Partie II : Ciblage dynamique et différentiel des complexes
3. Cibles des protéines du PcG entre les disques d’œil et d’aile
Concernant la question d’un ciblage « tissu-spécifique » des protéines du PcG, la représen-tation des résultats en venn diagrammes Figure 29 A et, Figure 30 A montre que certains gènes sont uniquement ciblés dans l’un des deux tissus larvaires (61 gènes pour le disque d’œil et 279 pour celui d’aile). Cette observation va dans le sens d’une « réquisition » variable des protéines du PcG selon le processus de différenciation tissulaire (œil versus aile) dans lequel le tissu
s’en-Table 3 : Ontologies des différentes classes de gènes cibles des protéines du PcG
A : gènes ciblés par Pc, Ph et marqués par H3K27me3 dans les disques imaginaux d’oeil et d’aile B : gènes seulement marqués par H3K27me3 dans les disques imaginaux d’oeil et d’aile C : gènes ciblés seulement par Pc et Ph dans les disques imaginaux d’oeil et d’aile
Pour ces trois listes de gènes, a été réalisée une analyse de leurs ontologies par l’utilisation du logiciel DAVID avec la méthode FAC (Functional Annotation Clustering). Dans les tables sont présentés quelques exemples des termes les plus significatifs des « cluster » (voir annexe 3 pour l’ensemble des termes de ces « clusters »). Pour chaque classe de gènes cibles des protéines du PcG, les tables indiquent : la catégorie de l’ontologie –MF (Molecular Function), BP (Biological Process), CC (Cellular Component) – , le terme de l’ontologie , l’enrichisse-ment du « clusters » et des termes associés , la p-value du terme corrigé par la méthode « benjamini », le FDR (False Discovery Rate) qui correspond au pourcentage de faux positifs accepté.
Ciblage dynamique et différentiel des complexes Polycomb au cours du développement
« Pc-‐Ph-‐K27me3 » disques
« Pc-‐Ph seuls » disques « H3K27me3 seuls » disques
B
A
C
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RESULTATS ET DISCUSSION
gage. Toutefois, on s’attendrait à observer des niveaux transcriptionnels pour ces deux groupes de gènes différents, entre le tissu où ils sont cibles et celui où ils ne le sont pas. Or, après ana-lyse des données de RNAseq des disques d’œil et d’aile (données du laboratoire de Montserrat Corominas en cours de publication), nous voyons que ce n’est pas le cas, Figure 30 A. En effet, que ce soit pour des cibles uniquement de l’œil ou bien de l’aile, le résultat est le même : leur expression globale dans les deux tissus ne varie pas. Par ailleurs, si l’on compare les enrichisse-ments en Pc, Ph et H3K27me3 pour les gènes ciblés uniquement dans un disque à ceux observés pour les gènes communs aux deux types de disques, on remarque qu’ils sont considérablement plus faibles sur les premiers, Figure 30 B. Cette dernière observation pourrait justement expli-quer pourquoi au cours de l’analyse, ces gènes ont été classés comme spécifiques d’un seul tissu et sont donc probablement de faux « tissu-spécifiques ». En effet, ces gènes faiblement fixés par les protéines du PcG (c’est à dire probablement réprimés dans peu de cellules) ont été distribués soit dans l’œil soit dans l’aile, car une ou plusieurs protéines PcG ou la marque H3K27me3 n’ont pas été considérées comme significativement enrichies lors de l’analyse informatique pour l’un ou l’autre des tissus. Par contre, par une analyse visuelle au cas par cas, nous constatons que de faibles enrichissements existent de facto là où l’analyse informatique les a exclus du fait du seuil prédéfini. Il existe donc une variabilité dans le niveau des enrichissements entre œil et aile mais pas dans la nature des cibles. Cette variabilité d’enrichissement reflète probablement l’hétérogé-néité cellulaire entre disques mais également l’efficacité de la technique de ChIP (les expériences de ChIP dans le disque d’aile montrent effectivement de manière globale des enrichissements plus élevés en comparaison de ceux mesurés pour le disque d’œil).
En recherchant maintenant des gènes réellement spécifiques de l’œil, c’est à dire qui n’ont absolument aucun enrichissement pour Pc, Ph ou H3K27me3 dans l’aile et inversement, comme attendu, très peu de gènes apparaissent spécifiques d’un tissu (1 gène pour l’œil et 23 pour l’aile). Encore une fois, ces quelques gènes ne sont pas fortement enrichis en protéines du PcG dans un tissu par rapport à l’autre et ne montrent pas de différences transcriptionnelles radicalement différentes entre le disque d’œil et d’aile, ce que l’on aurait pu attendre dans le cas d’un ciblage des protéines du PcG de manière « tissu-spécifique ».
En conclusion, malgré les différences morphologiques majeures qui existent entre un œil et une aile, les protéines du PcG vont, au stade larvaire, réguler les mêmes gènes dans ces deux tissus. En définitive, cette observation n’est pas si surprenante car elle corrobore l’analyse trans-criptionnelle des différents tissus larvaires qui avait révélé que les disques imaginaux avaient des profils de transcription très proches en comparaison avec les autres tissus de la larve (Klebes et
Ciblage dynamique et différentiel des complexes Polycomb au cours du développement
al., 2002). Ainsi, à partir des mêmes gènes mais avec une régulation différente dans le temps et dans l’espace peuvent se former des tissus en apparence très différents.
