Ciblage dynamique et différentiel des complexes Polycomb au cours du Développement de Drosophila Melanogaster

Texte intégral

(1)UNIVERSITE MONTPELLIER I THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER I Discipline : Biologie cellulaire et moléculaire Ecole Doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé. Anna Delest Ciblage dynamique et différentiel des complexes Polycomb au cours du développement de Drosophila melanogaster présentée et soutenue publiquement le 30 novembre 2012 JURY. Mme Florence Maschat Présidente du jury. Mme Frédérique Peronnet Rapportrice. Mr Slimane Ait-Si-Ali Rapporteur. Mr François Roudier Examinateur Mme Anne-Marie Martinez Co-directrice de thèse Mr Giacomo Cavalli Directeur de Thèse.

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(3) Journal de bord d’une Petite Humaine Déjantée Difficile de dormir ces derniers jours, cela va faire maintenant quatre ans que j’ai embarqué à bord du vaisseau Cavalli et dans quelques mois je rejoins la terre. Alors, je m’impatiente et en même temps je suis un peu triste car c’est bientôt la fin d’une belle aventure. Il faut le dire, ces dernières années ont été riches pour moi. J’ai pu découvrir de nombreuses planètes, éviter quelques météorites, mais surtout j’ai pu faire de merveilleuses rencontres. Tout a commencé par un entretien avec Giacomo, le capitaine de ce vaisseau. C’est à la suite de la plus longue discussion de toute ma vie que j’ai rejoint l’équipage de cet engin spatial. « Ma possibile » qu’il aime parler ce capitaine !!! C’est un passionné, quelqu’un que l’on ne comprend pas toujours, mais à coté de qui l’on apprend beaucoup. C’est un vrai capitaine. Dans le vaisseau, l’équipage se distribue dans deux modules. Dans celui où j’ai été affectée, j’ai pu faire la connaissance de sacrés spécimens. Tout d’abord, Anne-Marie, c’est le satellite de ce vaisseau, c’est elle qui capte l’ensemble des signaux en provenance du vide intersidéral et nous montre alors la voie à emprunter. Il y’a aussi Manu, « che bella », indescriptible en quelques mots, il faudrait lui consacrer un roman, une bande dessinée ou un film en 3D, un sacré « petit » bout de femme. J’ai découvert le géant Samy, toujours de bonne humeur avec un cœur énorme, c’est simple il me suffit de fermer les yeux, de penser à lui et je peux l’entendre rire, « sukran sadiqi ». J’ai aussi fait la connaissance de Tomy, notre Scoubidou bidou, il s’est chargé de ma culture durant toutes ces années, sans lui je ne connaitrais certainement pas les Bananarama, The rocky horror picture show et surtout grâce à lui « I have an opinion ». Et puis il y’a eu la rencontre de mon Bernd « Mein Liebling », ma force tranquille, notre poète capable de faire rimer pull avec Avril. Hé ben oué ! une aventure sans histoire d’amour aurait été bien fade. Dans ce module, il y’a aussi eu Benji, un camélon : informaticien le matin, bouddhiste à midi, rêveur à 4h, rockeur à minuit et paparazzi le samedi. Maintenant notre ordinateur de bord c’est Aubin notre « Hal 9012 », c’est lui qui traite toutes les données que je rapporte de mes missions dans l’espace. Et enfin Cloé la première terrienne à avoir eu un bébé dans l’espace. Dans le deuxième module, on retrouve le reste de l’équipage. Tout d’abord Fred mon premier instructeur. En effet ma première mission à bord fût d’observer les étoiles et c’est Fred qui m’a tout appris sur la localisation et la pêche de ces petits foyers lumineux. Fred est un homme sage, en tout premier lieu parce qu’il est normand ! mais surtout parce qu’il a une extrême patience et qu’il sait écouter. Dans ce module on retrouve un autre Bernd, « Mein vorbild », à ses côtés j’ai énormément appris et en particulier sa fameuse recette du découpage de pommes de terre en fines lamelles !!!.

(4) Avant de quitter le vaisseau, il me dévoilera peut être sa botte secrète : le « Zwei minuten, Fertig ». La seule « chica » de ce module, c’est Inma, « una Guapa revolucionaria », une merveilleuse amie avec ça. J’ai aussi fait la connaissance de Julio, celui là « si no existieras te inventaria », il a toujours été là pour moi, il m’a sortie de pas mal de galères et c’est toujours avec lui que je partage la dernière bière. Chaque milli secondes de nos aventures sont enregistrées et pour cela c’est Thierry notre cameraman qui s’en charge. Enfin dans ce module il y’a « don » Nicola tout droit sorti d’un film de Francis Ford Copolla. Depuis peu, nos modules ont été transférés dans une aile plus moderne du vaisseau, fort heureusement pour moi car mon ancien bureau dans la salle des machines était infesté de scolopendres géantes qui me mordaient les pieds. Avec ce changement on a pu accueillir de nouveaux arrivants. En premier lieu, Philip, an Amaziiiiiiing guy !!! le MacGyver du vaisseau, notre chasseur de poisson austral. Son acolyte, c’est Fillipo le futur « Casanova » de l’espace. Ensuite la « dulce » Terezita qui de son sourire te ferait même oublier que tu viens de manger « un chile verde ». Enfin Caroline la petite nouvelle, j’espére avoir le temps de la découvrir avant mon départ, car avec celle là, j’ai cru comprendre que ça déménage. Ca n’est pas tout, car le vaisseau abrite un autre petit organisme. En effet, l’énergie nécessaire pour le système de propulsion est produite par une espèce bien particulière de mouche que l’on élève à bord. Il s’agit de Drosophila melanogaster, c’est elle qui va fournir toute l’énergie nécessaire pour le vaisseau. Voilà donc tout l’équipage au complet. Bon c’est vrai je me suis bien amusée, mais si j’ai connu des moments merveilleux j’ai aussi vécu des moments terribles. Heureusement, quand ca n’allait plus, je pouvais désamarrer ma capsule et aller rejoindre les zinzins de l’espace. En d’autres termes les potes. Eux aussi propulsés dans l’espace de l’âge adulte avaient tout comme moi besoin de décompresser. Je ne pourrais jamais en quelques lignes parler d’eux et décrire comme il se doit tout l’amour que j’ai pour eux. Ils ont en commun d’être beaux, intelligents avec pour chacun leur petite dose d’excentricité, celle que j’ai tout de suite captée ! Chez ces demoiselles, on retrouve ma Muse la plus jolie des fleurs de mon jardin ; Julienancy ma grande compagne de galère ; Eno la plus « foufou » d’entre nous ; Sweet Adeline ou mamie coug pour les intimes ; Lucie in the sky un petit bou de chou à qui il vaut mieux ne pas chercher des noises et Matit normande que j’ai un peu délaissée ces dernières années. Chez ces messieurs, y’a Mimi, lui et moi, on a raté une grande carrière de JO au Club Med ; Brendan mieux connu des services de police sous le pseudonyme de «froteman» ; le copain Pierro qui pose une main en haut d’ min dos et puis Jaco « too sexy for my cat ». Durant tout ce temps en orbite, ma famille restée sur terre m’a énormément manqué. Heureusement tout au long de ces années je recevais des petits coffrets envoyés par ma mère, mon.

