Modifications post-traductionelles des histones

INTRODUCTION

l’état transcriptionnel du gène associé. Les régions « silencer » des gènes régulés par les protéines répressives Polycomb sont présentées dans la partie III de l’introduction.

En conclusion, ces éléments régulateurs portés par l’ADN sont cruciaux pour l’établis-sement correct dans le temps et dans l’espace de l’expression d’un gène. Caractérisés par des séquences d’ADN spécifiques, ils vont constituer des plateformes nécessaires pour le recrute-ment de protéines activatrices ou répressives de la transcription. Par ailleurs, les modifications post-traductionnelles retrouvées au niveau de ces séquences régulatrices peuvent constituer des signatures epigénétiques de ces éléments et participent au contrôle de l’expression génique.

2. Modifications post-traductionelles des histones

Les modifications post traductionnelles des histones ou marques histones jouent un rôle fondamental dans la plupart des processus biologiques impliquant la manipulation de l’ADN, tels que la réplication, la réparation ou la transcription de cette molécule. D’un point de vue fonctionnel, ces modifications vont permettre de moduler les contacts chromatiniens, soit en modifiant directement la nature biochimique des l’histones, soit en recrutant des protéines ou des complexes porteurs d’une activité enzymatique.

Ces modifications covalentes sont principalement retrouvées au niveau des extrémités N-terminales et dans une moindre mesure C-terminales des histones. Elles apparaissent sur des résidus spécifiques de chaque histone et sont catalysées généralement de manière réversible par des enzymes, elles aussi spécifiques. Les acides aminés les plus souvent modifiés sont la lysine (K), l’arginine (R) la serine (S) et la Thréonine (T), Figure 5. Les modifications les plus étudiées à ce jour sont l’acétylation, la méthylation, l’ubiquitinylation et la phosphorylation (développée ci-dessous), mais d’autres ont également étaient décrites telles que l’ADP-ribosylation, la sumoy-lation, la glycosylation ou la biotinylation (Bannister and Kouzarides, 2011).

2.1. L’acétylation

L’acétylation des histones est l’une des modifications post-traductionnelles les plus étudiées et le plus souvent elle est associée à l’activation de la transcription. Elle apparaît majoritairement au niveau des lysines des extrémités N-terminales mais peut dans certain cas être aperçue au niveau de la partie globulaire des histones (Tjeertes et al., 2009), Figure 5.

Les enzymes responsables de cette modification, les HATs (Histone Acetyle Transferase) catalysent le transfert d’un groupement acétyle (provenant de l’acétyl Coenzyme A) au niveau du groupement ammonium des lysines, neutralisant ainsi la charge positive de ces acides

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nés. Ce qui aura pour effet de diminuer les contacts entre l’ADN et les histones, associant ainsi l’acétylation à un état plus décondensé de la chromatine et donc plus propice à l’activation d’un gène (Imhof and Wolffe, 1998; Kuo et al., 1998). Un grand nombre d’enzymes a été identifié, chacune d’entre elles peuvent acétyler différents résidus avec toutefois une certaine spécificité (Sterner and Berger, 2000).

Les HATs sont divisés en trois grandes familles dépendant du degré de similitude de leurs séquences en acide aminé et de la structure conformationnelle qu’elles adoptent : les GNATs (Gnc5-related Acetyl transférase), les MYST et les P300/CBP (CREB binding protein). Ces en-zymes sont le plus souvent associées au sein de larges complexes multi protéiques nécessaires pour exercer leur activité catalytique sur la chromatine. Par exemple, chez la levure, l’HAT scGCN5 n’est capable d’acétyler les histones des nucléosomes que lorsqu’elle est au sein du com-plexe SAGA (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase) (Grant et al., 1997). Chez la drosophile, l’HAT dCBP a été purifiée dans les embryons au sein d’un complexe activateur de la transcription du groupe Trithorax (Petruk et al., 2001). Cette acétyl transférase chez la drosophile ou son homo-logue chez les mammifères est capable de modifier la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27ac), qui marque l’état actif d’un gène par sa présence au niveau de leur TSS (Tie et al., 2009; Wang et al., 2008). De manière plus générale, la présence de lysines acétylées sur les histones 3 et 4 au niveau de la partie promotrice d’un gène est corrélée à l’activation de celui-ci, Figure 6. Enfin, chez la drosophile, le complexe MOF de la famille MYST permet d’acétyler la lysine 16 de l’histone 4

Figure 5 : Modifications des histones

Les extrémités N et C-terminales des histones H2A, H2B, H3 et H4 s’étendent librement en dehors du nucléo-some. Sur la séquence humaine au niveau des résidus arginines, lysines, sérines et thréonines apparaissent différentes modifications post-traductionnelles: acetylation (triangle orange), methylation (losange vert), ubi-quitinylation (hexagone violet) et la phosphorylation (rond bleu). L’astérisque correspond à la position chez la levure. Les lysines 56 et 79 de l’histone 3 sont au niveau de la partie globulaire. Illustration de (Keppler and Archer, 2008).

