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Caractérisation et régulation des régimes de cavitation

ultrasonore pour la sonoporation cellulaire

Corentin Cornu

To cite this version:

Corentin Cornu. Caractérisation et régulation des régimes de cavitation ultrasonore pour la sono-poration cellulaire. Acoustique [physics.class-ph]. Université de Lyon, 2018. Français. �NNT : 2018LYSE1121�. �tel-02073575�

No d’ordre NNT : 2018LYSE1121

TH`

ESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSIT´

E DE LYON

op´er´ee au sein de

l’Universit´e Claude Bernard Lyon 1 ´

Ecole Doctorale MEGA 162

M´ecanique, ´Energ´etique, G´enie Civil, Acoustique

Sp´ecialit´e de doctorat : Discipline : ACOUSTIQUE

Soutenue publiquement le 03/07/2018, par :

Corentin Cornu

Caract´

erisation et r´

egulation des

r´

egimes de cavitation ultrasonore pour

la sonoporation cellulaire

Devant le jury compos´e de :

BRIDAL Lori, Directrice de recherche CNRS, Universit´e Pierre-et-Marie Curie, Paris Rapporteur DOS SANTOS Serge, Maitre de Conf´erence HDR, INSA Centre Val-de-Loire, Blois Rapporteur

DER LOUGHIAN Christelle, Maitre de Conf´erences, INSA Lyon Examinatrice

MARMOTTANT Philippe, Directeur de recherche CNRS, Universit´e Grenoble Alpes Examinateur

MENSAH Serge, Maitre de Conf´erences, ´Ecole Centrale de Marseille Invit´e

Caract´erisation et r´egulation des r´egimes de cavitation ultrasonore pour la sono-poration cellulaire Dans l’objectif de limiter les effets destructeurs de l’implosion de bulles de cavitation ultrasonore, un r´egime d’oscillations stables de bulles doit potentiellement ˆetre vis´e pour des applications th´erapeutiques sensibles comme l’ouverture de la barri`ere h´emato-enc´ephalique. Ce-pendant, garantir une activit´e d’oscillations stables est difficile de par le caract`ere stochastique de la cavitation ultrasonore, et de la coexistence de bulles oscillantes (cavitation stable) et implosantes (cavitation inertielle) au sein d’un nuage de bulles. Il est donc n´ecessaire de contrˆoler spatialement et temporellement le ph´enom`ene de cavitation en discriminant les r´egimes de cavitation stable ou inertielle, au cours de la dur´ee d’un tir ultrasonore, et ce en r´egime puls´e. Dans une premi`ere ´etude, la dynamique d’un nuage de bulles monodisperses et uniform´ement r´eparties dans l’espace met en ´

evidence l’effet de l’interaction entre bulles sur le seuil de cavitation stable : il s’abaisse en pression et la fr´equence de r´esonance des bulles se d´ecale en fonction de la densit´e de bulle. Il est ainsi montr´e qu’il existe une densit´e de bulle optimale pour l’´emission de la composante sous-harmonique. Ensuite, une strat´egie de contrˆole est d´evelopp´ee, bas´ee sur une boucle de r´etroaction r´egulant la signature acoustique d’un r´egime donn´e de cavitation. L’utilisation de la strat´egie d’asservissement permet de discriminer les r´egimes de cavitation stable et inertielle au cours du temps, mais aussi de garantir une activit´e de cavitation plus stable temporellement, plus reproductible, et ce pour des ´energies acous-tiques moyennes d´elivr´ees inf´erieures. Enfin, le processus de contrˆole est utilis´e exp´erimentalement pour des applications in-vitro de sonoporation cellulaire. Tout d’abord, une ´etude de sonoporation en cavitation inertielle r´egul´ee met en ´evidence l’am´elioration de la reproductibilit´e des taux de sonopo-ration obtenus, et la possibilit´e de s’affranchir de l’utilisation d’agents de contraste comme agents de nucl´eation. Ensuite, une ´etude en cavitation stable r´egul´ee met en ´evidence la possibilit´e de sonoporer des cellules en limitant les activit´es de cavitation inertielle, et donc potentiellement en limitant la lyse cellulaire.

Cavitation ultrasonore ; cavitation stable ; ´emission sous-harmonique ; cavitation iner-tielle ; Boucle d’asservissement ; sonoporation cellulaire in vitro

Characterization and control of the regimes of ultrasonic cavitation for cells so-noporation In the aim of limiting the destructive behavior of collapsing cavitation bubbles, an exclusively stable cavitation state is targeted for sensitive therapeutics applications like blood-brain barrier opening. Ensuring a stable cavitation regime is complex because of (i) the coexistence of stably oscillating bubbles and collapsing bubbles in the same bubble cloud, and (ii) the stochastic behavior of the phenomenon during time. Therefore, it is necessary to control spatially and temporally the ca-vitation activity, by discriminating the stable from the inertial regime. Firstly, the theoretical study of the dynamics of a monodisperse and homogeneous cloud shows a modification of the stable cavitation threshold as a function of the bubble density : the subharmonics emission threshold is lowered and the resonance frequency is shifted. The study leads also to the expression of a particular microbubbles density leading to optimized subharmonics emission. Secondly, a real-time control strategy based on a feedback loop process on subharmonics emission is designed. The use of this strategy allows discrimi-nating the two cavitation states during time, and ensures a better reproducibility, time-stability and an acoustic energy gain. The control device is used for cells sonoporation in-vitro. In a first study, the sonoporation by inertial cavitation control is performed in a stationary ultrasonic field configuration. This leads to high sonoporation efficiency coupled to the possibility of counterbalancing the use of supplementary nuclei (encapsulated microbubbles). In a second one, the stable cavitation control ap-plied in a focused ultrasound configuration field pinpoints the possibility of sonoporating cells without inertial cavitation, and then to limit cell lysis.

