Recrutement des complexes Polycomb sur leurs gènes cibles

INTRODUCTION

2005; Lo et al., 2009; Shao et al., 1999). Dans le même ordre d’idée, la mutation de RING1B, qui conduit à la perte de H2Aub et à la dérépression des gènes HOX, peut être restaurée par l’ajout de la protéine RING1B mutée au niveau du domaine catalytique nécessaire au dépôt de cette marque (Eskeland et al., 2010).

4.3. Pho-RC chez la drosophile

Un autre complexe associé à la répression génique a été identifié chez la drosophile : le « PHO Repressive Complex » ou Pho-RC (Klymenko et al., 2006) Figure 13E. Il contient la protéine Pleiohomeotic (Pho) qui, à l’inverse des autres protéines du PcG, est capable de lier l’ADN sur des séquences spécifiques, et la protéine dSfmbt qui, via ses répétitions MBT, est capable de se lier aux résidus H3K9 et H4K20 uniquement lorsqu’ils sont mono- ou diméthylés. Les homologues mammifères de ces deux protéines existent (respectivement YY1 et SFMBT), mais aucun complexe de type Pho-RC n’a été identifié. D’autre part, l’existence d’interactions directes entre Pho et les protéines, Pc, Ph et E(z) des deux complexes majeurs PRC1 et PRC2 (Mohd-Sarip et al., 2002; Wang et al., 2004b) suggère une fonction de recruteur pour Pho-RC (développé ci-dessous)

5. Recrutement des complexes Polycomb sur leurs gènes cibles

5.1. PRE « Polycomb Response Element »

L’analyse fonctionnelle des régions régulatrices des gènes HOX chez la drosophile a conduit à l’identification de séquences nécessaires et suffisantes pour le maintien de la répression dépen-dant des protéines du PcG. Ces séquences ont alors été nommées PRE (Polycomb Response Element) (Chan et al., 1994; Simon et al., 1993).

Les PREs sont des séquences de plusieurs centaines de paires de bases, qui peuvent être localisées au niveau des promoteurs, dans les introns ou bien encore à longue distance en amont ou en aval des gènes qu’ils régulent (Negre et al., 2006; Schwartz et al., 2006). Chez la droso-phile, plusieurs PREs ont été caractérisés : des PREs localisés au niveau des complexes, BX-C et ANT-C régulant les gènes HOX, mais également des PREs associés à la régulation d’autres types de gènes tels que les gènes de segmentation hedgehog et engrailed, le gène du PcG, polyhomeotic, ou bien encore le gène codant pour la Cycline A (Bloyer et al., 2003; Busturia and Bienz, 1993; Chan et al., 1994; Gindhart and Kaufman, 1995; Martinez et al., 2006; Maurange and Paro, 2002; Zink et al., 1991). Dans ces études, l’utilisation de mouches transgéniques, qui portent

Polycomb et Trithorax :un système de mémoire cellulaire

dans leur génome la construction d’un PRE associé à un gène rapporteur, tels que mini-white (responsable de la pigmentation rouge des yeux), a permis d’établir quatre caractéristiques prin-cipales qui définissent un PRE fonctionnel : (1) la capacité du PRE à réprimer le gène mini-white. Cette répression est directement observable sur la couleur des yeux de la mouche qui s’éclair-cie et qui, dans certains cas, s’accompagne d’un phénomène de variégation (plusieurs couleurs dans un même œil) dû à une répression métastable du transgène ; (2) on observe une plus forte répression du transgène lorsque deux copies sont présentes sur les chromosomes homologues. Cette deuxième caractéristique que l’on nomme « pairing sensitive silencing » est dûe à l’appa-riement des chromosomes homologues chez la drosophile (Kassis, 2002); (3) Cette répression est levée en contexte mutant pour le PcG et accrue en contexte mutant pour le trxG ; (4) Enfin cette répression étant dépendante des protéines du PcG, la dernière caractéristique des PREs est le recrutement ectopique des protéines du PcG aux sites d’insertion du transgène (Dejardin et al., 2005). Il est cependant à noter que la répression du gène rapporteur peut varier d’un PRE à l’autre. Ainsi, une analyse comparative de deux PREs connus (le PRE Fab7 qui contrôle le gène Abd-B et le PRE du gène Vestigial), a montré des différences considérables entre ces éléments sur leur aptitude à réprimer un gène rapporteur, et par ailleurs, que le site d’insertion de ces éléments peut également modifier leurs propriétés, engageant donc l’environnement génomique dans ce processus (Okulski et al., 2011).