(5) père, ma sœur, mon frère, mon neveu, mes tantes, mes oncles, mes cousines et cousins, mes grands mères et mon grand père. Dans ces précieux coffrets se trouvaient tout plein d’amour, de réconfort, d’aide, d’humour et de conseils. Malgré la distance, ils m’ont donc tous suivie de leur affection et de leur bienveillance. Je suis faite d’un petit peu de chacun d’eux et j’en suis sacrément fière. Voilà donc ici présentes toutes les personnes qui m’ont permis de réaliser cette odyssée, sans eux rien n’aurait été possible, je tiens donc à tous les remercier très sincèrement pour leur aide, leur amitié ou leur amour..

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(7) Table des Matières Liste des Tables et Figures............................................................................................................................................. 1 Abréviations........................................................................................................................................................................ 3 Avant-propos...................................................................................................................................................................... 5. INTRODUCTION........................................................................................... 9 Partie I : Structure de la chromatine...............................................................11 1. La molécule d’ADN................................................................................................................................................... 11 2. Histones et formation du nucléosome.............................................................................................................. 12 3. Structures d’ordre supérieur.................................................................................................................................14. Partie II : Chromatine et régulation de l’expression génique ....................17 1. Régions régulatrices de l’ADN............................................................................................................................... 17 2. Modifications post-traductionelles des histones...........................................................................................20 3. Communication et combinaisons des marques histones...........................................................................29 4. Les variants d’histones.............................................................................................................................................32 5. Domaines chromatiniens.......................................................................................................................................34 6. Complexes de remodelage des nucléosomes................................................................................................36 7. Réplication et maintien des marques épigénétiques..................................................................................39. Partie III : Polycomb et Trithorax : un système de mémoire cellulaire .... 45 1. Les gènes homéotiques..........................................................................................................................................45 2. Identification des gènes du PcG et du trxG.....................................................................................................47 3. Diversité des protéines trithorax et de leurs complexes.............................................................................49 4. Les complexes Polycomb et leurs activités biochimiques.........................................................................51 5. Recrutement des complexes Polycomb sur leurs gènes cibles................................................................56 6. Polycomb et l’organisation nucléaire ................................................................................................................61. Partie IV : Ciblage des complexes du PcG sur les gènes au cours du développement........................................................................... 65 1. Analyse à l’échelle du génome des gènes ciblés par les protéines du PcG .........................................65 2. Ciblage dynamique des complexes du PcG au cours du développement...........................................72 3. Fonctions différentielles des complexes du PcG et connections avec le cancer...............................77 4. Ciblage différentiel des complexes du PcG au cours du développement............................................81. RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................... 85 Introduction à l’organisme d’étude .............................................................. 87 1. Description générale de Drosophila melanogaster..................................................................87 2. Principes développementaux des disques imaginaux................................................................................89 3. Développement du disque imaginal d’œil .....................................................................................................90. Partie I : Rôle des protéines Polycomb dans la régulation du réseau génique de détermination de l’œil chez la drosophile............ 95 1. Problématique............................................................................................................................................................95 2. Détermination du patron d’expression des gènes du RDGN dans les disques imaginaux d’œil et d’aile..................................................................................................................96 3. Ciblage des protéines du PcG sur les gènes du RDGN dans les disques imaginaux d’œil et d’aile.......................................................................................................98.

(8) 4. Outils pour l’étude du ciblage dynamique des protéines du PcG au cours du développement de l’œil...............................................................................................................101 5. Dynamique d’expression des gènes du RDGN et organisation nucléaire ........................................ 104 6. Conclusion et discussion...................................................................................................................................... 106. Partie II : Ciblage dynamique et différentiel des complexes Polycomb au cours du développement.......................................................111 1. Problématique ......................................................................................................................................................... 111 2. Cibles des protéines du PcG au cours du développement...................................................................... 113 3. Cibles des protéines du PcG entre les disques d’œil et d’aile..................................................................116 4. Ciblage différentiel des complexes du PcG : dissociation des fonctions PRC1 et PRC2.................121 5. H3K27me3 au cours du développement........................................................................................................129 6. La protéine Pho et les nouvelles cibles des protéines du PcG dans les disques imaginaux........131 7. Conclusion et perspectives à court terme ....................................................................................................133. CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES A LONG TERME ........... 139 MATERIELS ET METHODES ..................................................................... 159 Hybridation in situ d’ARN fluorescent (ARN-FISH) sur disques d’œil et d’aile..........................................161 Hybridation in situ d’ADN fluorescent (ADN-FISH) sur disque d’œil et d’aile..........................................162 Lignées transgéniques pour le système de « driver-GAL4 » et de l’UAS-GFP.........................................163 Immunoprécipitation de la chromatine pour des disques imaginaux de drosophile........................ 164 Analyse des données de séquençage...................................................................................................................169 Purification des ARNs des disques imaginaux et analyse par RT-qPCR ....................................................171 Tables des primers utilisés pour chaque technique.........................................................................................171. ANNEXES.................................................................................................. 177 Annexe 1 : Polycomb: a paradigm for genome organization from one to three dimensions.................................................. 179 Annexe 2 : Contrôle qualité des échantillons de ChIPseq........................ 191 Annexe 3 : Gene Ontologies......................................................................... 193 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................... 207.

(9) Liste des Tables et Figures Figure 1 : Formation du nucléosome.......................................................................................................13 Figure 2 : Compaction de l’ADN en chromosome mitotique...........................................................15 Figure 3 : Éléments régulateurs des gènes.............................................................................................17 Figure 4 : Modèles d’action des « enhancers »......................................................................................19 Figure 5 : Modifications des histones...................................................................................................... 21 Figure 6 : Profil le long d’un gène des modifications post-traductionnelles des histones associées à un état transcriptionnel........................................................... 25 Figure 7 : Communication entre modifications post-traductionnelles ....................................... 30 Figure 8 : Différentes « couleurs » de la chromatine caractérisées par différentes combinaisons de protéines et de marques histones........................ 35 Figure 9 : ATPase des quatre grandes familles de complexes de remodelage de la chromatine............................................................. 37 Figure 10 : Actions des complexes de remodelage au niveau de la chromatine....................... 37 Figure 11 : Maintien des marques histones au cours de la réplication........................................... 42 Figure 12 : Etablissement et maintien du patron d’expression des gènes homéotiques (HOX) de l’embryon à la mouche adulte............................ 46 Table 1 : Complexes associés aux protéines du groupe trithorax............................................... 50 Figure 13 : Complexes du groupe Polycomb chez la drosophile..................................................... 52 Figure 14 : Recrutement hiérarchique des complexes du PcG au PRE........................................... 59 Figure 15 : Différentes conformations dans l’espace du BX-C par rapprochement des PREs réprimés au sein d’un foyer Polycomb...................... 63 Figure 16 : Techniques d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)et méthodes d’analyses.............................................................. 66 Figure 17 : Cibles des protéines du PcG et fonctions biologiques associées............................... 68 Figure 18 : Profils génomiques des protéines du PcG et de H3K27me3 dans l’embryon de drosophile.............................................................. 71 Figure 19 : Différentes signatures aux TSSs pour les gènes des domaines Polycomb.............. 72 Figure 20 : Recrutement dynamique et retrait des protéines du PcG au cours de la spécification d’un lignage cellulaire......................................................... 73 Table 2 : Liste non exhaustive d’études démontrant une dynamique développementale du ciblage des protéines du PcG et de H3K27me3 sur leurs cibles .......................... 75 Figure 21 : Différents phénotypes associés aux protéines du PRC1 et du PRC2......................... 80 Figure 22 : Généralités sur Drosophila melanogaster...........................................................................88 Figure 23 : Devenir des disques imaginaux d’aile et d’œil.................................................................. 90 Figure 24 : Développement du disque imaginal d’œil......................................................................... 92 Figure 25 : Domaines d’expression des gènes de cette étude dans les disques d’œil et d’aile............................................................................................... 97 Figure 26 : Ciblage des protéines du PcG sur les gènes du RDGN dans les disques imaginaux d’œil et d’aile.................................................... 101 Figure 27 : Outils pour l’étude du ciblage dynamique des protéines du PcG au cours du développement de l’œil...................................... 103 1.