Acoustic cavitation ; stable cavitation ; subharmonic emission ; inertial cavitation ; feed-back loop ; in vitro cell sonoporation

Remerciements

Pour commencer, je voudrais remercier mes maitres de th`ese, Claude et Jean-Christophe, pour l’accueil et la confiance qu’ils m’ont t´emoign´ee durant ces 4 ans de th`ese. Merci `a Claude pour ses intuitions, son ´energie et sa franchise et merci `a Jean-Christophe pour ses pr´ecieux conseils et nos discussions. Merci pour leur patience, pour leurs relectures et r´e-´ecritures. Cette th`ese n’aurait pas pu aboutir sans leur soutien et leur bienveillance.

Ensuite, je tiens `a exprimer ma reconnaissance `a Pauline et Adrien, mes pr´ed´ecesseurs. Merci `a Pauline pour m’avoir form´e `a l’utilisation de la platine de microscopie et pour m’avoir pris en charge en stage de Master. Merci `a Adrien pour ces pr´ecieux conseils sur la programmation FPGA avec LabVIEW. Un immense merci `a Jacqueline Ngo pour sa pr´ecieuse aide pour les cultures cellulaires et le protocole de tir avec cellules. Je n’aurais rien pu faire de ”biologique” sans elle. Merci ´egalement `a Manuella pour ces protocoles de dosage de l’acide t´eraphtalique et ses pr´ecieux conseils pour la gestion de bi-bliographie.

Je tiens ensuite `a remercier Jean-Louis et Bernard pour la partie technique de ma th`ese. Bernard pour avoir pass´e une journ´ee `a adapter convenablement les barrettes piezo-´electriques de la platine et Jean-Louis d’avoir r´epar´e une entr´ee du FPGA, pour les discussions enrichissantes sur la programmation et ses pr´ecieux conseils pour le dosage de l’acide t´eraphtalique.

Un ´enorme remerciement `a Matthieu Gu´edra pour ses conseils en programmation Python et ses ex-plications sur le d´eveloppement asymptotique. J’ai beaucoup gagn´e de temps et d’´energie grˆace `a sa remise au propre de la m´ethode de Krilov-Bogoliubov.

De mani`ere g´en´erale, je tiens remercier l’´equipe enti`ere du LabTAU. Plus particuli`erement, merci `a C´ecile, Jennifer et Ivan pour le protocole de comptage des microbulles, `a Isabelle, Cindy et surtout Leila pour les d´emarches administratives, les commandes, les d´eparts en conf´erences et les rembour-sements. Merci `a Anthony pour la r´esolution des probl`emes informatiques et pour la licence Matlab dernier cri et merci `a R´emi pour son aide `a propos de l’utilisation ”qualitativement” correcte des wattm`etres. Merci aux doctorants, CDD et stagiaires du LabTAU pour leur enthousiasme et l’am-biance si particuli`ere entretenue lors des repas du midi, des journ´ees du labo et des repas de No¨el. Merci aux rapporteurs Mme. Lori Bridal et M. Serge Dos Santos pour l’immense effort de relecture qu’ils ont fourni. Merci ´egalement `a tous les autres membres du jury : Mme. Christelle Der Loughian, M. Philippe Marmottant et M. Serge Mensah pour avoir accept´e de se d´eplacer, d’´evaluer mon travail, et pour les r´eflexions et les remises en question qu’ils ont provoqu´ees.

Un bref mais sinc`ere merci `a ma famille (G´erard, Claude et Louise) et mes amis proches pour leur soutien moral inconditionnel, et merci `a Philippe et Anne-Marie pour m’avoir accompagn´e et support´e durant ces quatre ann´ees pass´ees `a Lyon.

Et pour finir, merci (et courage !) `a ceux qui r´eutiliseront mon travail. Vous donnerez du sens `a ce que j’ai fait.

Table des mati`

eres

1 Etat de l’art 8

1.1 La cavitation ultrasonore . . . 8

1.1.1 La nucl´eation : un ph´enom`ene `a caract`ere al´eatoire . . . 8

1.1.2 Dynamique des bulles . . . 9

1.1.3 R´egimes d’oscillation . . . 13

1.2 M´ecanismes de cavitation pour la sonoporation cellulaire . . . 14

1.2.1 Perm´eabilisation membranaire . . . 15

1.2.2 Ph´enom`enes acoustiques . . . 16

1.3 Contrˆole temporel par mesure acoustique . . . 17

1.3.1 Signatures acoustiques de cavitation . . . 18

1.3.2 Strat´egies de contrˆole temporel d’activit´e de cavitation . . . 19

1.3.3 Agents de contraste . . . 20

2 Activit´e de cavitation stable d’un nuage de bulles 21 2.1 Dynamique d’une bulle de cavitation . . . 21

2.1.1 Amplitudes des composantes spectrales en fonction de la pression et du rayon de la bulle . . . 21

2.1.2 Dynamique de rayon d’une bulle de cavitation stable . . . 23

2.1.3 Seuils de cavitation stable et inertielle . . . 28

2.1.4 Discussion . . . 29

2.2 Expression analytique du seuil de cavitation stable par d´eveloppement asymp-totique de l’´equation de Rayleigh-Plesset . . . 30

2.2.1 Principe de la m´ethode . . . 30

2.2.2 Seuil de cavitation stable d’une bulle unique . . . 31

2.2.3 Discussion . . . 34

2.3 Contribution de l’interaction entre les bulles du nuage . . . 35

2.3.1 Equation de Keller-Miksis avec interactions . . . 35

2.3.2 Cartes de seuil de cavitation en fonction de l’interaction . . . 36

2.3.3 Seuil analytique avec prise en compte des interactions . . . 38

2.3.4 Discussion . . . 40

3 Suivi et contrˆole de l’activit´e de cavitation stable - Mise en oeuvre exp´erimentale 46 3.1 Dispositif d’´etude . . . 47

