Les complexes Polycomb et leurs activités biochimiques

Des études biochimiques, menées dans le but de comprendre comment les protéines du PcG maintiennent la répression des gènes HOX, ont permis d’identifier deux principaux com-plexes Polycomb que l’on retrouve chez la drosophile et chez les mammifères : le complexe PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1) et le complexe PRC2. Le PRC2 est responsable du dépôt de la marque caractéristique de la répression par les protéines du PcG, la méthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27). PRC1 quant à lui est le complexe qui exécute la répression, et est carac-térisé par sa capacité à ubiquitinyler la lysine 119 de l’histone 2A (H2AK119). Sur la base des tra-vaux menés sur la régulation des gènes homéotiques, il a été établi un modèle d’action coopératif et séquentiel entre ces deux complexes Polycomb. En réalité, les mécanismes de recrutement et d’action de ces complexes pour bloquer la transcription de leurs cibles ne sont pas complè-tement élucidés et revêtent probablement diverses formes. Selon l’espèce, des variations de ces deux principaux complexes par l’addition, la perte ou la substitution de certaines protéines ou isoformes ont également été identifiées. Enfin chez la drosophile l’unique protéine du PcG à posséder un domaine de fixation à l’ADN, Pleiohomeotic, forme un complexe indépendant des deux premiers, Pho-RC (Pleiohomeotic Repressive Complex) Figure 13.

4.1. PRC2 et la méthylation de H3K27

Chez la drosophile et chez les mammifères la purification du PRC2 a permis l’identifica-tion de quatre protéines principales (Kuzmichev et al., 2002; Muller et al., 2002), Figure 13A. La fonction enzymatique associée à ce complexe est la méthylation de H3K27 exécutée par le domaine SET de la protéine Enhancer of zeste (E(z)) chez la drosophile et EZH2 chez les mam-mifères (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002). Cependant, cette enzyme est inactive à l’état monomérique. Elle requiert au moins la présence de deux autres membres du complexe pour exécuter sa fonction catalytique : Extra sexcombs (Esc chez la drosophile, EED chez les

mam-52

INTRODUCTION

A  /  PRC2  

B  /  PRC1   C  /  dRAF   D  /  PR-­‐DUB  

E  /  Pho-­‐RC  

Dépôt  de  H3K27me3  et   fixa2on  de  ce6e   marque  

Dépôt  de  H2Aub,  fixa2on   de  H3K27me3  

Retrait    de   H2Aub  

Fixa2on  sur  l’ADN,  reconnaissance  de   H3K9me1/2  et  H4K20me1/2  

PCL1  (PHF1)   PCL2  (MTF2)   PCL3  (PHF19)   Esc   p55   Su(z)12   Pcl   E(z)   EZH1   EZH2   SUZ12   EED1-­‐4   RBap48   RbAp56   Pc   Ph   Psc   ^dRing   CBX2   CBX4   CBX6   CBX7   CBX8   PHC1   PHC2   PHC3   PCGF1  (NSPc1)   PCGF2  (MEL18)   PCGF3   PCGF4  (BMI1)   PCGF5   PCGF6  (MBLR)   RING1A  (RNF1)     RING1B  (RNF2)   dSfmbt   Pho   SFMBT   Psc   ^dRing   dKDM2   Dépôt  de  H2Aub,    

déméthyla2on  de  H3K36me2  

Calypso   Asx  

ASX   BAP1  

KDM2B  

Figure 13 : Complexes du groupe Polycomb chez la drosophile

Sont représentés de A-E les différents complexes Polycomb identifiés chez la drosophile. Les protéines princi-pales qui les composent (ronds ou ovales de couleurs), ont des homologues chez les mammifères, leurs noms chez l’homme sont indiqués au dessus de chacune d’entre elles et peuvent avoir plusieurs isoformes, entre parenthèse le nom chez la souris. Pour chaque complexe, A/ PRC2, B/ PRC1, C/ dRAF, D/ PR-DUB et E/ Pho-RC, les fonctions qui leurs sont associées sont indiquées dans un encadré de la même couleur que le complexe. Les protéines qui portent une activité catalytique, E(z), dRing, dKDM2, Calypso sont plus claires dans leur centre.