(10) Figure 28 : Dynamique d’expression des gènes du RDGN et organisation nucléaire.............104 Figure 29 : Stabilité et dynamique des gènes cibles des protéines du PcG au cours du développement.......................................................115 Table 3 : Ontologies des différentes classes de gènes cibles des protéines du PcG.............116 Figure 30 : Pas de gènes cibles des protéines du PcG spécifiques des disques d’œil ou d’aile...............................................................................119 Figure 31 : Le profil de H3K27me3 le long d’un gène indique son état transcriptionnel dans les disques imaginaux ........................................................ 120 Figure 32 : Ciblage différentiel des complexes du PcG .................................................................... 122 Figure 33 : Caractéristiques des nouvelles classes de gènes cibles des protéines du PcG dans les disques imaginaux d’œil et d’aile............................. 125 Figure 34 : Comparaison des ontologies associées aux deux nouvelles classes de gènes cibles des protéines du PcG................................................................. 127 Figure 35 : Les gènes dépourvus de H3K27me3 sont plus fréquemment associés à des sites Pc-Ph proches de leurs TSSs que les gènes qui portent cette marque ........ 128 Figure 36 : La chromatine « noire » est marquée par la présence de H3K27me3 dans les disques imaginaux...................................................................... 131 Figure 37 : La protéine Pho et les nouvelles cibles des protéines du PcG dans les disques imaginaux........................................................ 132 Figure 38 : Organisation nucléaire et expression génique .............................................................. 143 Figure 39 : Ciblage des complexes du PcG au cours du développement...................................148 Figure supplémentaire (Annexe3) : Comparaison des ontologies associées aux cibles canoniques (maintenues vs. néo disques)................................................... 193 Tables supplémentaires (Annexe 3) : « clusters » d’ontologies de l’étude des différentes classes de gènes cibles des protéines du PcG.................................. 196. 2.

(11) Abréviations. 3C : Capture de la Conformation des Chromosomes Abd-A : Abdominal A. Abd-B : Abdominal B Antp-C : Antennapedia Complex. BX-C : Bithorax Complex. ChIP : Chromatin ImmunoPrecipitation. Dan : Distal antenna. Danr : distal antenna-related. Dpp : Decapentaplegic. En : Engrailed. Ey : Eyeless. Eya : Eyes absent. Fab7 : Frontabdominal 7. FACS : Fluorescence Activated Cell Sorting. FDR : False Discovery Rate. FISH : Fluorescent In Situ Hybridization. GFP : Green Fluorescent Protein H2Aub : ubiquitinylation de la lysine 119 de l’histone 2A H3K27ac : acétylation de la lysine 27 de l’histone 3 H3K27me3 : tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone 3. HAT : Histone Acetyltransferase. HDAC : Histone Deacetylase. Hh : Hedgehog. HKMT : Histone Lysine Methyltransferase. HMT : Histone Methyltransferase. Hth : Homothorax. Ip : Immunoprécipitation. MF : Morphogenetic Furrow. Pc : Polycomb. PcG : Polycomb group. Ph : Polyhomeotic. Pho : Pleiohomeotic Pho-RC : Pleiohomeotic Repressive Complex 3.

(12) . 4. PRC1 : Polycomb Repressive Complex 1 PRC2 : Polycomb Repressive Complex 2 PRE : Polycomb Response Element Psc : Posterior sex combs RDGN : Retinal Determination Gene Network RPKM : Reads Per Kilobase per Million mapped reads So : Sine oculis TBP : TATA-binding protein TRE : Trithorax Response Element Trx : Trithorax TrxG : Trithorax group Tsh : Teashirt TSS : Transcription Start Site UAS : Upstream Activation Sequence Ubx : Ultrabithorax Upd : Unpaired (aussi nommé Os) Vg : Vestigial Wg : Wingless.

(13) Avant-propos Afin de faciliter la lecture de ce manuscrit, voici un bref aperçu de ce que vous y découvrirez. L’introduction comporte quatre parties. Elles exposent le contexte scientifique dans lequel mon projet de thèse s’inscrit et apportent les informations nécessaires pour la lecture de mes travaux. Ma thèse ayant été effectuée dans un laboratoire de « chromatine et biologie cellulaire », je me dois de présenter la structure chromatinienne, laquelle, nichée au sein du noyau de chacune de nos cellules, a assuré notre développement et sous cette forme sera transmise à notre descendance. En effet, si l’on désigne souvent la molécule d’ADN comme le support génétique de l’hérédité, il serait plus juste de parler de la chromatine. C’est effectivement associé à de nombreuses protéines que l’ADN peut être confiné au sein du noyau des cellules. La première partie de l’introduction expose donc la structure de la chromatine et ses différents niveaux de compaction. L’ADN détient certes toute l’information nécessaire à la formation et à la survie d’un organisme, mais comment décrypter son langage et utiliser proprement cette information? Ce sont les changements de la nature biochimique de l’ADN ainsi que les modifications post-traductionnelles des protéines histones qui constituent une information dite « épigénétique » laquelle, contrairement à celle détenue dans la séquence primaire de l’ADN, peut être changée selon le contexte et l’environnement. Dans la deuxième partie de l’introduction est exposé l’ensemble des changements de la structure chromatinienne qui permettent d’expliquer en partie comment les cellules savent préserver ou bien modifier leur patron d’expression génique, caractéristique de leur identité. Au cœur de ces régulations épigénétiques on retrouve les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG). Ces protéines, tout d’abord découvertes chez la drosophile, constituent un merveilleux système de mémoire cellulaire que l’on retrouve dans presque tout le règne du vivant. L’identité de chaque cellule d’un organisme se définit par un patron d’expression génique bien spécifique et les protéines du PcG et du TrxG en sont en partie les gardiennes. 5.

