7 transfectées par l'ADN RDC4 ont confirmé nos résultats de
microinjection. Le sous-type exact de récepteur de la sérotonine auquel appartenait RDC4 a ensuite été déterminé en établissant le profil pharmacologique de ce récepteur après transfection transitoire de l'ADN dans des cellules Cos-7. Les études de la liaison de [^H]- LSD et de son déplacement par divers agonistes et antagonistes plus ou moins sélectifs des différents sous-types connus de récepteurs de la
sérotonine ont été d'abord réalisées dans le laboratoire, en
collaboration avec J. Van Sande et C. Massart, et ensuite précisées lors d'un séjour à Milan, au sein de la société Boehringer Ingelheim, en collaboration avec E. Giraldo, E. Monferini et H. Ladinsky. Cette collaboration a permis, grâce à la disponibilité à Milan de composés auxquels nous n'avions pas accès commercialement, ainsi que grâce à l'expérience et à la connaissance de ces chercheurs du domaine
complexe que constituent les récepteurs de la sérotonine, de démontrer que le profil pharmacologique de notre récepteur RDC4 correspondait au profil attendu pour le sous-type 5-HT^^q.
Ces résultats sont présentés et discutés dans l'article 3 : "The orphan receptor cDNA RDC4 encodes a serotonin receptor".
Ce récepteur présente un grand intérêt médical dans la mesure où le siimatriptan, meilleur médicament antimigraineux, en est un agoniste relativement spécifique. Le clonage du récepteur 5-HT^p de chien ouvre évidemment la porte au clonage de son équivalent humain, qui intéresse davantage les pharmacologues. C'est ce travail que nous
avons entrepris dans la dernière partie de notre thèse de doctorat.
La publication par Hainblin et Metcalf de la séquence du récepteur 5-HT]^q humain, cloné par analogie avec notre récepteur canin, nous a grandement facilité le travail puisqu’il suffisait dès lors de
recloner ce récepteur en effectuant une réaction de polymérisation en chaîne sur de l'ADN génomique humain, avec des amorces correspondant au début et à la fin de la région codante de la séquence du récepteur
publiée. Le clonage du récepteur 5-HT^q humain est présenté à la suite de l'article 3. Il nous ouvre la voie d'une pharmacologie détaillée.
8
3. ETUDE DE LA REGULATION DES TAUX DE mRNA CODANT POUR LE RECEPTEUR DE LA TSH
Les clonages des récepteurs de la TSH de chien (Parmentier et al., 1989) et hiimain (Libert et al., 1989b) nous ont permis de disposer de sondes pour explorer le contrôle de l'expression des mRNA
correspondants, par Northern blotting. La régulation des taux de mRNA du récepteur de la TSH a été étudiée in vivo chez le chien et in vitro dans des cultures primaires de cellules thyroïdiennes de chien et
hiimaines, et comparée à la régulation de deux autres marqueurs de différenciation thyroïdiens : la thyroglobuline (Tg) et la
thyroperoxydase (TPO). Chez le chien in vivo, un traitement chronique au méthimazole et au propylthiouracile ne modifie pas les taux de mRNA du récepteur de la TSH tandis qu'il augmente les taux de mRNA Tg et TPO. Ces agents, en inhibant la synthèse et donc la sécrétion des hormones thyroïdiennes, relèvent l'inhibition que ces dernières
exercent sur la sécrétion de TSH par l'hypophyse et donc augmentent le taux circulant de TSH et la stimulation de la thyroïde. Des chiens traités à l'hormone thyroïdienne T4, qui inhibe la sécrétion de TSH et donc inactive la thyroïde, présentent des taux normaux de mRNA du
récepteur de la TSH mais diminués de mRNA Tg. La cellule thyroïdienne ne régule donc pas de manière importante l'expression du mRNA du
récepteur qui la contrôle, en fonction du niveau de stimulation in vivo.