3.1.1 Dispositif ultrasonore de cavitation . . . 47

3.1.2 Dispositif de g´en´eration et de traitement des signaux . . . 48

3.2 Suivi des signatures acoustiques de cavitation . . . 50

3.3 Sur la n´ecessit´e du contrˆole . . . 54

3.3.1 Cavitation stable et/ou inertielle . . . 54

3.3.2 R´ep´etabilit´e et stabilit´e temporelle . . . 56

3.4 Asservissement temps-r´eel de la cavitation stable . . . 59

3.4.1 R´ep´etabilit´e et stabilit´e temporelle . . . 62

3.5 Caract´erisation en ´eprouvette . . . 65

4 Application du contrˆole par r´etroaction `a la sonoporation cellulaire 70 4.1 Sonoporation par cavitation inertielle - Sur l’int´erˆet de r´eguler . . . 71

4.1.1 Mat´eriel et m´ethodes . . . 71

4.1.2 R´esultats : cellules en suspension . . . 77

4.1.3 Discussion . . . 79

4.1.4 Comparaison avec la sonoporation de cellules adh´erentes . . . 82

4.1.5 Sur la mesure de l’indice de cavitation stable avec la platine . . . 82

4.2 Sonoporation de cellules en suspension par cavitation stable r´egul´ee . . . 84

4.2.1 Mat´eriel et m´ethode . . . 84

4.2.2 R´esultats . . . 85

4.2.3 Discussion . . . 90

Introduction g´

en´

erale

L’utilisation des ultrasons th´erapeutiques a explos´e depuis les ann´ees 1980. Tout d’abord utilis´es pour l’imagerie, les ultrasons ont ´et´e utilis´es `a haute intensit´e comme technique de chirurgie non invasive. Les effets m´ecaniques cr´e´es par ultrasons de haute intensit´e (HIFU) peuvent servir `a d´etruire des calculs r´enaux et ur´etraux, ainsi que des caillots sanguins, alors que les effets thermiques permettent de n´ecroser les tissus par hyperthermie. Une des applications th´erapeutiques particuli`ere des ultrasons est l’ouverture de parois biologiques pour d´elivrer des drogues de mani`ere spatialement contrˆol´ee. Il est possible grˆace `a l’action des ultrasons d’augmenter la porosit´e membranaire d’une cellule pour y faire p´en´etrer du mat´eriel g´enique (au niveau de tumeurs, du coeur, du cerveau ou des muscles du squelette notamment). Dans le cas de la paroi cellulaire, le processus d’ouverture de la membrane cellulaire par ultrasons est appel´e sonoporation. Pour l’application particuli`ere de transfection cellulaire, le but est de modifier le g´enome d’une cellule en utilisant une prot´eine particuli`ere pour inhiber ou activer un g`ene dans l’objectif de traiter une maladie h´er´editaire et de traiter des g`enes mut´es ou d´efectueux (dans le cas d’un cancer par exemple). Il est g´en´eralement reconnu que l’effet m´ecanique responsable de l’ouverture des parois biologiques est la cavitation ultrasonore.

La cavitation est le ph´enom`ene physique de cr´eation et d’oscillation de bulles, caus´e par une importante d´epression dans un milieu aqueux. L’oscillation entretenue du nuage de bulles grˆace `

a un champ de pression ultrasonore peut ˆetre utilis´ee `a dessein th´erapeutique car les bulles de gaz peuvent ˆetre g´en´er´ees dans les tissus biologiques et le sang. L’usage de la cavitation ultrasonore pour la d´elivrance de drogues pr´esente des avantages consid´erables car elle permet de pi´eger, d’adh´erer `a, ou de transporter des produits dans le corps (comme des drogues, des prot´eines, des peptides, des g`enes ou des mol´ecules pour inhiber certains g`enes). Cependant le ph´enom`ene est difficile `a maitriser et `a observer du fait de son caract`ere al´eatoire. En effet, le ph´enom`ene de cavitation apparait souvent comme chaotique car il est non lin´eaire et plusieurs param`etres incontrˆol´es peuvent influer sur le comportement de cavitation durant un tir ultrasonore. Deux r´egimes de cavitation existent : la cavitation stable et la cavitation inertielle. La cavita-tion stable correspond au r´egime d’oscillations de bulles prolong´ees dans le temps et de faible amplitude, alors que la cavitation inertielle correspond `a l’oscillation fortement non lin´eaire et de forte amplitude, avec l’implosion des bulles. Les effets m´ecaniques induits par les deux r´egimes de cavitation ne sont pas forc´ement discrimin´es car il peut y avoir cohabitation en mˆeme temps dans un mˆeme nuage des deux types de comportements. Dans le but de contrˆoler les effets biologiques induits par cavitation, il est n´ecessaire de discriminer les effets ”soft” des effets destructeurs. Pour cela, le r´egime de cavitation doit ˆetre contrˆol´e spatialement et tem-porellement. Dans le cas de la sonoporation, les m´ecanismes biologiques relatifs `a la formation de pores et `a l’internalisation des drogues ne sont pas encore pr´ecis´ement compris. Ainsi, dans l’objectif d’´etudier des effets de l’interaction entre bulle et cellule, le r´egime d’oscillation des bulles doit ˆetre contrˆol´e et maintenu `a activit´e constante.

L’objectif de cette th`ese est de contrˆoler les r´egimes de cavitation stable et inertielle grˆace `a une ´ecoute du bruit de cavitation. Dans un premier temps, on tentera de clarifier les causes d’apparitions des indicateurs acoustiques de cavitation. Une ´etude exp´erimentale est ensuite men´ee pour discriminer les r´egimes de cavitation stable et inertielle grˆace `a une ´ecoute acous-tique pour ensuite d´eterminer avec pr´ecision la contribution du r´egime de cavitation stable `a la sonoporation cellulaire.