(14) Les protéines du PcG sont chargées du maintien de la répression génique et à l’inverse celles du TrxG maintiennent actifs ces gènes dans les cellules de l’organisme qui doivent les exprimer. L’identification de ces protéines et leurs mécanismes d’action au niveau de la chromatine et dans l’espace tridimensionnel du noyau, sont présentés dans la troisième partie de l’introduction. Au cours de ma thèse, je me suis tout particulièrement intéressée aux complexes formés par les protéines du PcG et à leur ciblage au niveau de la chromatine au cours du développement. Les gènes homéotiques (HOX) sont, à ce jour, les cibles des protéines du PcG les mieux caractérisées. Ainsi ces protéines assurent une mémoire cellulaire grâce à leur capacité à maintenir une répression stable des gènes HOX à travers toutes les étapes du développement. Cependant la découverte de nombreuses nouvelles cibles géniques des protéines du PcG, qui peuvent apparaître à des stades précis du développement, et l’implication de ces protéines dans divers processus biologiques étendent très largement leur spectre d’action. Il est donc envisageable que les protéines du PcG puissent également intervenir dans des régulations de l’expression génique beaucoup plus dynamiques. Je me suis donc tout particulièrement intéressée à ce nouvel aspect de la régulation génique par les protéines du PcG au travers du développement. Ainsi dans la dernière parie de l’introduction est présenté le contexte scientifique dans lequel mon projet de thèse a été initié et l’état actuel des connaissances sur les problématiques soulevées par mes travaux. A la suite de l’introduction se trouve la partie résultats et discussion. Drosophila melanogaster est l’organisme modèle à partir duquel mes études ont été menées. En introduction des résultats sont alors présentés cette petite mouche et les tissus à partir desquels j’ai réalisé l’ensemble de mes expérimentations. Les disques imaginaux de la larve de drosophile sont les tissus précurseurs des organes et appendices de la mouche adulte. Au stade larvaire se déploient dans ces tissus différents programmes développementaux. La différentiation du disque d’œil est sous le contrôle d’un réseau de gènes bien spécifiques. Il se trouve qu’un grand nombre de ces gènes a été préalablement identifié dans notre laboratoire comme étant des cibles géniques des protéines du PcG. Le disque d’œil constitue donc un système particulièrement intéressant pour l’étude du ciblage dynamique des protéines du PcG sur ces cibles au cours du processus de différentiation. Dans la première partie des résultats est présenté mon projet initial qui consistait à mettre en place dans ce tissu une stratégie expérimentale pour l’étude de la régulation des gènes du réseau de détermination de l’œil par les protéines du PcG. La deuxième partie des résultats porte également sur le ciblage dynamique des protéines du PcG, mais sur une échelle de temps plus grande, à savoir de l’embryon à la larve et cette fois ci sur l’ensemble du génome. En effet, une précédente étude menée dans notre laboratoire a révélé 6.

(15) l’existence d’un ciblage des protéines du PcG à des stades spécifiques du développement par l’apparition d’une nouvelle cible génique de ces protéines dans le disque imaginal d’œil qui n’avait pas été identifiée dans les embryons de drosophile. Par ailleurs, les deux principaux complexes des protéines du PcG, connus pour agir de façon coopérative et séquentielle sur la chromatine, semblent dans ce cas utiliser un mécanisme d’action non-canonique. En effet la régulation de ce gène semble uniquement dépendre de l’un des deux complexes Polycomb. Ainsi, en plus de l’aspect dynamique du ciblage des complexes du PcG au cours du développement, nous avons également exploré la possibilité d’un ciblage différentiel de ces complexes. Pour chaque partie des résultats, les problématiques sont exposées clairement avant d’aborder les résultats expérimentaux eux même. D’autre part chaque partie possède sa propre conclusion et discussion. Enfin, la conclusion générale reprend l’ensemble des résultats obtenus et possède une réflexion supplémentaire sur les perspectives à long terme qui sont nées à la suite de mes travaux de thèse. Bonne lecture.. 7.

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(17) INTRODUCTION.

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(19) Partie I Structure de la chromatine 1. La molécule d’ADN Dans le monde du vivant l’acide désoxyribonucléique (ADN) est la molécule qui détient l’information nécessaire pour le développement, la survie et la reproduction d’un organisme. Cette molécule est présente dans chacune des cellules d’un organisme et l’information qu’elle contient peut être convertie en message nécessaire à la production d’ARNs et de protéines. Par ailleurs, pour le développement d’un organisme, les cellules doivent se diviser et l’ADN est alors capable d’être recopié afin d’être transmis. Chaque espèce possède un génome constitué par une séquence d’ADN qui lui est propre, porté par un certain nombre de chromosomes, et une composition génique particulière qui constitue son génome. Il aura fallu près d’un siècle pour isoler cette molécule, déterminer sa composition, sa structure et pouvoir affirmer que l’ADN est le support physique de l’hérédité décrite par Johann Gregor Mendel. Ainsi l’ADN est formé de deux chaines nucléotidiques non identiques, enroulées l’une autour de l’autre pour former une structure en double hélice. Chaque nucléotide se compose, d’une base azotée (cytosine (C), guanine (G), thymine (T) ou adénine (A)), d’un sucre, le désoxyribose, et d’un groupement phosphate liant chaque nucléotide d’une même chaine. L’association des deux brins d’ADN s’effectue par des liaisons hydrogènes entre bases complémentaires. La cytosine s’associant uniquement à la guanine et la thymine avec l’adénine. Ces molécules dans les cellules eucaryotes sont contenues principalement dans un compartiment que l’on nomme le noyau, de dimensions micrométriques. Dans ce petit volume doit être alors confinée une quantité colossale d’ADN. Prenons l’exemple d’un noyau de cellule humaine diploïde (environ 10 microns) qui doit contenir deux mètres d’ADN correspondant à ces 6,4 milliards de paires de bases (pb). Pour se faire l’ADN, s’associe à des protéines afin de former des structures pouvant adopter différents niveaux de compactions, le plus élevé correspond au chromosome mitotique. L’ADN ainsi associé à des protéines fût nommé chromatine par Walther 11.