La même conclusion générale peut être tirée des expériences de
cultures primaires de cellules thyroïdiennes de chien et humaines. Un traitement dédifférenciant les thyrocytes de chien par l'epidermal growth factor (EGF) ou les esters de phorbol (TPA) diminue les taux de
9 mRNA du récepteur de la TSH et abolit presque totalement les taux de mRNA Tg et TPO. Le mRNA du récepteur de la TSH reste néanmoins
présent dans toutes les conditions testées, en accord avec le fait que les thyrocytes peuvent par la suite répondre à l'hormone par une
redifférenciation. Bien que le mRNA du récepteur de la TSH soit dans l'ensemble peu modulé, nous avons cependant montré qu'il augmentait transitoirement en réponse à 20 heures de stimulation par la TSH. Cet effet est reproduit par la forskoline, activateur général de
l'adénylate cyclase, suggérant donc que le cAMP en est le médiateur.
Cette régulation positive ("upregulation") s'observe également au niveau de la protéine elle-même : dans des cellules prétraitées à la forskoline, la réponse en cAMP et la capacité à lier la TSH marquée sont augmentées lors d'une stimulation ultérieure par la TSH. Par contre un traitement plus chronique (plusieurs jours) à la TSH conduit à une légère régulation négative ("downregulation") du mRNA du
récepteur de la TSH dans les thyrocytes de chien, mais pas dans les thyrocytes humains. Cette absence de désensibilisation de la cellule thyroïdienne humaine in vitro est en accord avec les données cliniques montrant une hyperthyroïdie persistante suite à l'activation continue du récepteur par des autoanticorps appelés TSI (Thyroid Stimulating Immunoglobulins) dans la maladie de Graves ou par la TSH elle-même dans le cas d'adénomes sécrétant de la TSH.
La conclusion principale de ce travail est donc que l'expression du récepteur de la TSH est quasiment constitutive et modérément modulée.
Ce fait correspond à une logique physiologique ; le récepteur de la TSH est la seule connexion de la cellule au réseau de régulation dans laquelle elle est insérée : c'est l'adresse de cette cellule dans le réseau et il est important, étant donné le rôle physiologique
fondamental de cet organe, que cette adresse soit préservée quelles que soient les circonstances. Nous pouvons aussi en conclure que le récepteur de la TSH est l'élément clé de la différenciation puisque c'est lui qui par l'intermédiaire de l'AMP cyclique va commander l'expression des autres marqueurs de différenciation.
Ces résultats sont présentés et discutés dans l'article 4 : "In vitro and in vivo régulation of thyrotropin receptor mRNA levels in dog and human thyroid cells".
Cette étude de la régulation du mRNA du récepteur de la TSH a été étendue à des tumeurs humaines. A l'époque (1990), G. Brabant, un
10 chercheur allemand de l'Ecole de Médecine de Hanovre, était venu séjourner huit mois dans notre laboratoire, afin d'apprendre la technique du Northern blotting. Nous avons donc travaillé ensemble d'abord sur les thyrocytes en culture, puis nous avons entrepris l'étude de l'expression du mRNA du récepteur de la TSH sur des
échantillons de thyroïdes prélevés chirurgicalement à Bruxelles et à Hanovre, et nous l'avons confrontée aux résultats d'anatomie
pathologique. Des tumeurs de nature diverse ont été étudiées : depuis le nodule autonome, bénin et bien différencié (adénome
hyperfonctionnel) jusqu'au cancer anaplasique métastatique et
totalement dédifférencié, en passant par les carcinomes folliculaires et papillaires (cancers différenciés). Les résultats obtenus montrent que l'expression du mRNA du récepteur de la TSH persiste dans tous les tissus et tumeurs thyroïdiennes différenciés examinés; elle est
parfois diminuée mais reste malgré tout très significative dans les carcinomes folliculaires et papillaires, tandis qu'elle disparaît dans les cancers anaplasiques.