Polycomb et Trithorax :un système de mémoire cellulaire

mifères) et Su(z)12 chez la drosophile, SUZ12 chez les mammifères) (Ketel et al., 2005; Pasini et al., 2004). Chez la drosophile, la perte de fonction de E(z) entraine l’absence de la mono-, di- et triméthylation de H3K27 sur le génome, indiquant que c’est l’unique activité méthyl-transférase agissant sur ce résidu (Ebert et al., 2004). Seule la forme H3K27me3 est corrélée à la répression transcriptionnelle et sa présence sur le génome est associée à celle des protéines du PcG. La fonction exacte de H3K27me2, qui recouvre 50% du génome, n’est pas connue ; il est néanmoins envisageable que sur les gènes associés aux protéines du PcG elle puisse constituer un substrat intermédiaire empêchant ainsi l’acétylation de ce résidu, cette dernière constituant une marque antagoniste activatrice. D’autre part il a été montré que la perte de fonction de la protéine Pcl (polycomb like) de drosophile, ou bien de son homologue mammifère PHF1, induit une diminution du niveau de H3K27me3 sur les gènes cibles des protéines du PcG entrainant la dérepression de certains gènes HOX. En revanche, la marque H3K27me2 n’apparaît pas signi-ficativement altérée (Cao et al., 2008; Nekrasov et al., 2007; Sarma et al., 2008). Ce complexe PRC2-Pcl serait ainsi nécessaire pour établir le niveau approprié de H3K27me3 nécessaire à la répression dépendante des protéines du PcG Figure 13A.

L ‘existence d’isoformes des protéines du PRC2 permet de modifier la composition biochi-mique de ce complexe et probablement de l’associer à différentes fonctions biologiques. Cela se vérifie chez les mammifères où EZH2 et son homologue EZH1 peuvent former des complexes distincts. Le rôle de cette substitution de EZH2 par EZH1 n’est pas très bien compris à l’heure actuelle. Ces complexes semblent partager un certain nombre de cibles sur le génome. Pourtant, la perte d’EZH1 n’affecte pas la méthylation de H3K27me3 (Margueron et al., 2008; Shen et al., 2008). De manière encore plus surprenante, une étude vient de révéler que le complexe EZH1-PRC2 est associé sur le génome avec la marque activatrice H3K4me3, l’ARN polymérase II et la production d’ARN messagés ; ceci suggère un rôle du complexe EZH1-PRC2 dans l’activation de la transcription au cours de la différenciation des cellules des muscles squelettiques (Mousavi et al., 2012). D’autre part, chez les mammifères, la transcription alternative à partir de différents TSSs du gène EED peut générer quatre isoformes et former ainsi d’autres complexes PRC2 pré-sentant des spécificités de substrats différentes in vivo, comme la méthylation de H1 (Kuzmichev et al., 2004; Kuzmichev et al., 2005). Enfin, chez la drosophile, l’unique cas rapporté est celui des protéines Esc et Escl qui sont codées par deux gènes différents, et peuvent être échangées dans le complexe PRC2. L’activité catalytique du complexe Esc-PRC2 est plus forte que celle du com-plexe Escl-PRC2, mais la fonction exacte de ces deux comcom-plexes reste encore à élucider (Ohno et al., 2008).

54

INTRODUCTION

La fonction répressive du PRC2 réside dans la déposition de la marque H3K27me3 qui, une fois reconnue par le chromodomaine de la protéine Pc, va permettre l’intervention du PRC1. Cependant il a également été montré qu’il pouvait exister une coopération de PRC2 avec la déméthylase RBP2 qui retire la méthylation de H3K4, précisant ainsi comment la mise en place de la répression génique peut être effectuée (Pasini et al., 2008).

4.2. PRC1 et l’ubiquitinylation de H2AK119

Le PRC1, initialement purifié à partir d’embryon de drosophile, contient de manière stœ-chiométrique les protéines du PcG, Polycomb (Pc), Polyhomeotic (Ph), Posterior sex combs (Psc) et Sex combs extra (Sce, également connu sous le nom de dRing) (Saurin et al., 2001; Shao et al., 1999) Figure 13B. Les protéines homologues chez les mammifères forment également un com-plexe stable (Levine et al., 2002). Cependant, la multitude de paralogues pour les gènes codant ces protéines (Figure 13b) peut générer plusieurs complexes. On parlera alors chez les mammi-fères de la famille des PRC1.