Il existe peu d’homologie entre les séquences des PRE. Cependant plusieurs motifs consen-sus courts capables de fixer spécifiquement des facteurs de liaisons à l’ADN ont été identifiés. Parmi eux, on trouve les motifs de fixation des protéines GAF (GAGA factor) Pho, Phol, Dsp1 (Dorsal switch protein 1) et Zeste (Ringrose and Paro, 2007; Schuettengruber et al., 2009)

Figure 14. Individuellement, ces motifs sont insuffisants pour se comporter comme un PRE.

Il a alors été proposé que c’est la combinaison de plusieurs de ces motifs qui pourrait consti-tuer la signature d’un PRE. Afin de tester cette hypothèse, un algorithme d’identification des PREs à l’échelle du génome a été généré en se basant sur les séquences consensus de fixation de GAF, PHO, PHOL et Zest (Ringrose et al 2003). Cette analyse a conduit à la prédiction d’une centaine de PREs putatifs. Cependant, les analyses, à l’échelle génomique des profils de fixa-tion des différentes protéines du PcG déterminés par des expériences d’Immunoprécipitafixa-tion de la Chromatine (ChIP), ont révélé que seuls 20% des PREs prédits étaient réellement des sites de recrutement de ces protéines (Negre et al., 2006; Ringrose and Paro, 2007; Schwartz et al., 2006; Tolhuis et al., 2006). Ainsi les protéines qui se fixent à ces motifs d’ADN ne sont pas suf-fisantes pour expliquer le recrutement des protéines du PcG aux PREs, ou bien pour attribuer

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INTRODUCTION

une signature particulière à ces séquences. Il est donc plus vraisemblable que d’autres protéines interviennent dans les mécanismes de recrutement et que les PREs arborent alors différentes compositions de motifs ADN nécessaires pour leur fonction.

Enfin, si pendant longtemps les PREs ont été considérés comme inexistants chez les mam-mifères, deux études récentes menées chez l’homme et la souris ont identifié des séquences similaires aux PREs de drosophile qui sont suffisantes pour induire une répression dépendante des protéines du PcG (Sing et al., 2009; Woo et al., 2010). De façon notable, les deux études retrouvent dans la séquence de ces PREs mammifères le motif de fixation de la protéine YY1 (Yin-Yang 1 homologue de Pho). Une des deux études révèle de plus la présence du motif GAGA.

5.2. Modèle de recrutement hiérarchique des complexes du PcG aux PREs

Un certain nombre d’évidences expérimentales a conduit à l’élaboration d’un modèle de recrutement hiérarchique des complexes du PcG au niveau des PREs. Dans ce modèle le com-plexe Pho-RC, arrive en premier pour permettre le recrutement de PRC2 qui à son tour assure l’arrivée du PRC1, Figure 14.

A l’origine de ce modèle, l’identification du chromodomaine de la protéine Polycomb du PRC1 et sa capacité à fixer spécifiquement la marque H3K27me3 déposée par PRC2 (Fischle et al., 2003; Min et al., 2003), suggérent que le recrutement de PRC1 dépendrait de l’action préa-lable de PRC2. En accord avec cette hypothèse, une analyse fonctionnelle du chromodomaine de Polycomb (Messmer et al., 1992) a montré que la mutation de la partie codante de ce domaine entraine la perte de Polycomb au niveau des chromosomes polytènes (présents dans les glandes salivaires, ces chromosomes sont endorépliqués, ce qui facilite l’observation microscopique d’un marquage protéique et permet la localisation des protéines sur le génome à partir de la carto-graphie cytologique établie de cette structure). Par ailleurs, dans la logique de ce recrutement hiérarchique, un certain nombre d’études chez la drosophile et les mammifères a montré que dans des mutants pour des facteurs du PRC2, les protéines du PRC1 sont dissociées de certaines de leurs cibles et que l’inverse n’est pas le cas (Boyer et al., 2006; Cao et al., 2005; Cao et al., 2002; Wang et al., 2004b). Chez les mammifères, deux études ont examiné l’importance de la méthy-lation de H3K27me3 pour le recrutement de PRC1 (Lee et al., 2007c; Mujtaba et al., 2008). Dans ces deux études, par manipulation du niveau de méthylation de ce résidu sans affecter l’intégrité du complexe PRC2, ils ont pu conclure que la présence de cette marque sur la chromatine est corrélée à l’apparition du PRC1.