L'expression du mRNA du récepteur de la TSH est conservée beaucoup plus longtemps durant le processus de transformation que celle des mRNA Tg et TPO, déjà fortement réduite dans certains carcinomes
papillaires et folliculaires. Ainsi, dans la progression cancéreuse chez l'homme comme précédemment in vivo chez le chien et in vitro dans des thyrocytes en culture, l'expression du mRNA du récepteur de la TSH est robuste, quasiment constitutive et semble être le dernier
caractère de différenciation qui subsiste. Par ailleurs, ces
résultats donnent une justification théorique à la thérapeutique des tumeurs thyroïdiennes différenciées par les hormones thyroïdiennes qui réduisent les taux de TSH sérique, et expliquent en outre
l'inefficacité de ce traitement dans les carcinomes anaplasiques.
Ce travail, réalisé en collaboration avec G. Brabant, est présenté et discuté dans l'article 5 : "Human thyrotropin receptor gene:
expression in thyroid tumors and corrélation to markers of thyroid différentiation and dedifferentiation".
Il est actuellement poursuivi par G. Brabant à Hanovre dans deux
directions : d'une part, vers l'utilisation de l'expression du mRNA du récepteur de la TSH dans des tumeurs thyroïdiennes opérées comme
critère d'un traitement aux hormones thyroïdiennes, et d'autre part, vers l'utilisation des taux d'expression du mRNA du récepteur de la
TSH comme test pronostique de 1'évolution des tumeurs.
11
En conclusion, nous avons donc, au cours de ce travail :
- mis au point une méthode d'identification de récepteurs couplés à l'adénylate cyclase qui nous a permis d'identifier le récepteur de la TSH;
- identifié par cette méthode puis caractérisé les récepteurs de l'adénosine A2 et de la sérotonine 5-HTj^q de chien;
- cloné le récepteur 5-HTj^q hximain;
- défini le contrôle de l'expression du récepteur de la TSH in vivo chez le chien, in vitro dans des cultures primaires de thyrocytes de chien et humains, et enfin, en collaboration avec G. Brabant, in vivo dans du tissu thyroïdien humain normal et pathologique.
II. INTRODUCTION
12
II. INTRODUCTION
1. SIGNAUSATION CELLULAIRE
Les cellules d'un organisme multicellulaire doivent communiquer les unes avec les autres afin de réguler leur développement et leur organisation au sein des différents tissus, de contrôler leur croissance et de coordonner leurs fonctions.
La communication se fait en général par sécrétion par certaines cellules de molécules spécifiques qui agissent comme signal sur d'autres cellules de l'organisme. Plusieurs types de communication intercellulaire et de signaux peuvent être distingués, selon la distance entre cellule émettrice et cellule cible :
- les signaux endocrines : des cellules spécialisées sécrètent des hormones qui sont véhiculées par la circulation sanguine jusqu'à leurs cellules cibles;
- les signaux paracrines : les cellules sécrètent des médiateurs
chimiques locaux, agissant uniquement sur les cellules situées dans leur environnement immédiat (jusqu'à environ 1 mm);
- les signaux synaptiques (dans le système nerveux) : les cellules sécrètent des neurotransmetteurs au niveau des synapses, qui agissent exclusivement sur la cellule postsynaptique (à environ 50 nm). La plaque motrice musculaire, interface entre le nerf moteur et la cellule musculaire, peut être considérée comme une
structure du même type.