La protéine dRing/Sce et son homologue mammifère (RING1B/RNF2) sont des E3 ubiqui-tine ligases capables de mono-ubiquitinyler la lysine 119 de H2A (H2AK119), qui est une marque associée à la répression transcriptionnelle (Buchwald et al., 2006; Wang et al., 2004a). Pendant longtemps, cette marque a donc été naturellement attribuée au complexe PRC1. Cependant, d’autres complexes chez la drosophile et les mammifères ont été identifiés comme porteurs de cette activité H2AK119 ubiquitine ligase. Ces complexes sont composés de quelque unes des pro-téines du PRC1 canonique et de propro-téines ne faisant pas partie du PcG. Ainsi, chez la drosophile, une étude récente (Lagarou et al., 2008) a identifié le complexe dRAF (dRing associated factor) se composant principalement des protéines du PcG, Psc, dRing/Sce (mais pas des protéines Pc et Ph) et de la protéine dKDM2 qui est une déméthylase spécifique de H3K36me2, Figure 13c. Ce complexe peut donc à la fois retirer une marque d’activation (H3K36me2) et déposer une marque répressive (H2Aub). Dans cette étude, ils ont également montré que PRC1 et dRAF correspondent bien à deux complexes distincts capables de coopérer pour réguler un certain nombre de gènes en commun. La perte de fonction de Pc ou bien de Ph du PRC1 n’affecte pas la marque H2Aub, faisant de dRAF, le complexe principalement responsable de cette marque. Chez les mammifères de manière similaire le complexe BCOR avait été identifié auparavant et possède également les protéines homologues de Psc et dRing/sce ainsi que d’autres protéines non PcG dont l’une d’entre elles possède aussi l’activité déméthylase de H3K36 (Gearhart et al., 2006). De plus chez les mammifères, des analyses protéomiques des protéines du PRC1 et

Polycomb et Trithorax :un système de mémoire cellulaire

de leurs paralogues ont mis en évidence l’existence d’une multitude d’autres complexes dont la composition en protéines du PRC1 varie et où l’on retrouve diverses protéines non PcG (Cao et al., 2002; Cao and Zhang, 2004; Gao et al., 2012; Lee et al., 2007b; Ogawa et al., 2002; Qin et al., 2012; Tavares et al., 2012; Trojer et al., 2011). Ces différents complexes sont tous associés à la répression génique. Certains d’entre eux sont capables de déposer des marques répressives telles que H2Aub ou bien la méthylation de H3K9 ou bien encore de retirer la marque d’activation H3K4me3. De plus, ont été retrouvés dans certains de ces complexes des facteurs répresseurs pouvant se lier à l’ADN, ce qui pourrait permettre d’expliquer l’association de ces complexes au niveau de l’ADN. Parmi eux, on retrouve des facteurs connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle de la prolifération cellulaire, comme le facteur E2F ou encore des protéines suppres-seurs de tumeurs possédant des domaines MBT (malignant brain tumor) capables de se lier sur la chromatine.

Le mécanisme par lequel les protéines de cette famille de complexes exercent la répression de leurs gènes cibles n’est pas encore élucidé. Si certaines études ont proposé quelques pistes, elles amènent toutefois à des conclusions contradictoires. Il a tout d’abord été proposé que le complexe PRC1 chez la drosophile interfère sur l’initiation de la transcription (Dellino et al., 2004). Cependant cela serait le cas d’un nombre restreint de gènes cibles. D’autres études attri-buent plus volontiers une action des PcGs sur l’étape d’élongation de la transcription. En effet il existe une forte corrélation entre la localisation des protéines du PcG sur le génome et la présence de l’ARN polymérase II en état de pause, sur des gènes réprimés ou très peu transcrits (Brookes et al., 2012; Enderle et al., 2011; Lehmann et al., 2012; Stock et al., 2007; Wang et al., 2004a). Par ailleurs, la réactivation des gènes lors de la perte de fonction des protéines du PcG serait dûe à la perte de H2Aub. Chez la drosophile, une étude récente a identifié le complexe PR-DUB (Polycomb Repressive DeUbiquitinase) formé des protéines du PcG, Asx et Calypso une enzyme capable de retirer l’ubiquitinylation de H2A (Scheuermann et al., 2010) Figure 13D. De façon paradoxale, bien qu’agissant de façon antagoniste sur la marque H2Aub, ce complexe PR-DUB est cependant nécessaire pour la répression des gènes. Les auteurs proposent que le méca-nisme de répression par les protéines du PcG nécessite un équilibre de H2Aub, dynamiquement régulé par l’intervention de PRC1 et de PR-DUB.

Enfin certaines études n’associent pas la répression aux marques d’histones, mais à une ca-pacité intrinsèque de certaines des protéines du PRC1. En effet, il a été observé que ces protéines sont capables in vitro d’inhiber le remodelage de la chromatine et d’induire la compaction d’un assemblage d’ADN et d’histones dépourvues de leurs queues (Francis et al., 2004; King et al.,