Polycomb et Trithorax :un système de mémoire cellulaire

Les complexes PRC1 et PRC2 ne possédant pas de facteurs capables de se fixer à l’ADN, d’autres facteurs protéiques doivent être capables d’adresser spécifiquement ces complexes sur leurs cibles. Chez la drosophile, les protéines GAF, Pho, Phol, Dsp1 et Zeste (qui comme nous l’avons vu précédemment se fixent spécifiquement sur des motifs ADN aux PREs) constituent donc de très bons candidats. La protéine du PcG, Pho qui forme le complexe Pho-RC a été rapi-dement désignée comme recruteur principal des complexes du PcG à la suite de nombreuses constatations expérimentales : la perte d’activité de certains PREs ou l’absence de recrutement des protéines du PRC1 ou PRC2 au niveau de leurs cibles dans des mutants Pho et/ou Phol, ou bien lorsque le site de fixation de Pho est muté (Brown et al., 2003; Brown et al., 1998; Fritsch et al., 1999; Klymenko et al., 2006; Wang et al., 2004b), la présence du motif Pho sur un grand nombre de PREs (Mihaly et al., 1998), l’existence d’interactions protéiques entre pho ou phol avec les protéines du PRC2, E(z) et Esc (Wang et al., 2004b) et enfin des études plus récentes qui montrent que la grande majorité des sites occupés par les protéines du PcG sur le génome est également associée avec la protéine Pho dans l’embryon et dans des tissus larvaires de droso-phile (Kwong et al., 2008; Oktaba et al., 2008; Schuettengruber et al., 2009).



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Figure 14 : Recrutement hiérarchique des complexes du PcG au PRE

Les protéines du PcG forment trois principaux complexes : PRC1 en bleu, PRC2 en rouge et Pho-RC en vert. Chez la drosophile, les PREs sont composés d’une combinaison de motifs ADN qui sont fixés spécifiquement par les protéines, Pho, Dsp1 et GAF. Ces protéines à l’heure actuelle sont considérées comme les recruteurs principaux des complexes du PcG. Le modèle de recrutement hiérarchique propose : 1 l’arrivée de Pho-RC par la fixation spécifique de Pho sur sa séquence et de dSfmbt qui reconnait la marque H4K20me1/2; 2 l’interaction de Pho avec les protéines E(z) et Esc pourrait être à l’origine du recrutement de PRC2 qui à son tour va trimé-thyler H3K27; 3 cette marque est alors reconnue par le chromodomaine de Polycomb qui appartient au PRC1 et dont la protéine dRing permet de déposer la marque H2AK119ub. Figure inspirée de (Schwartz and Pirrotta, 2007), nucléosome provenant d’une illustration de (Simon and Kingston, 2009).

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INTRODUCTION

5.3. Contradictions avec ce modèle et autres aspects du recrutement

Si l’ensemble de ces études nous conduit à un modèle simple du recrutement des com-plexes du PcG sur la chromatine, il apparaît cependant que ce modèle n’est pas valable dans tous les contextes. De nombreux travaux se dirigent vers un ciblage répondant à des stratégies différentes.

Chez la drosophile, des arguments convergent en effet vers l’idée que le recrutement de PRC1 peut également se faire de manière indépendante de la marque H3K27me3 : (1) la non coïncidence sur le génome de PRC1 et de H3K27me3, où l’on observe les protéines PRC1 enri-chies uniquement sur la région du PRE alors que la marque H3K27me3 s’étend tout le long du gène (Schwartz et al., 2006); (2) la rétention de PRC1 sur la chromatine même après la réduction de H3K27me3 dans un mutant de Pcl (Nekrasov et al., 2007); (3) ou encore l’existence d’interac-tions directes entre les protéines Pc et Ph avec Pho (Mohd-Sarip et al., 2002). Il a également été proposé que l‘interaction de PRC1 avec H3K27me3 serait en définitive nécessaire à la formation de boucles d’ADN permettant le rapprochement progressif du PRE au promoteur du gène, expli-quant ainsi l‘étalement de H3K27me3 le long du gène.