La cellule cible répond au signal extracellulaire par l'intermédiaire de protéines spécifiques : les récepteurs, qui lient la molécule
signal et initient la réponse intracellulaire. Une molécule,
physiologique ou pharmacologique qui se lie à un récepteur et l'active est appelée un agoniste de ce récepteur. Toute interaction entre un signal extracellulaire et un récepteur entraîne une première réponse (formation d'un signal intracellulaire, phosphorylation, activation d'un gène ...) qui a de multiples conséquences en série et en
parallèle. L'ensemble de ces relations cause-effet est appelé cascade de régulation. Certains signaux, en général des molécules petites et hydrophobes, comme les hormones stéroïdes, thyroïdiennes ou l'acide
III IV
CSF-1-R
Figure II.1
Représentation schématique des sous-classes de récepteurs à activité protéine tyrosine kinase. (Kl : kinase insert; PTK : protein tyrosine kinase) (Ullrich et Schlessinger, 1990)
13 rétinoïque, traversent la membrane plasmique et activent des
récepteurs cytosoliques ou nucléaires. Ainsi activés, ces récepteurs se lient à des séquences particulières au niveau de l'ADN et régulent la transcription de différents gènes (Rousseau 1984). Par contre, d'autres signaux, en général des molécules hydrophiles
(neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance), activent des récepteurs localisés à la surface de la cellule cible, dans la
membrane plasmique.
Les récepteurs membranaires peuvent être classés en différentes catégories :
1. les récepteurs multimériques formant un canal ionique (récepteur nicotinique de l'acétylcholine, de l'acide gamma-aminobutyrique
(GABA^), du glutamate, de la glycine, 5-HT3 de la sérotonine, ...).
Les différentes sous-unités des récepteurs de cette famille qui ont été clonées présentent des homologies de séquence et possèdent 4 zones transmembranaires. Ces récepteurs sont principalement
localisés au niveau des synapses (Numa, 1989; Derkach et al., 1989;
Dingledine et al., 1990).
2. les récepteurs aux facteurs de croissance, à une seule région transmembranaire, dotés d'une activité protéine tyrosine kinase intrinsèque : récepteurs de l'EGF (epidermal growth factor), du PDGF (platelet-derived growth factor), du FGF (fibroblast growth factor), de l'insuline, .... Ces récepteurs possèdent un domaine extracellulaire glycosylé qui contient le site de liaison du
ligand, une région transmembranaire hydrophobe, et une région cytoplasmique contenant le domaine catalytique (Ullrich et
Schlessinger, 1990). Sur base de similarités de séquences et de caractéristiques structurales distinctes, plusieurs sous-classes peuvent être définies (figure II. 1). La sous-classe I est
constituée de récepteurs monomériques, comme le récepteur de l'EGF, et est caractérisée par la présence de deux régions riches en
cystéines dans le domaine extracellulaire. La sous-classe II, comportant également ces séquences riches en cystéines, et dont fait partie le récepteur de l'insuline, est constituée par des récepteurs hétérotétramériques (03/ fi2) dont les sous-unités sont reliées par des ponts disulfures. Les récepteurs appartenant aux sous-classes III (récepteur du PDGF) et IV (récepteur du FGF) possèdent quant à eux des répétitions "immunoglobulin-like" dans
leur domaine extracellulaire et ont la particularité d'avoir leur domaine catalytique interrompu par une insertion hydrophile d'une
centaine d'acides aminés.
La liaison du facteur de croissance à un récepteur des sous-classes I, III et IV provoque leur dimérisation (Schlessinger, 1988). Les récepteurs de la sous-classe II peuvent être considérés comme
"prédimérisés". L'activation des récepteurs par la liaison du ligand et, pour les récepteurs des sous-classes I, III, IV, leur dimérisation, stimule leur fonction kinase, ce qui conduit à une phosphorylation sur les groupements tyrosyls de diverses protéines
substrats, mais également à une autophosphorylation sur résidus tyrosyls des récepteurs eux-mêmes. Les protéines substrats
possèdent généralement des capacités de signalisation intracellulaire. Dans le cas du récepteur de l'EGF ou de
l'insuline, les sites d'autophosphorylation sont localisés dans l'extrémité carboxy-terminale (Yarden et Ullrich, 1988; Carpenter et Cohen, 1990). Le récepteur du PDGF possède quant à lui un site d'autophosphorylation situé dans l'insertion du domaine kinase
ainsi qu'un autre situé dans le domaine kinase lui-même (Ullrich et Schlessinger, 1990). En plus de ces phosphorylations sur résidus tyrosyls, on observe également des phosphorylations sur sérines et thréonines, suggérant que d'autres protéines kinases sont
impliquées dans la régulation de la fonction de ces récepteurs (Sibley et al., 1987).