(20) INTRODUCTION. Flemming pour désigner cette substance nucléaire absorbant les colorants dérivés de l’aniline. D’autre part, bien que toutes les cellules d’un organisme multicellulaire possèdent un génome identique, elles se distinguent par leurs profils d’expression génique, ce qui permet d’établir une diversité cellulaire associée à diverses fonctions biologiques. Si la séquence nucléotidique de l’ADN ne varie pas entre types cellulaires distincts, à l’inverse, la nature biochimique de la chromatine peut être modifiée. Ce sont ces changements qui vont permettre de réguler de manière différentielle l’expression des gènes dans les cellules sans modification de la séquence d’ADN ; on parle alors de régulation « épigénétique ». D’un point de vue biochimique, l’ADN n’est donc pas trouvé « nu » dans les cellules mais toujours associé à des protéines. Parmi elles on retrouve les histones.. 2. Histones et formation du nucléosome Les histones sont des protéines basiques, chargées positivement car riches en acides aminés arginine et lysine, permettant ainsi une interaction forte avec les groupements phosphate de la molécule d’ADN. Il existe 5 classes d’histones (H2A, H2B, H3, H4 et H1 (ou H5)) que l’on peut regrouper en 2 catégories. Les histones de cœur H2A, H2B, H3 et H4 qui sont associées à l’ADN pour former le nucléosome. Les histones de liaison (H1/H5) qui interviennent dans la formation de structures d’ordre supérieur. La séquence en acides aminés des histones H2A, H2B, H3 et H4 est remarquablement bien conservée au cours de l’évolution. Par exemple la séquence de l’histone H4 de thymus de veau ne diffère que de deux acides aminés de celle du petit pois (DeLange et al., 1969). Ces petites molécules de 10 à 15 kDa (kiloDalton) pour les histones H2A, H2B, H3, H4 partagent un domaine structural appelé « histone-fold », qui comprend trois hélices a connectées entre elles par des boucles (Arents et al., 1991). Ce domaine permet aux histones de former des dimères selon un motif dit en « poignée de main » Figure 1. En dehors de ce motif toutes les histones de cœur ont une longue région N-terminal chargée positivement (20 à 40 acides aminés) communément appelée « queue ». Les histones H2A et H3 possèdent également au niveau C-terminal une structure similaire. Ces queues d’histones n’adoptent pas de structure particulière mais jouent un rôle central dans la régulation de l’expression génique que nous aborderons plus tard. Les histones H1/H5 de plus grande masse moléculaire 21kDa ne possèdent pas de motif « histonefold » et leurs séquences sont plus variables à travers les espèces que celles des histones de cœur. Elles sont composées d’un domaine central globulaire, flanqué par deux longues queues fortement chargées positivement (Allan et al., 1980). 12.

(21) Structure de la chromatine. Dans la chromatine les histones ne sont pas distribuées aléatoirement, mais forment des oligomères s’associant à l’ADN de manière périodique (Kornberg, 1974). En effet, l’observation in vitro par microscopie électronique d’extrait nucléaire à faible concentration en sel laisse percevoir une chromatine constituée de particules d’un diamètre d’environ 11nm régulièrement espacées qui ressemble à un « collier de perle » où les perles correspondent aux oligomères d’histones et le fil à l’ADN apparemment nu (Oudet et al., 1975), notons également que l’histone H1 n’est pas nécessaire pour l’observation de cette structure. Ainsi, la digestion limitée de la chromatine par des nucléases micrococcales produit des fragments d’ADN de tailles très régulières (multiples de 200pb) dévoilant l’ADN protégé par les histones de l’action de cette enzyme. Ces unités répétées correspondent à l’assemblage des histones de cœur en un octamère autour duquel s’enroule 147 pb d’ADN (1,75 tour) formant ainsi le nucléosome qui constitue le premier niveau d’organisation de la chromatine (Luger et al., 1997) Figure 1. Dans le nucléosome, les parties N-terminal des histones passent au travers ou autour de la double hélice d’ADN. Les queues d’histones peuvent alors stabiliser la structure en interagissant soit avec les résidus phosphate de l’ADN soit avec les différentes histones de leur nucléosome ou du voisin. Enfin l’ADN qui s’étend entre deux nucléosomes correspond à l’ADN de liaison, les. Mo#f en poignée de main . Figure 1 : Formation du nucléosome Les histones H3 et H4 forment un tétramère sur lequel s’ajoute 2 dimères H2A-H2B réalisant ainsi l’octamère d’histones autour duquel 1,75 tour d’ADN est enroulé pour former le nucléosome. Figure assemblée à partir de l’illustration de Richard Wheeler et de la représentation de la structure cristallographique de Luger et al (Luger et al., 1997). 13.

(22) INTRODUCTION. histone H1/H5 s’y fixent et en interagissant avec les octamères vont permettre la formation de structures d’ordre supérieur.. 3. Structures d’ordre supérieur Lors de la division cellulaire le chromosome mitotique est une structure essentielle pour la transmission correcte de l’ADN génomique dupliqué aux cellules filles. Les processus par lesquels une longue molécule d’ADN est capable d’adopter cette structure hautement condensée sont peu connus et sujets à de nombreux débats, Figure 2. Il a tout d’abord été montré qu’à forte concentration saline et en présence de l’histone H1 la fibre de chromatine observée en microscopie électronique a une structure de 30nm de diamètre (Finch and Klug, 1976; Robinson et al., 2006). Plusieurs études ont alors proposé différents modèles pour expliquer l’agencement des nucléosomes au sein de cette structure. Dans un premier modèle appelé « one-start hélix » ou solénoïde, les nucléosomes s’agencent les un après les autres pour former une hélice simple (Finch and Klug, 1976; Robinson et al., 2006). Un deuxième modèle le « two start hélix » propose que chaque nucléosome interagit avec son deuxième voisin formant alors une structure en zig-zag (Dorigo et al., 2004; Woodcock et al., 1984). Ces deux modèles ne sont pas complètement exclusifs car il a été observé que dans certaines conditions ioniques on peut observer simultanément ces deux structures dans une fibre chromatinienne de 30nm (Grigoryev et al., 2009). D’autre part, en tenant compte des contraintes géométriques élaborées par ces modèles structuraux, une fibre chromatinienne de 30nm pourrait exister sous différentes formes (Bian and Belmont, 2012). Pour ensuite expliquer comment une fibre de 30nm peut s’organiser pour atteindre les 700nm d’un bras chromosomique, il a été postulé que la fibre pourrait progressivement se replier en une structure de 100nm puis de 200 à 250nm pour enfin s’enrouler et former le chromosome (Sedat and Manuelidis, 1978). Dans ce sens, une étude récente a révélé par l’utilisation de la technique de microscopie à haute résolution PALM (Photoactivated localization microscopy), l’existence de blocs filamenteux de chromatines d’un diamètre d’environ 70nm dans des cellules d’embryons de drosophile en métaphases, qui pourraient justement s’être formés à partir de structures intermédiaires de 35nm (Matsuda et al., 2010). Cependant des études menées cette fois ci par cryo-microscopie électronique, qui permet d’observer des structures nucléaires plus proches de leur état natif, réfutent l’existence même in vivo d’une structure de l’ordre de 30nm (Dubochet et al., 1988; Eltsov et al., 2008). Expliquant. 14.