Dans le premier chapitre de la th`ese, la probl´ematique et le contexte seront d´evelopp´es. Les conditions de cr´eation des bulles et les r´egimes de cavitation stable et inertielle sont explicit´es, ainsi que les ´equations utilis´ees pour l’´etude sur la dynamique des bulles. Les effets induits par les deux r´egimes de cavitation sur les cellules sont d´evelopp´es ainsi que les m´ecanismes cellu-laires sollicit´es pour l’internalisation des drogues. Plusieurs strat´egies de contrˆole acoustique de cavitation sont pr´esent´ees.

Dans la deuxi`eme partie, une ´etude num´erique et analytique de cavitation stable a ´et´e effectu´ee. Des simulations de la dynamique de bulle sont effectu´ees ainsi qu’un d´eveloppement asympto-tique de l’´equation de Reyleigh-Plesset. De mani`ere `a mettre en ´evidence l’effet des interactions entre bulles, un mod`ele de nuage homog`ene et monodisperse est impl´ement´e. L’influence de la densit´e du nuage sur les seuils d’apparition de cavitation stable est ´etudi´ee.

La troisi`eme partie d´ecrit la mise en oeuvre exp´erimentale d’une strat´egie de contrˆole, bas´ee sur une boucle de r´etroaction utilisant la signature acoustique. Une ´etude dans une cuve grande ´

echelle du bruit de cavitation d’un nuage libre permet de v´erifier la capacit´e de discriminer les r´egimes de cavitation stable et inertielle.

Enfin, pour la quatri`eme partie, le processus de contrˆole est appliqu´e `a la sonoporation de cellules in vitro. Deux dispositifs de transfection cellulaire sont utilis´es. Le premier, qui se base sur un champ ultrasonore stationnaire, est implant´e sur une platine de microscopie et est utilis´e pour comparer l’action du contrˆole de cavitation inertielle avec ou sans ajout de microbulles sur la sonoporation cellulaire. Le deuxi`eme, qui utilise un dispositif `a champ focalis´e, est utilis´e pour mettre en ´evidence l’influence du r´egime de cavitation stable sur la sonoporation cellulaire.

Chapitre 1

Etat de l’art

1.1

La cavitation ultrasonore

La cavitation ultrasonore peut se d´efinir comme le ph´enom`ene d’interaction entre une inclusion gazeuse et un champ ultrasonore dans un milieu liquide (Miller et al. 1996, [64]). Ce processus est d´ecompos´e en trois phases : la cr´eation de bulles de gaz dans le milieu, l’entretien de l’oscillation de ces bulles grˆace `a l’onde ultrasonore et la disparition (parfois violente) de celles-ci. Le ph´enom`ene de cavitation ultrasonore est d´ecrit dans cette partie en d´efinissant dans un premier temps les conditions de son apparition, ensuite en d´ecrivant les diff´erents r´egimes d’oscillations des bulles de cavitation et troisi`emement en pr´esentant les mod`eles th´eoriques permettant de d´ecrire d’une part l’oscillation d’une bulle mais aussi la dynamique d’oscillation d’un nuage de bulles dans une configuration de nuage homog`ene et monodisperse.

1.1.1

La nucl´

eation : un ph´

enom`

ene `

a caract`

ere al´

eatoire

Pour cr´eer une bulle de gaz dans un liquide, une d´epression suffisante doit ˆetre exerc´ee pour cr´eer une rupture dans le liquide. Le processus de cr´eation de bulle est appel´e nucl´eation et dans tous les liquides, il existe des sites de nucl´eations appel´e nucl´ei (Flynn 1984 [26]). La nucl´eation peut ˆetre de deux types. Le premier, appel´ee cavitation homog`ene, correspond `a la cr´eation d’occlusion de vides ´eph´em`eres `a partir de mouvements thermiques. Celle-ci peut se produire de mani`ere homog`ene dans tous les liquides (th´eoriquement pour un ordre de grandeur de 100 MPa, Jones 1999 [41]). Le deuxi`eme type de nucl´eation est appel´e cavitation h´et´erog`ene. Il correspond `a la cr´eation de bulles de gaz `a partir d’une interface entre deux phases (solide, liquide, gazeuse) dans le milieu (Brennen 2013 [6]). Des interfaces solide-liquide peuvent ˆetre des sites de nucl´eation comme par exemple des poussi`eres, qui viennent ”polluer” le milieu, ou alors des germes de cavitation diss´emin´es volontairement pour faciliter l’apparition de cavita-tion (comme des agents de contraste ultrasonore). Dans le cas d’une nucl´eation h´et´erog`ene, la cavitation peut ˆetre initi´ee th´eoriquement pour une pression de 10 MPa (Jones 1999 [41]), voire moins pour certaines conditions exp´erimentales (pour notre configuration d’´etude, environ 0.4 MPa pour une onde de 500 kHz en nuage libre). Dans le cas de la cavitation h´et´erog`ene, deux types de nucl´ei sont distingu´es. Tout d’abord les nucl´eis dits ”stabililis´es” : ce sont des bulles qui r´esistent `a la dissolution (Yount 1982 [110]), situ´ees soit en suspension dans le fluide, soit `a la surface d’un solide comme des fissures hydrophobes ou des impuret´es (Yilmaz 1976 [108]). Le deuxi`eme type de nucl´ei, dit ”non-stabilis´es”, correspond `a des sites de nucl´eation cr´e´es apr`es l’implosion des bulles. Une bulle qui implose peut se fragmenter et cr´eer plusieurs petites bulles filles, qui serviront comme sites de cavitation.