Plusieurs substrats des récepteurs à activité tyrosine kinase ont été identifiés, parmi lesquels la phospholipase Cy, dont la
phosphorylation peut être induite en réponse au PDGF ou à l'EGF, la phosphatidylinositol 3-kinase, la protéine ras GAP (GTPase
activating protein) et le protooncogène c-raf (Ullrich et
Schlessinger, 1990; Carpenter et Cohen, 1990). L'identification de ces substrats a été facilitée par le fait que la plupart
s'associent aux récepteurs activés. Cette association a lieu entre les tyrosines autophosphorylées des récepteurs et des domaines
spécifiques présents dans les substrats, les domaines SH2 (src homology région 2), qui reconnaissent et lient les segments
peptidiques contenant les tyrosines phosphorylées. Cette liaison permet la phosphorylation de ces substrats par le site catalytique du récepteur (Heldin, 1991; Koch et al., 1991).
La transduction du signal implique donc une cascade de protéines 14
15 kinases. Après la liaison du facteur de croissance, on observe par ailleurs et indépendamment de la fonction de transduction, une
agrégation de ces récepteurs qui sont ensuite internalisés, ce qui permet le détachement et l'hydrolyse de l'agoniste. Certains, comme le récepteur de l'EGF, sont dégradés, tandis que d'autres, comme le récepteur de l'insuline, sont recyclés à la surface
cellulaire. Les déterminants structuraux qui définissent le type de mécanisme impliqué sont contenus dans le domaine cytoplasmique
(Riedel et al., 1989).
3. des récepteurs dont le domaine catalytique est une protéine sérine kinase; celui de l'activine vient d'être caractérisé (Attisano et al., 1992).
4. les récepteurs à une zone transmembranaire dépourvus d'activité tyrosine kinase : récepteur de l'interféron y (Arguet et al., 1988), du "tumor necrosis factor" (TNF) (Shall et al., 1990) ... Fait également partie de cette catégorie la famille des récepteurs dits hématopoïétiques, comprenant les récepteurs de l'érythropoiétine et de différentes cytokines (interleukines 2,3,4,6,7) (Cosman et al.,
1990), le récepteur de l'hormone de croissance (GH) (Leung et al., 1987), et celui de la prolactine (Boutin et al., 1988). Pour la plupart de ces récepteurs, les mécanismes de transduction n'ont pas encore été définis. Il se pourrait qu'ils agissent en activant des protéines tyrosines kinases du cytosol.
5. les récepteurs potentiels à activité tyrosine phosphatase (CD45 (leucocyte common antigen), LAR (leucocyte common antigen-related protein), DLAR (drosophile LAR)) qui contrôlent l'état de
phosphorylation de protéines relais intracellulaires mais pour lesquels aucun ligand n'a encore été identifié jusqu'à ce jour
(Fischer et al., 1991).
6. les récepteurs à activité guanylate cyclase intrinsèque (récepteur de l'ANP : atrial natriuretic peptide) qui catalysent la formation de cGMP au départ du GTP (Schulz et al., 1989). Ces récepteurs sont monomériques et contiennent un domaine extracellulaire liant l'hormone, une hélice intramembranaire et un domaine catalytique intracellulaire.
16 7. les récepteurs monomériques à 7 domaines transmembranaires couplés
à des protéines régulatrices liant les nucléotides guanyliques (G- protéines). Cette catégorie de récepteurs, qui constitue
probablement la famille la plus nombreuse et la plus diversifiée, active ou inhibe via ces G-protéines des enzymes effecteurs divers tels que adénylate cyclase, phospholipase C, phospholipase A2, phosphodiestérase hydrolysant le GMP cyclique, ou canaux ioniques
(Ca'^'^, K"*") (voir plus loin).