(23) Structure de la chromatine. que la visualisation de ce type de chromatine par microscopie électronique conventionnelle pourrait correspondre à un artéfact de préparation des échantillons. Une autre étude a émis l’hypothèse que la structure du chromosome serait dépendante de protéines non histones telles que les condensines qui permettraient d’établir une structure axiale au centre du chromosome « chromosome scaffold » à partir de laquelle l’ADN formerait des boucles (Paulson and Laemmli, 1977). En conclusion, la chromatine peut adopter différentes structures in vitro selon certaines conditions. Ceci pourrait alors refléter sa capacité de mouvement in vivo. La chromatine ne doit donc pas être considérée comme une structure statique ou inerte mais plutôt comme une structure en perpétuel mouvement, pouvant ainsi rapidement répondre aux processus biologiques auxquels elle est soumise (Discuté dans cette revue (Maeshima et al., 2010)). Nous venons donc de voir dans cette première partie l’implication des histones dans la formation du nucléosome et dans l’organisation structurale de la chromatine. Cependant la fonc-. 2nm . ADN . nucléosome 11nm « Collier de perle » 50nm . H1 . Mg2+ Fibre de chroma=ne de 30nm 30nm . ? . -‐Solenoide -‐Zig-‐zag . 50nm . ? 700nm . 1 µm . 10µm . Chromosome mito=que . Figure 2 : Compaction de l’ADN en chromosome mitotique A droite du haut vers le bas : L’ADN s’enroule autour des octamères d’histones pour former une structure dite en collier de perle de diamètre de 11nm. A forte concentration en cations mono ou divalent (Mg2+) et par la fixation de l’histone H1 la fibre chromatinienne adopte une structure de 30nm de diamètre. Cette structure dont l’existence in vivo est remise en question peut former deux types de structure ; modèle solénoïde ou zigzag. L’arrangement de la fibre de 30nm en bras chromosomique de 700nm n’est pas déterminé, mais pourrait correspondre à des repliements et enroulements hiérarchiques de la fibre de 30nm. A gauche les images en microscopie électronique correspondantes aux illustrations. Figure assemblée à partir (Maeshima et al., 2010); Atlas de biologie végétale, Roland - Masson, 1983 ; Molecular Biology of the Cell, 4th édition, Alberts et al 2002). 15.

(24) INTRODUCTION. tion de ces protéines ne se limite pas à établir l’architecture du génome, elles contribuent également à d’autres processus biologiques, en particulier à la régulation de l’expression génique. En effet en comparaison à l’ADN « nu », l’ADN capturé au niveau des nucléosomes est moins accessible à la machinerie transcriptionnelle, ce qui limite l’activation d’un gène. De plus, plusieurs études ont permis d’établir une carte des nucléosomes le long des génomes de différentes espèces (Kaplan et al., 2009; Mavrich et al., 2008; Ozsolak et al., 2007) et il s’avère que la distribution des nucléosomes le long d’un gène actif n’est pas aléatoire. Les régions promotrices et terminales des gènes sont pauvres en nucléosome par rapport aux parties codantes. La position et la densité des nucléosomes sont donc des facteurs à contrôler pour permettre, ou bien pour empêcher la transcription d’un gène. Par ailleurs, la nature biochimique des histones qui composent le nucléosome est également importante pour la compréhension de la régulation génique. Nous allons donc dans la partie II discuter des différents mécanismes de modulation de la chromatine et de leurs rôles dans la régulation de l’expression des gènes.. 16.

(25) Partie II Chromatine et régulation de l’expression génique 1. Régions régulatrices de l’ADN La séquence d’ADN détient un ensemble de signaux nécessaires à la régulation d’un gène. Ces signaux ou éléments régulateurs sont de courtes régions génomiques qui correspondent à des sites de fixations spécifiques des protéines qui catalysent ou régulent la transcription d’un gène. Selon leurs position vis à vis du gène qu’ils régulent, on distingue différents types d’éléments : les éléments du promoteur (minimal ou proximal) et les éléments distaux, Figure 3. Dépendant des protéines qui se fixent sur ces éléments régulateurs et de la fonction qu’elles exercent sur la transcription du gène qu’ils régulent, on parlera d’élément « enhancer » (effet positif sur la transcription), d’élément « silencer » (effet négatif sur la transcription) ou « d’insulateur » (restreint l’effet d’un enhancer ou silencer à un gène ou un groupe de gènes). Ces régions régulatrices peuvent agir sur plusieurs gènes à la fois ou inversement un même gène peut être régulé par plusieurs de ces éléments régulateurs. Enfin la plupart de ces éléments ne correspondent pas à des régions codantes. Historiquement, l’observation lors de l’activation d’un gène d’une hypersensibilité à l’action de l’endonucléase DNaseI au niveau de régions génomiques nécessaires pour son activation . . . .

(26)

(27) . . Figure 3 : Éléments régulateurs des gènes Les éléments régulateurs des gènes, de type enhancer ou silencer (rectangle rouge), peuvent être localisés au promoteur (minimal ou proximal, rectangles bleus), dans la région génique (rectangle vert), ou à longue distance du gène à contrôler. Les séquences de ces éléments peuvent recruter des protéines spécifiques (rond, triangle, carré) qui auront selon leur nature une activité positive ou négative sur la machinerie transcriptionnelle (ronds jaunes) chargée autour du site d’initiation de la transcription (TSS) des gènes. Les régions régulatrices de type insulator (rectangle gris) fixent également des protéines spécifiques (hexagone gris) qui permettent de limiter l’action des éléments enhancer/silencer à un certain nombre de gènes. 17.

(28) INTRODUCTION. (Elgin, 1988; Keene et al., 1981; Weintraub and Groudine, 1976), a permis d’établir une technique d’identification des éléments régulateurs qui partagent tous cette caractéristique. De cette façon, il a été possible d’établir dans différentes espèces et types cellulaires des cartes génomiques de ces éléments régulateurs (Boyle et al., 2008; Hesselberth et al., 2009; Thomas et al., 2011). Ces éléments régulateurs sont également caractérisés par des séquences nucléotidiques particulières reconnues spécifiquement par les protéines. La plus célèbre est la région riche en AT au promoteur minimal des gènes que l’on nomme, TATA-box qui est le site de fixation de la « TATA-binding protein » (TBP). Cependant cette région n’est retrouvée que dans 10‑20% des promoteurs des gènes eucaryotes (Jin et al., 2006; Ohler et al., 2002), à l’inverse l’Inr (initiator) qui est la région centrée au niveau du site d’initiation de la transcription (TSS) est retrouvée dans 40 à 60 % des promoteurs (Yang et al., 2007), et sa séquence consensus varie considérablement entre les espèces (Ohler et al., 2002). Les promoteurs des gènes sont constitués d’un ensemble d’éléments régulateurs dont la composition et l’organisation varient entre les espèces mais également selon le type de gène. Par exemple la région DPE (Downstream Promoter Element) a été identifiée comme étant le site de fixation du TFIID (protéine du complexe d’initiation de la transcription), la majorité des promoteurs qui possèdent une région DPE a également un Inr mais pas de TATA-box (Burke and Kadonaga, 1997). Deux études menées chez la drosophile (Engstrom et al., 2007; JuvenGershon et al., 2008) ont montré que la plupart des gènes avec cette configuration de promoteur correspondent à des gènes du développement, un grand nombre d’entre eux étant associé à la régulation par les protéines du groupe Polycomb (dont nous discuterons plus longuement dans la 3ème partie de l’introduction). Une autre particularité de séquence au niveau des promoteurs est la forte concentration en dinucléotides CG nommée ilot CpG (Carninci et al., 2006), qui chez les mammifères pourra être le siège de la modification épigénétique, la méthylation de l’ADN (discuté plus loin dans cette partie). L’effet « enhancer » des régions régulatrices a été caractérisé lors d’expérience de clonage du gène de la b-globine et de l’étude de sa transcription une fois transfecté dans des cellules en cultures (Banerji et al., 1981). En effet, dans ces expérience, la présence dans le plasmide recombinant de la séquence virale SV40 (simian virus 40) augmentait considérablement l’expression du gène de la b-globine et ceci indépendamment de l’orientation de cette séquence ou de sa distance vis à vis du promoteur. Depuis cette découverte, il est apparu que ce mécanisme de communication entre le promoteur d’un gène et une séquence régulatrice proximale ou distale était le mode le plus utilisé 18.