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qui est nécessaire pour la compensation de dose du chromosome X chez les mâles (Bone et al., 1994).

L’acétylation des histones est reconnue principalement par un domaine protéique de type bromodomaine porté le plus souvent par des protéines issues des complexes d’HATs ou de re-modelage de la chomatine (présenté plus loin). Par exemple, les protéines Swi2/Snf2 contiennent des bromodomaines qui interagissent avec les lysines acétylées et, ainsi associées à la chroma-tine, peuvent recruter le complexe de remodelage des nucléosomes SWI/SNF (Hassan et al., 2002). Les résidus autour de la lysine acétylée sont également importants pour déterminer la spécificité de reconnaissance de ces sites par les protéines porteuses d’un bromodomaine (Owen et al., 2000). Enfin, il a été montré que le domaine PHD (Plant Homeo Domain) de la protéine de remodelage DPF3b pouvait également permettre l’interaction de cette protéine avec ce type de modification (Zeng et al., 2010).

Selon les conditions physiologiques perçues par la cellule, le patron d’expression des gènes doit rapidement pouvoir être modifié. Par conséquence l’acétylation au niveau des histones doit pouvoir être également modulée. A cet effet, il existe également des enzymes capables de retirer cette marque, établissant ou rétablissant ainsi un état transcriptionnel répressif.

Ainsi, il existe des enzymes capables de désacétyler les histones (HDAC) (Yang and Seto, 2008) qui à l’instar des HATs se répartissent en plusieurs catégories. Tout d’abord identifié chez la levure, Rpd3 (Reduced potassium dependency-3) peut moduler l’activité transcriptionnelle d’un certain nombre de gènes (Vidal and Gaber, 1991). La purification chez les mammifères de son orthologue a montré son activité de déacétylase, associant ainsi ce type de protéines à la régulation de la transcription. Depuis ces travaux, la famille des Rpd3/Hda1 (histone deacety-lase-1) s’est agrandie et compte à l’heure actuelle 11 membres chez les vertébrés (HDAC1-11) qui sont répartis en 3 classes avec 5 de ces membres que l’on retrouve chez la drosophile (Yang and Seto, 2008). En général, les HDACs montrent une faible spécificité pour leur substrat, une même enzyme pouvant déacétyler un grand nombre de résidus sur les histones. Leur mode de recru-tement et leur spécificité sont difficiles à percer, du fait que ces enzymes sont présentes dans un grand nombre de complexes et bien souvent avec d’autres HDACs de la même famille. Par exemple HDAC1 et HDAC2 sont toutes deux présentes dans 3 complexes répresseurs, NuRD, Sin3 et Co-REST (Ahringer, 2000; Denslow and Wade, 2007). Il est donc très difficile d’attribuer précisément une fonction à ces protéines lors de l’observation d’un effet global du complexe. Cependant, l’analyse de différents mutants et de leurs effets sur un processus biologique peut parfois nous éclairer sur la fonction de ces enzymes. De cette manière, il a été montré que le

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contrôle de la différenciation des cellules souches embryonnaires dépendait exclusivement de HDAC1 (Dovey et al., 2010). Une quatrième classe de désacétylase appelée sirtuin se distingue des autres, car l’action des enzymes qui la composent nécessite le co-facteur NAD+ (nicoti-namide adénine dinucléotide). Un grand nombre de ces enzymes n’est pas nucléaire et peu de choses sont connues sur leur capacité à cibler des histones. Cependant l’une d’elles, la protéine Sir2, est associée à la formation des télomères (région terminale des chromosomes faiblement transcrite) en retirant l’acétylation portée par la lysine 16 de l’histone 4 (Suka et al., 2002).

En conclusion, nous venons de voir à travers ces quelques exemples que l’acétylation des histones joue un rôle crucial pour la régulation de l’activité d’un gène. De manière très simpli-fiée, l’activité des HATs est associée à l’activation et à l’inverse, les enzymes qui retirent cette marque, à la répression. Cependant, d’autres facteurs sont à considérer pour comprendre com-ment un gène est régulé, tels que la localisation de ces marques au niveau du gène, le niveau d’acétylation, et l’environnement global autour du gène (protéines et autre marques d’histones).