Il a ´et´e montr´e que les param`etres de l’excitation acoustique ont une influence sur le seuil de nucl´eation (Holland and Apfel 1990 [36]). Premi`erement, la cavitation ne se d´eclenche pas `a la mˆeme amplitude de for¸cage ultrasonore en fonction de la fr´equence de l’onde. L’indice MI,

ou Mechanical Index (Apfel et Holland 1991 [1]), donne un ordre de grandeur de l’amplitude ultrasonore pour l’apparition d’une activit´e inertielle de cavitation : MI = pa/

√

f₀. En dessous d’une valeur d’un indice MI de 0.7, les conditions ne seraient pas suffisantes pour observer l’implosion des bulles. Cela ´equivaut `a une pression de 0.5 MPa pour une fr´equence de 500 kHz ou une pression de 0.7 MPa pour 1MHz. Dans le cas de tirs ultrasonore en configuration puls´ee, la dur´ee des trains d’onde et le rapport cyclique peuvent modifier le seuil de cavitation. Plus le temps d’excitation est long, plus il sera facile pour la cavitation de se d´eclencher. D’autre part, il existe un effet ”m´emoire” : quand l’oscillation de la bulle arrˆete, la bulle commence `a se dissoudre. Si le train d’onde est assez court, l’oscillation reprendra de la mˆeme mani`ere avec le mˆeme nucl´ei. Par contre, si le train d’onde est trop long, la bulle se dissolvera compl`etement. Pour rem´edier `a cette variabilit´e, Church (2005 [11]) propose une pond´eration de l’indice m´ecanique en fonction de la dur´ee des salves d’excitation et du rapport cyclique. Malgr´e tout, il n’existe pas de formule g´en´erale pour l’apparition de la nucl´eation. En plus des param`etres ultrasonores, le seuil de nucl´eation d´epend du type de milieu, de la pr´esence de gaz dissous dans le milieu ou de la pr´esence d’impuret´es et de parois (nucl´eation h´et´erog`ene). Pour des applications m´edicales in vivo, il est n´ecessaire de prendre en consid´eration l’inhomog´en´eit´e des tissus et la pr´esence de germes de cavitation. De plus, les param`etres comme la pression hydrostatique et la temp´erature du milieu ont aussi une inflence sur l’apparition de la cavitation. L’augmentation de la taille de la bulle lors de sa cr´eation augmente quand la temp´erature augmente (Brennen 2013 [6]). De plus, dans le cas d’un milieu cavitant d´egaz´e, c’est-`a-dire dans un milieu avec une plus faible concentration de nucl´ei gazeux (Roy et al. 1990 [88]), il est plus difficile de cr´eer des bulles de gaz.

1.1.2

Dynamique des bulles

Dans le but de d´ecrire la dynamique d’une bulle de gaz suppos´ee sph´erique dans un liquide infini et incompressible, on utilise des ´equations de dynamique s’´ecrivant en fonction du rayon

R(t). Dans cette partie seront d´ecrits des mod`eles pour la bulle unique et pour un nuage de bulle monodisperse et homog`ene.

Oscillation d’une bulle unique - La bulle est form´ee par l’interface entre deux ´etats de la mati`ere : une phase liquide (l’eau) et une phase gazeuse (de l’air et de la vapeur d’eau). La bulle existe grˆace `a la compensation entre la pression interne et la pression externe `a la bulle. Le mod`ele d’oscillation le plus simple est le mod`ele de Reyleigh-Plesset (Plesset 1949 [78]). D’un cˆot´e, la pression interne `a la bulle pi s’applique contre le volume de liquide environnant, soit vers l’ext´erieur de la bulle. La pression externe p_∞ s’appliquant contre la paroi, vers l’int´erieur de la bulle (la phase gazeuse compos´ee de vapeur et de gaz), comprend la pression hydrostatique dans le fluide pstat et une variation de pression p(t), caus´ee par le champ ultrasonore sinuso¨ıdal de for¸cage.

Figure 1.1 – Pressions appliqu´ees dans le cas d’une bulle de gaz `a l’´equilibre Le mod`ele s’´ecrit

R ¨R + 3

2 ˙

R2 = 1

ρ(pi(R)− p∞) . (1.1)

Dans ce mod`ele, l’oscillation de la bulle n’est consid´er´ee que selon son mode radial de respiration. Cette hypoth`ese permet de d´ecrire la dynamique de la bulle uniquement grˆace `a une seule variable : le rayon instantan´e de la bulle R(t). Les contributions de Noltingk et Neppiras (1950 [72]) et de Poritsky (1952 [80]) ont permis de prendre en compte respectivement l’effet de tension de surface `a l’interface liquide-gaz et l’influence de la viscosit´e du fluide externe sur l’oscillation de la bulle. Le mod`ele de Reyleigh-Plesset g´en´eralis´e s’´ecrit alors :

ρR ¨R + 3 2ρ ˙R 2 _{= p} gn  R₀ R 3χ + pv − pstat− 2σ R − 4μ ˙ R R − pasin(2πf0t) (1.2)

avec R₀ le rayon `a l’´equilibre de la bulle, χ est le coefficient de compression polytropique, σ est la tension de surface, pv la pression de vapeur, pa l’amplitude de pression de for¸cage et f0 la fr´equence de l’onde ultrasonore, pgnla pression du gaz interne `a la bulle et μ viscosit´e dynamique du fluide externe. La bulle peut alors ˆetre consid´er´ee comme un oscillateur masse-ressort amorti non lin´eaire avec for¸cage. Le fluide `a l’ext´erieur de la bulle peut s’apparenter `a la masse du syst`eme, le gaz compressible `a l’int´erieur de la bulle s’apparente au ressort et les pertes dues `a la viscosit´e du milieu s’apparentent `a l’amortisseur. L’´equation de Rayleigh-Plesset g´en´eralis´ee 1.2 est une ´equation diff´erentielle non lin´eaire tr`es utilis´ee num´eriquement (Lauterborn 2010, Gerold et al. 2013 [50, 29]) et analytiquement (Prosperetti 1974 [84]) car elle repr´esente le mod`ele de dynamique de bulles le plus simplifi´e. Au vu de l’hypoth`ese d’incompressibilit´e du fluide de ce mod`ele, sa limite principale concerne sa validit´e pour les fortes amplitudes d’oscillations. Parmi les nombreux mod`eles d´evelopp´es d´ecrivant les fortes oscillations de bulles, une ´etude plus rigoureuse des non-lin´earit´es induites par de fortes amplitudes acoustiques sera r´ealis´ee `a l’aide du mod`ele de Keller-Miksis (Keller et Miksis 1980 [44]). Ce mod`ele prend en compte la compressibilit´e du fluide en incorporant un terme de retard (terme en _c˙R) de propagation de l’onde dans le milieu. L’´equation s’´ecrit :