(29) Chromatine et régulation de l’expression génique. chez les eucaryotes. En plus de leur capacité à moduler l’expression d’un gène, ces éléments régulateurs permettent de préciser le patron d’expression d’un gène au cours du temps et entre les tissus (Bulger and Groudine, 2011). Ces éléments régulateurs peuvent être localisés au niveau du promoteur proximal, dans les introns ou à plus longue distance du gène, pouvant atteindre 10kb chez la drosophile (Zhou et al., 2001), dans certains cas ils peuvent être positionnés sur un autre chromosome que le gène on parlera alors d’élément trans-régulateur (Lomvardas et al., 2006). Il existe différents modèles pour expliquer comment ces « enhancers » interagissent avec leur gène à distance (Kolovos et al., 2012). Dans le modèle de « tracking », les protéines sont chargées au niveau de l’ « enhancer » et en glissant le long de la chromatine vont atteindre le promoteur du gène et stimuler sont activation, Figure 4 A. Dans un deuxième modèle, dit de « linking », une polymérasion de protéines s’effectue entre l’« enhancer » et le promoteur pour permettre une liaison, Figure 4 B. Enfin le modèle de « looping » impliquant une interaction directe de l’« enhancer » avec le promoteur, formant ainsi une boucle Figure 4 C. Les facteurs qui entrent en jeu dans la formation de ces boucles sont peu ou mal connus, une étude récente a montré que le complexe Mediator (complexe de co-activation de la transcription) pouvait interagir avec des cohésines et ainsi permettre l’interaction entre deux séquences (Kagey et al., 2010). La formation de telles interactions entre séquence régulatrice et promoteur a pu être largement mise en évidence par des techniques de Capture de la Conformation des Chromosomes (3C et ses variantes) qui montrent l’existence d’un grand nombre d’interactions nécessaires pour la régulation d’un gène (Sexton et al., 2009). La distinction entre « enhancer » et « silencer » réside dans la nature des protéines qui se fixent sur ces régions, la composition biochimique des histones sur ce site et évidemment de A"Tracking). Enhancer)). B"Linking). promoteur)). Figure 4 : Modèles d’action des « enhancers » Trois modèles qui décrivent la régulation d’un gène par son enhancer. A: Le modèle de tracking ou un facteur de transcription (TF, losange violet) chargé sur l’enhancer glisse le long de la chromatine pour aller stimuler la polymérase (ovale rose) au niveau du promoteur. B: Le modèle de linking ou le TF chargé sur l’enhancer démarre une polymérisation de protéines en direction du promoteur. C: Le modèle de looping où se forme une boucle suite au rapprochement de l’enhancer avec le promoteur mettant en jeu des interactions protéiques. Figure modifiées de (Kolovos et al., 2012).. C"Looping). 19.

(30) INTRODUCTION. l’état transcriptionnel du gène associé. Les régions « silencer » des gènes régulés par les protéines répressives Polycomb sont présentées dans la partie III de l’introduction. En conclusion, ces éléments régulateurs portés par l’ADN sont cruciaux pour l’établissement correct dans le temps et dans l’espace de l’expression d’un gène. Caractérisés par des séquences d’ADN spécifiques, ils vont constituer des plateformes nécessaires pour le recrutement de protéines activatrices ou répressives de la transcription. Par ailleurs, les modifications post-traductionnelles retrouvées au niveau de ces séquences régulatrices peuvent constituer des signatures epigénétiques de ces éléments et participent au contrôle de l’expression génique.. 2. Modifications post-traductionelles des histones Les modifications post traductionnelles des histones ou marques histones jouent un rôle fondamental dans la plupart des processus biologiques impliquant la manipulation de l’ADN, tels que la réplication, la réparation ou la transcription de cette molécule. D’un point de vue fonctionnel, ces modifications vont permettre de moduler les contacts chromatiniens, soit en modifiant directement la nature biochimique des l’histones, soit en recrutant des protéines ou des complexes porteurs d’une activité enzymatique. Ces modifications covalentes sont principalement retrouvées au niveau des extrémités N-terminales et dans une moindre mesure C-terminales des histones. Elles apparaissent sur des résidus spécifiques de chaque histone et sont catalysées généralement de manière réversible par des enzymes, elles aussi spécifiques. Les acides aminés les plus souvent modifiés sont la lysine (K), l’arginine (R) la serine (S) et la Thréonine (T), Figure 5. Les modifications les plus étudiées à ce jour sont l’acétylation, la méthylation, l’ubiquitinylation et la phosphorylation (développée ci-dessous), mais d’autres ont également étaient décrites telles que l’ADP-ribosylation, la sumoylation, la glycosylation ou la biotinylation (Bannister and Kouzarides, 2011). 2.1. L’acétylation L’acétylation des histones est l’une des modifications post-traductionnelles les plus étudiées et le plus souvent elle est associée à l’activation de la transcription. Elle apparaît majoritairement au niveau des lysines des extrémités N-terminales mais peut dans certain cas être aperçue au niveau de la partie globulaire des histones (Tjeertes et al., 2009), Figure 5. Les enzymes responsables de cette modification, les HATs (Histone Acetyle Transferase) catalysent le transfert d’un groupement acétyle (provenant de l’acétyl Coenzyme A) au niveau du groupement ammonium des lysines, neutralisant ainsi la charge positive de ces acides ami20.