2.2. La méthylation

Cette modification post-traductionnelle cible deux types de résidus, les lysines et les argi-nines. S’ajoute à cela un deuxième degré de complexité. En effet les résidus lysines peuvent être mono-, , ou tri-méthylés et les arginines mono-, symétriquement ou asymétriquement di-méthylés (Bedford and Clarke, 2009). Comme pour l’acétylation, cette modification apparaît principalement au niveau des extrémités N-terminales des histones, et tout particulièrement sur les histones H3 et H4, Figure 5. Pour réaliser cette réaction, les méthyltransférases d’his-tone (HMTs) transfèrent sur les lysines ou arginines un groupement méthyle provenant de la S-AdenosylMethionine (Smith and Denu, 2009).

Contrairement à l’acétylation, cette modification de petite taille ne permet pas la neutralisa-tion de la charge positive des lysines ou arginines. Cependant ces modificaneutralisa-tions sont également impliquées dans la régulation de la transcription et peuvent, selon la marque, être associées à la répression ou à l’activation d’un gène.

Concernant les lysines :

La première méthyltransférase des lysines (HKMTs) identifiée chez les mammifères fut SUV39H1 pour sa capacité à cibler la lysine 9 de l’histone 3 (H3K9), cette enzyme que l’on retrouve également chez la drosophile et la levure possède un domaine SET fortement conser-vé au cours de l’évolution et qui confère à l’enzyme son activité catalytique (Rea et al., 2000). Depuis cette découverte, un grand nombre de HKMTs possédant un domaine SET a été

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tifié, comme par exemple chez la drosophile, les protéines : Su(var)3-9, Enhancer of Zest ou Thritorax. Cependant il existe également des enzymes dépourvues de domaine SET comme la protéine Dot1 qui méthyle spécifiquement H3K79. Cette différence structurelle pourrait venir du fait que cette enzyme méthyle un résidu positionné dans la partie globulaire de l’histone (Nguyen and Zhang, 2011).

Les HKMTs ont une certaine spécificité concernant l’histone et le résidu qu’elles ciblent, mais également sur le degré de méthylation qu’elles confèrent (mono-, di-, et/ou triméthyle). Par exemple, il a été montré que chez Neurospora crassa, DIM5 peut tri-méthyler les H3K9 et chez l’homme, SET7/9 peut uniquement mono-méthyler H3K4 (Tamaru et al., 2003; Xiao et al., 2003). De façon simplifiée, trois sites de méthylation sont impliqués dans l’activation de la transcription : H3K4, H3K36 et H3K79 et à l’inverse H3K9 H3K27 et H4K20 sont quant à eux associés à la répression des gènes. En effet l’utilisation intensive ces dix dernières années des techniques d’immuno-précipitation de la chromatine, associées à l’analyse de la transcription, ont permis d’établir le profil des marques histones le long des gènes selon qu’ils sont actifs ou bien réprimés et ceci pour différentes espèces (Bannister et al., 2005; Barski et al., 2007; Liang et al., 2004; Morris et al., 2005; Pokholok et al., 2005) Figure 6. Ainsi H3K4me3 est enrichie dans la partie 5’ des gènes actifs en association avec l’ARN polymérase sous forme initiée (phos-phorylée sur la sérine 5 au niveau du domaine C-terminale), alors que H3K4me1 et H3K36me3 s’accumulent dans la partie 3’, où l’on retrouve l’ARN polymérase phosphorylée sur la serine 2 signant d’élongation. Concernant la forme di-méthylée de H3K4, sa position diverge entre la levure où elle est étalée le long du gène et chez les eucaryotes supérieurs positionnée à 1 kpb en amont ou en aval du TSS des gènes. De la même manière pour H3K79, le degré de méthyla-tion et la posiméthyla-tion le long du gène varient selon les espèces et peuvent parfois être associés à la répression (Barski et al., 2007; Pokholok et al., 2005; Schubeler et al., 2004). Les mêmes phéno-mènes d’effet de position, sont observables pour les résidus associés à la répression, figure 6. Par exemple H3K9 méthylée au promoteur d’un gène est associée à la répression de ce dernier, alors que positionnée dans la partie codante elle est associée à l’activation (Vakoc et al., 2005). Enfin selon l’espèce, l’effet répressif d’une marque est maintenue mais son profil sur le gène varie, comme pour H3K27me3, qui, chez les mammifères, est principalement retrouvé en partie 5’ et chez la drosophile peut former de larges domaines englobant plusieurs gènes (Boyer et al., 2006; Schwartz et al., 2006).