 1− ˙ R c  ρR ¨R +3 2ρ ˙R 2  1− ˙ R 3c  =  1 + ˙ R c  p₁+R c dp₁ dt , (1.3) avec : p₁ =  pstat+ 2σ R₀   R₀ R _3χ − pstat− 2σ R − 4μ ˙R R − p(t) (1.4) et : p(t) = pasin(2πf0t). (1.5) L’approximation du rayon r´esonant Rres`a la fr´equence f0peut s’effectuer grˆace `a une lin´earisation de l’´equation de Keller-Miksis [50]. La formule qui permet d’exprimer la r´esonance de la bulle en fonction de la fr´equence d’excitation est nomm´ee formule de Minnaert et s’´ecrit :

Rresf0 = 1 2π√ρ  3χ  pstat+ 2σ Rres − pv  − 2σ Rres − 4μ2 ρR_res2 . (1.6)

Si l’on n´eglige la contribution de la tension de surface et de la viscosit´e du milieu, cette relation fournit une approximation simple sur la relation entre la fr´equence d’excitation et le rayon `a l’´equilibre de la bulle : f₀Rres∼ 3 m.s−1. Enfin, il est possible de mod´eliser la pression rayonn´ee par la bulle (Yasui 2010 [107]) et ainsi d’exprimer le bruit de cavitation ´emis par la bulle avec la formule : p = ρ d  R2R + 2R ˙¨ R2  , (1.7)

o`u d est la distance entre la position de la bulle et le point de mesure.

Hypoth`eses et limites - Le mod`ele de Keller-Miksis permet de rendre compte de la dyna-mique d’une bulle de gaz de rayon `a l’´equilibre R<sub>0</sub> remplie d’air et entour´ee d’un milieu d’eau infini. Cependant, la bulle peut ˆetre soumise `a plusieurs effets sp´ecifiques non pris en compte dans le mod`ele th´eorique. Premi`erement, l’effet de diffusion rectifi´ee implique que la taille de la bulle change progressivement en fonction du temps.

D’autres ph´enom`enes peuvent apparaitre : les bulles tr`es petites se dissolvent et les bulles tr`es grandes sont pouss´ees vers la surface par la force d’Archim`ede (en cas de surface libre). Il a aussi ´et´e montr´e que la bulle pouvait se translater dans le milieu en fonction de la pr´esence de fronti`ere ou la pr´esence d’une autre bulle. Dans le cas de deux bulles, elles peuvent fusionner pour cr´eer une nouvelle bulle (ph´enom`ene de coalescence). On appelle ces forces de translation les forces de Bjerknes : la force primaire correspond `a la force de radiation acoustique que subit une bulle sous l’effet d’un champ ultrasonore, et la force secondaire correspond `a l’attraction des bulles entre elles. Dans le cas de la cavitation inertielle, l’effondrement violent d’une bulle sur elle-mˆeme peut causer la fragmentation de cette bulle en plusieurs bulles filles. En r´ealit´e, il est difficile de dire si la bulle continue `a osciller de mani`ere p´eriodique apr`es un collapse violent ou si elle disparait, en se scindant en plusieurs bulles filles. Le mod`ele num´erique ne prend pas en compte les effets post-implosion comme la disparition ou la fragmentation de la bulle, de sorte qu’une bulle unique continue `a osciller quoi qu’il arrive.

Il est donc important de rappeler que le mod`ele th´eorique pr´esente la dynamique d’une bulle unique (pas de disparition, pas de fragmentation, pas de force de Bjerknes secondaire), d´ej`a nucl´e´ee, immobile (pas de force de pouss´ee, ni de translation), qui reste de mˆeme rayon `a l’´equilibre (pas de dissolution, ni de diffusion rectifi´ee), dans un milieu infini (pas de force de Bjerknes primaire, pas d’instabilit´e de surface due `a la pr´esence d’une paroi).

Mod`ele de nuage - En pratique, la cavitation apparait rarement sous la forme d’une bulle seule, mais sous la forme d’un ensemble de bulles (nuage, cluster, filaments, ...). Ces diff´erentes formes sont notamment dues aux mouvements li´es aux interactions entre les bulles et le champ ultrasonore mais aussi aux interactions des bulles entre elles (Parlitz 1999 [77]). En particulier, la proximit´e des bulles entre elles limite le grossissement du nuage (Yasui 2008 [105]), et la fr´equence de r´esonance d’un nuage est plus faible que celle d’une bulle unique (Nicholas et al. 1994 [71], Yoon et al. 1990 [109]). Selon Omta (1987 [75]), celle-ci d´ependrait du nombre de bulles dans le milieu, et donc du volume de gaz total du nuage. Yasui (2010 [107]) permet de rendre compte de la dynamique d’un nuage de bulles en ajoutant `a l’´equation de Keller-Miksis un terme de couplage : N −1 i₌₁ 1 d_i  R2_iR¨i+ 2RiR˙i2  . (1.8)

Ce terme correspond `a la somme des pressions rayonn´ees par toutes les N bulles du nuage, avec une pond´eration en fonction de la distance entre ces bulles. L’´equation de Keller-Miksis modifi´ee s’´ecrit alors :