(31) Chromatine et régulation de l’expression génique. nés. Ce qui aura pour effet de diminuer les contacts entre l’ADN et les histones, associant ainsi l’acétylation à un état plus décondensé de la chromatine et donc plus propice à l’activation d’un gène (Imhof and Wolffe, 1998; Kuo et al., 1998). Un grand nombre d’enzymes a été identifié, chacune d’entre elles peuvent acétyler différents résidus avec toutefois une certaine spécificité (Sterner and Berger, 2000). Les HATs sont divisés en trois grandes familles dépendant du degré de similitude de leurs séquences en acide aminé et de la structure conformationnelle qu’elles adoptent : les GNATs (Gnc5-related Acetyl transférase), les MYST et les P300/CBP (CREB binding protein). Ces enzymes sont le plus souvent associées au sein de larges complexes multi protéiques nécessaires pour exercer leur activité catalytique sur la chromatine. Par exemple, chez la levure, l’HAT scGCN5 n’est capable d’acétyler les histones des nucléosomes que lorsqu’elle est au sein du complexe SAGA (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase) (Grant et al., 1997). Chez la drosophile, l’HAT dCBP a été purifiée dans les embryons au sein d’un complexe activateur de la transcription du groupe Trithorax (Petruk et al., 2001). Cette acétyl transférase chez la drosophile ou son homologue chez les mammifères est capable de modifier la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27ac), qui marque l’état actif d’un gène par sa présence au niveau de leur TSS (Tie et al., 2009; Wang et al., 2008). De manière plus générale, la présence de lysines acétylées sur les histones 3 et 4 au niveau de la partie promotrice d’un gène est corrélée à l’activation de celui-ci, Figure 6. Enfin, chez la drosophile, le complexe MOF de la famille MYST permet d’acétyler la lysine 16 de l’histone 4. Figure 5 : Modifications des histones Les extrémités N et C-terminales des histones H2A, H2B, H3 et H4 s’étendent librement en dehors du nucléosome. Sur la séquence humaine au niveau des résidus arginines, lysines, sérines et thréonines apparaissent différentes modifications post-traductionnelles: acetylation (triangle orange), methylation (losange vert), ubiquitinylation (hexagone violet) et la phosphorylation (rond bleu). L’astérisque correspond à la position chez la levure. Les lysines 56 et 79 de l’histone 3 sont au niveau de la partie globulaire. Illustration de (Keppler and Archer, 2008). 21.

(32) INTRODUCTION. qui est nécessaire pour la compensation de dose du chromosome X chez les mâles (Bone et al., 1994). L’acétylation des histones est reconnue principalement par un domaine protéique de type bromodomaine porté le plus souvent par des protéines issues des complexes d’HATs ou de remodelage de la chomatine (présenté plus loin). Par exemple, les protéines Swi2/Snf2 contiennent des bromodomaines qui interagissent avec les lysines acétylées et, ainsi associées à la chromatine, peuvent recruter le complexe de remodelage des nucléosomes SWI/SNF (Hassan et al., 2002). Les résidus autour de la lysine acétylée sont également importants pour déterminer la spécificité de reconnaissance de ces sites par les protéines porteuses d’un bromodomaine (Owen et al., 2000). Enfin, il a été montré que le domaine PHD (Plant Homeo Domain) de la protéine de remodelage DPF3b pouvait également permettre l’interaction de cette protéine avec ce type de modification (Zeng et al., 2010). Selon les conditions physiologiques perçues par la cellule, le patron d’expression des gènes doit rapidement pouvoir être modifié. Par conséquence l’acétylation au niveau des histones doit pouvoir être également modulée. A cet effet, il existe également des enzymes capables de retirer cette marque, établissant ou rétablissant ainsi un état transcriptionnel répressif. Ainsi, il existe des enzymes capables de désacétyler les histones (HDAC) (Yang and Seto, 2008) qui à l’instar des HATs se répartissent en plusieurs catégories. Tout d’abord identifié chez la levure, Rpd3 (Reduced potassium dependency-3) peut moduler l’activité transcriptionnelle d’un certain nombre de gènes (Vidal and Gaber, 1991). La purification chez les mammifères de son orthologue a montré son activité de déacétylase, associant ainsi ce type de protéines à la régulation de la transcription. Depuis ces travaux, la famille des Rpd3/Hda1 (histone deacetylase-1) s’est agrandie et compte à l’heure actuelle 11 membres chez les vertébrés (HDAC1-11) qui sont répartis en 3 classes avec 5 de ces membres que l’on retrouve chez la drosophile (Yang and Seto, 2008). En général, les HDACs montrent une faible spécificité pour leur substrat, une même enzyme pouvant déacétyler un grand nombre de résidus sur les histones. Leur mode de recrutement et leur spécificité sont difficiles à percer, du fait que ces enzymes sont présentes dans un grand nombre de complexes et bien souvent avec d’autres HDACs de la même famille. Par exemple HDAC1 et HDAC2 sont toutes deux présentes dans 3 complexes répresseurs, NuRD, Sin3 et Co-REST (Ahringer, 2000; Denslow and Wade, 2007). Il est donc très difficile d’attribuer précisément une fonction à ces protéines lors de l’observation d’un effet global du complexe. Cependant, l’analyse de différents mutants et de leurs effets sur un processus biologique peut parfois nous éclairer sur la fonction de ces enzymes. De cette manière, il a été montré que le 22.

(33) Chromatine et régulation de l’expression génique. contrôle de la différenciation des cellules souches embryonnaires dépendait exclusivement de HDAC1 (Dovey et al., 2010). Une quatrième classe de désacétylase appelée sirtuin se distingue des autres, car l’action des enzymes qui la composent nécessite le co-facteur NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide). Un grand nombre de ces enzymes n’est pas nucléaire et peu de choses sont connues sur leur capacité à cibler des histones. Cependant l’une d’elles, la protéine Sir2, est associée à la formation des télomères (région terminale des chromosomes faiblement transcrite) en retirant l’acétylation portée par la lysine 16 de l’histone 4 (Suka et al., 2002). En conclusion, nous venons de voir à travers ces quelques exemples que l’acétylation des histones joue un rôle crucial pour la régulation de l’activité d’un gène. De manière très simplifiée, l’activité des HATs est associée à l’activation et à l’inverse, les enzymes qui retirent cette marque, à la répression. Cependant, d’autres facteurs sont à considérer pour comprendre comment un gène est régulé, tels que la localisation de ces marques au niveau du gène, le niveau d’acétylation, et l’environnement global autour du gène (protéines et autre marques d’histones). 2.2. La méthylation Cette modification post-traductionnelle cible deux types de résidus, les lysines et les arginines. S’ajoute à cela un deuxième degré de complexité. En effet les résidus lysines peuvent être mono-, di-, ou tri-méthylés et les arginines mono-, symétriquement ou asymétriquement diméthylés (Bedford and Clarke, 2009). Comme pour l’acétylation, cette modification apparaît principalement au niveau des extrémités N-terminales des histones, et tout particulièrement sur les histones H3 et H4, Figure 5. Pour réaliser cette réaction, les méthyltransférases d’histone (HMTs) transfèrent sur les lysines ou arginines un groupement méthyle provenant de la S-AdenosylMethionine (Smith and Denu, 2009). Contrairement à l’acétylation, cette modification de petite taille ne permet pas la neutralisation de la charge positive des lysines ou arginines. Cependant ces modifications sont également impliquées dans la régulation de la transcription et peuvent, selon la marque, être associées à la répression ou à l’activation d’un gène. Concernant les lysines : La première méthyltransférase des lysines (HKMTs) identifiée chez les mammifères fut SUV39H1 pour sa capacité à cibler la lysine 9 de l’histone 3 (H3K9), cette enzyme que l’on retrouve également chez la drosophile et la levure possède un domaine SET fortement conservé au cours de l’évolution et qui confère à l’enzyme son activité catalytique (Rea et al., 2000). Depuis cette découverte, un grand nombre de HKMTs possédant un domaine SET a été iden23.