Différents types de domaines protéiques sont capables de reconnaître les histones méthy-lées. On retrouve les domaines de la famille royale des Tudor (chromodomaines, domaines

Chromatine et régulation de l’expression génique

Tudor, PWWP et MBT), mais également, des protéines avec des domaines PHD (Champagne and Kutateladze, 2009; Maurer-Stroh et al., 2003). Les protéines qui sont ciblées sur ces résidus modifiés peuvent appartenir à des complexes de remodelage ou posséder une activité catalytique capable de modifier les marques histones environnantes. Par exemple la protéine BPTF du com-plexe NURF de remodelage des nucléosomes reconnaît spécifiquement la marque H3K4me3 au niveau des gènes (Wysocka et al., 2006). Un autre exemple est la déméthylase JMJD2A qui par son domaine Tudor peut également reconnaître cette marque (Huang et al., 2006). La fixation de protéines sur ces résidus modifiés peut être spécifique, comme par exemple les protéines à chromodomaine, Polycomb et HP1 (Heterochromatin protéine 1) qui lient spécifiquement et respectivement les marques H3K27me3 et H3K9me2/3 (Bannister et al., 2001; Fischle et al., 2003; Lachner et al., 2001).

Pendant longtemps la méthylation des histones était considérée comme une modification stable. La découverte récente de déméthylase a bien entendu remis en question cette idée. LSD1 fût la première déméthylase à être découverte. Par la suite, un second membre sera identifié LSD2. Toutes deux peuvent déméthyler les lysines mono-, et di-méthylés par une réaction qui utilise le FAD (Flavin adenine dinucleotide) comme co-facteur (Shi et al., 2004). LSD1 n’est pas capable d’agir seule sur les histones des nucléosomes. Elle doit être portée par un complexe qui spécifie le résidu à modifier. Ainsi LSD1 au sein du complexe Co-REST démethyle H3K4, alors que, associée au récepteur des androgènes, elle agit sur H3K9, étant ainsi, co-répresseur dans un cas, ou co-activateur dans l’autre (Metzger et al., 2005; Shi et al., 2005).




  

 

Figure 6 : Profil le long d’un gène des modifications post-traductionnelles des histones associées à un état transcriptionnel

Profil moyen au niveau d’un gène de plusieurs marques histones établi à par-tir d’études sur tout le génome, princi-palement effectuées chez la levure. A chaque marque est associé un état transcriptionnel global observé lors de ces études. Illustration de (Li et al., 2007).

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Peu après, une seconde famille de déméthylase des lysines a été découverte, ces enzymes possèdent un domaine de type JmjC (jumognji C) nécessaire pour son activité catalytique. Cette famille comprend plusieurs membres qui déméthylent des résidus spécifiques des histones te-nant également compte de leur degré de méthylation initiale (Kooistra and Helin, 2012). C’est dans cette famille que l’on retrouve les enzymes capables de déméthyler des lysines tri-méthy-lées. Le mécanisme catalytique de ces démethylases est différent des LSDs, il nécessite le Fe(II) et a-ketoglutarate permettant la déméthylation des résidus mono-, di- et tri-méthylés. Selon le résidu histone ciblé par la déméthylase, celle-ci sera activatrice, comme la déméthylase UTX qui retire une marque de répression en agissant sur H3K27me3, ou bien à l’inverse, sera répressive comme l’enzyme JARID1 qui agit sur H3K4me3 (Christensen et al., 2007; Lee et al., 2007c). Cette réversibilité d’un état transcriptionnel par l’action d’enzymes antagonistes a également été identifiée chez la drosophile (Smith et al., 2008).

Concernant les arginines :

Beaucoup moins étudiée, la modification des arginines est établie par les PRMTS (Protein Arginine MéthylTransferases). Il en existe deux types : Le type I génère la mono- ou di-méthy-lation asymétrique des arginines et le type II génère la mono- ou di-méthydi-méthy-lation symétrique. De la même manière que les lysines méthylées, les arginines peuvent être associées aussi bien à l’activation qu’à la répression des gènes. Le recrutement de ces méthylases aux promoteurs des gènes peut se faire via des facteurs de transcription (Lee et al., 2005a).