En ce qui concerne Pho, bien que ce facteur semble nécessaire à la répression dépendante des protéines du PcG, son rôle dans le recrutement des complexes n’est pas très clair. En effet dans un mutant Pho/Phol, les sites immunomarqués par les protéines du PcG sur les chromo-somes polytènes sont peu ou pas altérés (Brown et al., 2003). D’autre part, si l’ensemble des cibles du PcG dans l’embryon de drosophile est corrélé à la présence de Pho, il existe une multitude de sites Pho qui n’a pas de protéines du PcG, indiquant que si ce facteur est nécessaire au recrute-ment des protéines du PcG il n’est cependant pas suffisant (Schuettengruber et al., 2009). Dans cette étude il est proposé que la discrimination entre un site Pho associé au PcG avec un site Pho transcriptionnellement actif peut se faire en mesurant le ratio Pho/Phol sur ces sites. Quand ce ratio est élevé, il s’agit d’un site répressif associé aux protéines du PcG et, à l’inverse, quand il est faible le gène associé est actif.

Chez les mammifères de la même manière, un certain nombre d’éléments indique que les protéines du PRC1 peuvent également être recrutées sur la chromatine indépendamment de H3K27me3 : (1) Dans différents mutants du PRC2, les protéines du PRC1 peuvent être mainte-nues sur plusieurs sites dans le génome (Dietrich et al., 2012; Yu et al., 2012) et tout particuliè-rement sur le chromosome X, lors du processus de compensation de dose, où le recrutement des protéines du PRC1 peut apparaître en l’absence de H3K27me3 (Schoeftner et al., 2006; Tavares et al., 2012); (2) l’existence de nombreuses régions recouvertes par H3K27me3 sans la présence

Polycomb et Trithorax :un système de mémoire cellulaire

des membres du PRC1 (Ku et al., 2008); (3) ou à l’inverse, l’existence de quelques sites sur le gé-nome où l’enrichissement des protéines du PRC1 n’est pas corrélé avec la présence de H3K27me3 (Gao et al., 2012; Trojer et al., 2011). Il faut toutefois préciser que dans ces études les complexes formés ne correspondent pas au PRC1 classique, mais à des variants de celui ci, où l’on re-trouve associées d’autres protéines non PcG, comme par exemple les facteurs de transcriptions, E2F6, REST, l’hétérodimères Runx1/CBFb, des protéines à domaine MBT ou encore la protéine RYBP (RING1/YY1-binding protein). L’association des protéines du PcG avec des facteurs de transcription pourrait justement expliquer comment ces protéines sont adressées au niveau de l’ADN. Par ailleurs, il a également été avancé que la formation de tels complexes permettrait aux protéines du PcG d’être recrutées à des stades spécifiques du développement (Kim et al., 2009a; Qin et al., 2012), dans des tissus particuliers (Yu et al., 2012) et de cibler alors différents types de gènes selon le complexe formé (Gao et al., 2012; Herranz et al., 2008).

En ce qui concerne le facteur YY1 (Pho chez la drosophile), si il s’est révélé nécessaire pour l’association du PRC2 sur un petit groupe de gènes dans les myoblastes de souris (Caretti et al., 2004), son profil sur tout le génome dans des cellules souches embryonnaires de souris n’est pas corrélé à celui des protéines du PcG. YY1 aurait alors dans cette espèce une implication moins importante pour le recrutement des protéines du PcG.

Enfin chez les mammifères, les ARNs non codants (ARNnc) sont des acteurs cruciaux pour le recrutement des protéines du PcG et la répression génique. Ils interviennent, par exemple dans l’inactivation du chromosome X (Maenner et al., 2010; Zhao et al., 2008), pour l’empreinte parentale (Pandey et al., 2008), pour la répression des gènes HOX (Chu et al., 2011; Rinn et al., 2007) ou pour d’autres gènes régulés par les protéines du PcG (Kanhere et al., 2010).

En conclusion, la difficulté à établir un mécanisme ou à identifier les facteurs expliquant le recrutement des protéines du PcG sur leurs gènes cibles, reflète certainement l’existence d’une régulation complexe pour le recrutement de ces protéines qui varie selon le tissu, le stade du développement et peut être même la cible génique.