 1− ˙ R c  ρR ¨R + 3 2ρ ˙R 2  1− ˙ R 3c  =  1 + ˙ R c  p₁+ R c dp₁ dt − N −1 i=1 1 di  R2_iR¨i+ 2RiR˙2i  (1.9) avec : p₁ =  pstat+ 2σ Rn   Rn R _3χ − pstat− 2σ R − 4μ ˙R R − p(t) (1.10)

Dans l’hypoth`ese d’un nuage monodisperse c’est-`a-dire en consid´erant que les bulles oscillent en phase, avec un mˆeme rayon Ri = R, le terme de couplage peut se r´e´ecrire :

− SR2R + 2R ˙¨ R2



, (1.11)

o`u S est le coefficient de couplage entre la bulle et les N − 1 bulles plac´ees aux distances di :

S = N ₋₁ i=1 1 di . (1.12)

Le coefficient S repr´esente la contribution de toutes les bulles du nuage sur la bulle au centre du nuage. D’un point de vue physique, l’indice de couplage est li´ee a la densit´e du nuage de bulle pour un volume caract´eristique (Yasui et al. 2010 [107]). Notons que quand l’indice S atteint une valeur nulle, on retrouve le cas classique d’une bulle unique, sans interaction. Si les bulles sont uniform´ement r´eparties dans l’espace, des approximations existent pour faire le lien entre le terme d’interaction et la distance entre les bulles. Yasui (et al. 2008, 2009 [105, 106]) propose l’approximation o`u : S = N −1 i 1 d<sub>i</sub> = Imax I<sub>min</sub> 4πr2n r dr = 2πn(I 2 max− Imin2 )∼ 2πnR2c (1.13) avec N le nombre de bulles dans le nuage, n la densit´e du nuage de bulle, di la distance entre la bulle au centre du nuage et la bulle i, Imin la distance bulle `a bulle minimale et Imax = Rc le rayon du nuage.

D’autres auteurs ont pris en compte l’effet d’att´enuation acoustique due aux bulles environ-nantes, qui pouvait g´ener la propagation. L’autre approximation propos´ee est celle d’un rayon de coupure, d´ependant de la concentration de bulles (Arora et al. 2007 [2]) :

1.1.3

R´

egimes d’oscillation

Apr`es la nucl´eation, les bulles de gaz sous l’influence d’un champ acoustique ultrasonore se mettent en mouvement et oscillent autour de leur rayon `a l’´equilibre. Deux grands types de r´egimes de cavitation sont distingu´es : d’un cˆot´e la cavitation stable correspondant `a l’oscillation faiblement non lin´eaire des bulles entretenue au cours du temps, et de l’autre la cavitation inertielle correspondant `a l’oscillation fortement non lin´eaire des bulles, avec une dynamique d’amplitude si importante qu’elle entraine l’implosion de celles-ci. Les caract´eristiques de chaque r´egime et les crit`eres de classification des r´egimes de cavitation sont pr´esent´es.

Cavitation stable - Le r´egime de cavitation stable correspond `a l’oscillation des bulles `a intensit´e acoustique mod´er´ee. Le rayon de la bulle varie de mani`ere sensiblement p´eriodique au cours du temps `a cause de la pression de for¸cage. Au cours de la phase de d´etente, la bulle s’agrandit, tir´ee par une pression n´egative s’exer¸cant sur la paroi de la bulle et au cours de la phase de compression, le rayon de la bulle diminue `a cause d’une pression positive exerc´ee sur la paroi. Le mouvement de la bulle est majoritairement gouvern´e par la compression du gaz `

a l’int´erieur de la bulle. Pour ce r´egime de cavitation, les bulles sont soumises au ph´enom`ene de diffusion rectifi´ee. Lors de la phase de d´epression, la surface de la bulle est plus importante ce qui entraine un ´echange gazeux plus important entre le liquide et le milieu ext´erieur, alors que durant la phase de compression la surface de la bulle est moins importante, donc moins d’´echange gazeux a lieu. Cela implique une ´evolution de la taille du rayon en fonction du temps. Ainsi, les bulles se dissolvent ou grossissent progressivement en fonction de la taille initiale de la bulle et de la fr´equence de l’oscillation.

La cavitation stable est responsable de m´ecanismes particuliers, utilis´es notamment en th´erapie. Les effets caus´es par l’oscillation des bulles sont (1) la cr´eation d’´ecoulement autour des bulles, ou microstreaming (Elder 1959 [21]), (2) l’effet de ”micropompe” (ou push-pull ) des bulles oscillantes proches ou au contact d’une surface (Marmottant at Hilgenfeldt 2003 [59]), (3) l’augmentation de la temp´erature de parois ou membrane au contact de la bulle (Hilgenfelst et al. 2000 [33]) ou encore (4) la translation des bulles due `a la contrainte de radiation (Crum et Eller 1970 [14]). La cavitation stable pourrait ˆetre utilis´ee pour nettoyer des surfaces (Krefting et al. 2004, Hauptmann et al. 2012, [45,31]), et pour st´eriliser des plaies `a l’eau froide (Birkin et Leighton 2016 [4]). La cavitation stable permettrait aussi d’ouvrir des barri`eres biologiques et de d´elivrer des drogues m´edicamenteuses de mani`ere cibl´ee. De nombreuses recherches s’int´eressent `

a l’ouverture de la barri`ere h´emato-enc´ephalique (Hynynen et al. 2005, Liu et al. 2008, [39,53]), mais aussi `a la transfection cellulaire (Lo et al. 2014 [54]) grˆace `a l’action de cavitation stable. L’activit´e d’un nuage de cavitation stable pourrait ˆetre mesur´ee `a travers l’onde de pression rayonn´ee par les bulles oscillantes. Cette onde de pression est compos´ee de raies spectrales harmoniques, sous-harmoniques et ultra-harmoniques (De Santis 1967, Neppiras 1969, [16,69]). En effet, les ´emissions du nuages sont couramment mesur´ees pour localiser et suivre l’activit´e de cavitation d’un nuage en temps r´eel.