Les protéines capables de s’associer à cette modification n’ont pas encore été identifiées, et le mécanisme permettant de retirer cette marque commence tout juste à être percé. En effet, la deimination permet le remplacement d’un résidu arginine par une citruline, par l’action de la protéine PAD14. Ce mécanisme pourrait donc éviter l’apparition de cette modification ou même permettre le remplacent d’une arginine mono-méthylée déjà en place (Cuthbert et al., 2004). Cependant le mécanisme permettant le remplacement d’une citruline par une arginine n’a pas encore été élucidé. Enfin il a été récemment montré que la protéine jumognji JMJD6 était capable de réaliser la déméthylation spécifique des histones H3R2 et H4R3 (Chang et al., 2007), ce qui augure l’existence d’enzymes capables d’agir sur les autres résidus arginines.

2.3. L’ubiquitinylation

Cette modification observée au niveau des lysines des histones consiste en la fixation cova-lente d’un ou plusieurs polypeptides de 76 acides aminés (8kD), l’ubiquitine. Cette modification est donc beaucoup plus « conséquente » que les deux précédentes.

Chromatine et régulation de l’expression génique

L’ajout de l’ubiquitine sur les histones s’effectue en trois étapes nécessitant l’action succes-sive d’enzymes, une enzyme d’activation E1, une enzyme de conjugaison E2 et pour finir une enzyme de liaison E3. L’ubiquitine est transférée de E1 à E2 et sera ensuite fixée au niveau des histones par l’action de E3 (Pickart and Eddins, 2004).

De manière générale, la poly-ubiquitinylation d’une protéine est associée au processus de dégradation de celle-ci. En revanche, au niveau de la chromatine, les H2B et H2A mono-ubiqui-tinylées sont des marques régulatrices de la transcription.

Chez la levure, l’histone H2B est mono-ubiquitinylée (H2Bub) sur la lysine 123 par l’action de Rad6 (E2) et de Bre1 (E3), figure 5. L’étude du gène inductible GAL1 a montré une association transitoire de Rad6 au promoteur du gène qui est nécessaire pour l’initiation de sa transcription. En effet les complexes d’élongation de la transcription Paf1 et Bre1 interagissent permettant ainsi l’association de Rad6 avec l’ARN polyméraseII hyperphosphorylée. De cette association s’ensuivent l’ubiquitinylation de H2B et l’activation du gène (Kao et al., 2004; Xiao et al., 2005). Ainsi H2Bub est impliqué dans la régulation de l’initiation et de l’élongation de la transcription. La même situation existe chez les mammifères ou cette modification apparaît cette fois ci sur la lysine 120, Figure 5. Elle est catalysée par les homologues de Rad6 (hRad6A et B) et de Bre1 (hBRE1/hBRE2) et montre la même association avec le complexe humain PAF, l’homologue de Paf1 de la levure (Kim et al., 2009b).

En plus de ces enzymes, chez l’homme et la drosophile, il a récemment été montré que des protéines du complexe de remodelage de la chromatine BAF250 (Osa chez la drosophile) étaient des ubiquitine-ligases de H2B (Li et al., 2010b), liant ainsi l’ubiquitinylation à la modulation de la chromatine. Une autre particularité chez ces deux espèces, est l’ubiquitinylation de H2A (H2Aub) sur la lysine 119 qui, dans ce cas, correspond à une marque de répression, Figure 5 et

6. En effet, il a été montré que cette marque est retrouvée au niveau des promoteurs des gènes

inactifs où elle interfère sur l’élongation de la transcription ; sa perte entraine leur réactivation (Wang et al., 2004a; Zhou et al., 2008). Par ailleurs l’ubiquitine-ligase responsable de la majo-rité des H2A ubiquitinylées sur la lysine 119, RING1B chez les mammifères et dRing chez la mouche, appartiennent aux complexes répresseurs du groupe Polycomb (PcG) (Lagarou et al., 2008; Wang et al., 2004a). Une autre ubiquitine-ligase associée à la régulation de la transcription et spécifique de la lysine 119 a été identifiée. Cette protéine chez l’homme (2A-HUB) est retrou-vée au sein d’un autre complexe répresseur et permet d’inhiber un groupe spécifique de gènes des macrophages (Zhou et al., 2008).

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Comme pour les autres modifications des histones, il existe des enzymes capables de reti-rer l’ubiquitine au niveau de ces histones. De manière intéressante, Upd8 chez la levure permet de retirer spécifiquement la marque activatrice H2Bub, mais n’agit pas de façon antagoniste en retirant cette marque. En effet l’activation des gènes par ubiquitinylation de H2B nécessite dans un deuxième temps son retrait rapide par Upd8 qui appartient au complexe activateur SAGA (complexe d’acétylation) (Henry et al., 2003). Cet exemple est l’illustration parfaite que les modifications d’histones ne sont pas de simples étiquettes indiquant si un gène est « ON » ou