Etant donné que plusieurs d'entre eux ont été l'objet de ce travail, nous allons à présent détailler les principales caractéristiques de ces derniers récepteurs.
2. LES RECEPTEURS COUPLES AUX G-PROTEINES
17
2.1 Diversité des agonistes et des sous-types des récepteurs couplés aux G-protéines.
Les agonistes capables d'interagir avec ces récepteurs sont extrêmement diversifiés : neurotransmetteurs (noradrénaline, sérotonine, adénosine, acétylcholine, dopamine, ...), hormones peptidigues (ACTH, vasopressine, TRH ...) ou glycoprotéigues (TSH,
FSH, LH), peptides à action locale (bombésine, bradykinine, substances P, K ...), molécules diverses perçues par nos organes olfactifs
(odeurs) ou encore le rétinal inséré dans son récepteur, la
rhodopsine, et dont le changement de structure à la captation d'un photon active ce récepteur (vision). La table II.1 reprend, à titre d'information, une liste de ces récepteurs en 1991, ainsi gue des G- protéines et des systèmes effecteurs auxguels ils sont couplés.
A un signal extracellulaire donné correspondent généralement plusieurs récepteurs différents : initialement l'existence de ces sous-types avait été proposée sur base de propriétés pharmacologiques (constantes de liaison différentes pour divers agonistes ou antagonistes) ou
biologiques (systèmes effecteurs activés différents). Récemment, l'application des techniques de biologie moléculaire a confirmé l'existence de ces sous-types et révélé l'existence de sous-types supplémentaires, produits de gènes différents. Il est ainsi apparu que la complexité de ces récepteurs était nettement plus importante que celle que l'on soupçonnait sur base d'identifications
pharmacologiques. Alors qu'au départ, quatre types de récepteurs adrénergiques a-^r «2' ^1 ^2 avaient été définis
pharmacologiquement, le clonage de ceux-ci (Dixon et al., 1986;
Kobilka et al., 1987; Frielle et al., 1987; Emorine et al., 1987;
Cotecchia et al., 1988) a permis le clonage par homologie de plusieurs nouveaux sous-types de ces récepteurs (Kobilka et al., 1987a; Regan et al., 1988; Schwinn et al., 1990; Lomasney et al., 1990).
De même, les récepteurs muscariniques, initialement subdivisés sur base de leur propriétés pharmacologiques en sous-types Ml (Kubo et al., 1986) et M2 (Peralta et al., 1987a) comportent actuellement au moins 5 sous-types (m^^-m^) identifiés par clonage moléculaire (Peralta et al., 1987b; Bonner et al., 1987; Liao et al., 1989). Citons encore l'exemple des récepteurs dopaminergiques (Civelli et al., 1991), qui classiquement étaient subdivisés en DI et D2, en fonction de leurs
18 propriétés pharmacologiques et biologiques (l'un activant et l'autre inhibant l'adénylate cyclase), et dont le clonage (Bunzow et al., 1988; Dearry et al., 1990; Zhou et al., 1990; Sunahara et al., 1990;
Monsma et al., 1990) a également fait découvrir la diversité. Celle- ci se traduit par la mise en évidence de nouveaux récepteurs D3, D4, D5 (Sokoloff et al., 1990; Civelli et al., 1991; Grandy et al., 1991), d'un sous-type de récepteur DI (Tiberi et al., 1991) ainsi que de deux isoformes du récepteur D2. Ces deux isoformes résultent d'une
insertion de 29 acides aminés dans la troisième boucle cytoplasmique (voir plus loin), séquence codée par un seul exon, et sont générées par épissage alternatif (Giros et al., 1989; Monsma et al., 1989; Dal Toso et al., 1989).