Enfin, même si dans les disques d’œil et d’aile s’expriment un grand nombre de gènes en commun, il existe néanmoins des gènes « sélecteurs » dont l’expression apparaît uniquement dans certains domaines de l’un des deux tissus. Ces gènes sont des cibles des protéines du PcG, aussi bien dans le disque d’œil, que dans celui d’aile. Comme nous l’avions observé dans la pre-mière partie des résultats, ces gènes sont ciblés dans les deux tissus, car ils sont complètement « OFF » dans un tissu et « ON/OFF » dans l’autre. Nous pouvons maintenant comparer tout le long de ces gènes leurs profils Polycomb entre ces deux tissus. Comme suggéré dans la première
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 RPK M RPK M RNAseq œil RNAseq œil aile aile 0" 2" 4" 6" 8" 10" Pc" Ph" H3K27me3" Enrichissemen ts
ChIPseq dans l’œil
0" 4" 8" 12" 16" 20" Pc" Ph" H3K27me3"
ChIPseq dans l’aile
Enrichissemen
ts
Cibles des PcG dans les deux disques
Cibles des PcG uniquement dans le disque d’aile Cibles des PcG uniquement dans le disque d’œil
A
B
301 279
61
Figure 30 : Pas de gènes cibles des protéines du PcG spécifiques des disques d’œil ou d’aile
A : Blox plot des données d’ARNseq dans le disque d’œil et celui d’aile. Sont comparés ici, les distributions des
niveaux transcriptionnels en RPKM (Nombre de reads par kb et par millions de tags séquencés dans l’expé-rience) des transcrits entre le disque d’œil et celui d’aile : à gauche pour les gènes cibles des protéines du PcG uniquement de l’œil (violet), à droite pour ceux uniquement de l’aile (vert clair). Dans les deux cas, comme illustré par les box plot et confirmé par un test statistique de wilcoxon, il n’existe pas de différence transcrip-tionnelle entre les disques pour ces deux groupes de gènes.
B : Enrichissement moyen de Pc, Ph et H3K27me3 d’après les données de ChIPseq des disques d’œil et d’aile.
Ces deux graphiques montrent, pour l’œil (à gauche) et pour l’aile (à droite), que les enrichissements de Pc, Ph, et de H3K27me3 sont plus faibles quand il s’agit d’un gène cible des protéines du PcG, uniquement dans un des deux disque imaginaux (violet pour l’œil et vert clair pour l’aile) et ceux en comparaison avec les gènes cibles des deux disques (vert foncé).
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RESULTATS ET DISCUSSION
partie des résultats, ces gènes ont bien au niveau de leurs promoteurs des pics de Pc et Ph et H3K27me3 le long du gène, cependant dans leur tissu d’expression, on observe une nette dimi-nution du niveau de H3K27me3 dans leurs parties codantes (exemple des gènes ey et vg dans la Figure 31, conclusion similaire pour les gènes : toy et Antp). Ce type de régulation, où seule la distribution de H3K27me3 varie entre tissus exprimant ou bien réprimant transcriptionnel-lement un gène, avait été suggérée par des expériences menées sur la régulation du gène Hox Ubx (Papp and Muller, 2006). Ainsi les premières observations des travaux de Papp et Muller, pour le gène Ubx et le ciblage des protéines du PcG sur ce gène entre le disque d’aile et celui d’haltère abordées précédemment, semblent être généralisables à plusieurs cibles des protéines du PcG. Papp et Muller suggèrent toutefois que dans le tissu ou le gène s’exprime, H3K27me3 disparaitrait de la partie codante pour être relocalisé en amont du gène ; nous n’observons pas ce phénomène dans notre étude menée à l’échelle du génome.
Pc H3K27me3 Ph (+) (-‐) 348 0 306 0 0 0 0 0 302 353 277 350 ey Disque d’œil ON/OFF 4 Pc H3K27me3 Ph OFF Disque d’aile vg Disque d’œil OFF ON/OFF Disque d’aile (+) (-‐) 2R Reads
Figure 31 : Le profil de H3K27me3 le long d’un gène indique son état transcriptionnel dans les disques imaginaux
Illustration des profils de ChIP de Ph, Pc et de H3K27 pour les gènes sélecteurs de l’œil (ey à gauche) et de l’aile (vg à droite), dans les disques d’œil (violet) et d’aile (vert). Ces deux gènes identifiés comme cibles des protéines du PcG dans l’embryon apparaissent également comme cibles dans les disques imaginaux d’œil et d’aile. Cependant dans leur tissu d’expression respectif (le disque d’œil pour ey et celui d’aile pour vg), le niveau de H3K27me3 le long du gène est diminué en comparaison avec le tissu où ils sont complètements réprimés. Notons également que pour Pc et Ph on observe plus de signaux, dans les deux cas le long des gènes, pour le disque d’aile, cependant ceci est observé de manière générale sur tout le génome pour les données de l’aile qui sont plus bruitées.
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