Cavitation inertielle - Dans certaines conditions, la bulle peut atteindre plus de 10 fois son rayon d’´equilibre lors de la phase de d´epression et puis s’effondrer sur elle mˆeme avec une vitesse de la paroi de la bulle de l’ordre de la vitesse du son (Neppiras et Noltingk 1951 [70]). Cette vitesse importante est due `a l’inertie du fluide du milieu ext´erieur qui vient pousser contre la paroi de la bulle avec une force consid´erable. On atteint alors des conditions extrˆemes de pression et de temp´erature (de l’ordre de 5000 Kelvins) `a l’int´erieur de la bulle lors de l’implosion. Apr`es effondrement, si la bulle ne se fragmente pas, il peut ˆetre observ´e des rebonds successifs de la bulle sur elle mˆeme, avec ´emission d’onde de choc. Par contre, dans le cas d’une bulle de forme non-sph´erique, l’implosion cause a priori la fragmentation en plusieurs bulles filles.

En plus de g´en´erer une onde de choc lors d’une implosion, la bulle peut aussi g´en´erer un microjet due `a une dissym´etrie : apr`es effondrement non-uniforme, la bulle cr´ee un jet de

grande vitesse. En proximit´e d’une paroi rigide notamment, la pression due au liquide ext´erieur n’est pas uniforme sur toute la bulle, ce qui cause une d´eformation de la sph´ericit´e de la bulle. En cons´equence, le microjet est dirig´e vers la paroi rigide la plus proche (Postema et al. 2004 [81]). Dans le cas d’une cellule biologique, par exemple, le microjet serait dirig´e en direction de la membrane cellulaire, ph´enom`ene potientiellement utilisable pour des applications th´erapeutiques. Le microjet agit alors comme une micro-seringue, permettant de percer la cellule et de d´elivrer un m´edicament dans la cellule. Dans le cas d’une dissym´etrie sans paroi rigide `

a proximit´e, les microjets sont dirig´es dans le sens de la propagation de l’onde, par force de radiation (Wolfrum et al. 2002 [102]).

Un autre ph´enom`ene observ´e lors de la cavitation inertielle est la sonoluminescence, soit la production de flashs lumineux caus´es par l’implosion des bulles (Taleyarkhan et al. 2002 [96]). Par ailleurs, au point d’implosion, la temp´erature et la pression extrˆeme peuvent cr´eer des chocs de gaz responsables de r´eactions sonochimiques dans le milieu et cr´eer des radicaux libres OH• et H• (Makino et al. 1982 [58]). Il est possible de faire r´eagir ces radicaux avec des r´eactifs pour cr´eer des marqueurs fluorescents et de doser afin de quantifier l’activit´e de cavitation inertielle par spectrofluorim´etrie (Mason et al. 1994 [61, 101]). Pour les applications th´erapeutiques, la cavitation inertielle serait plus utilis´ee pour des applications destructrices, telles que la destruction de caillots sanguins (ou sonothrombolyse, Prokop et al. 2007 [83]), la participation `a la destruction de calculs r´enaux (ou lythotriptie, Evan et al. 2002 [23]) mais elle peut aussi ˆetre utilis´ee pour sonoporer des cellules en configuration ultrasonore stationnaire et control´ee (Muleki-Seya et al. 2014 [67]).

Distinction entre les deux r´egimes - On peut entendre la notion de stabilit´e du terme ”cavitation stable” selon diff´erentes perspectives. La cavitation peut-ˆetre stable dans le temps, c’est `a dire pr´esenter un comportement r´ep´etable et p´eriodique dans le temps. Church et Cars-tensen (2001 [12]) ont montr´e qu’il peut exister un r´egime ”stable-inertiel” pour lequel la bulle oscille avec un comportement violent et g´en´eration d’ondes de choc, sans que la bulle ne dispa-raisse ou se fragmente, avec un comportement similaire qui perdure dans le temps. D’un autre cˆot´e, la stabilit´e peut aussi s’entendre comme la sph´ericit´e des bulles du nuage. Soit la bulle oscille de mani`ere sph´erique, soit elle pr´esente des instabilit´es de surface, comme des modes de surface (Longuet-Higgins 1989 [57]). Ainsi, il peut exister des bulles sph´eriquement stables, mais oscillant `a de fortes amplitudes, pouvant s’effondrer et pouvant mˆeme causer des effets fortement non lin´eaires (implosion, sonoluminescence). La d´efinition la plus courante, donn´ee par Leighton (The Acoustic Bubble [51]), consiste `a consid´erer la cavitation stable comme ca-vitation non inertielle. La caca-vitation est ainsi consid´er´ee stable avec une oscillation mod´er´ee des bulles, sans la variation brusque de la paroi de la bulle due `a l’inertie du fluide. Un des indicateurs couramment utilis´es pour distinguer la cavitation inertielle de la cavitation stable est le ratio entre le rayon maximal de la bulle atteint lors de l’oscillation et le rayon `a l’´equilibre de la bulle (Nottingk et Neppiras 1951 [70]). Si le rayon exc`ede une certaine valeur critique, la vitesse d’effondrement de la paroi de la bulle devient trop importante et cause l’implosion de la bulle. La valeur critique de ratio propos´ee par Apfel (1991 [1]) est Rmax/R0 ≥ 2, 3. La r´esolution du mod`ele de Rayleigh-Plesset donne alors une vitesse de paroi exc´edant la vitesse du son dans le milieu. L’usage d’un mod`ele plus r´ealiste (Keller-Miksis) prenant en compte la compressibilit´e du fluide montre que cette hypoth`ese n’est plus coh´erente. On utilise alors le crit`ere : ˙R/c > 0.2 [51].

1.2

M´

ecanismes de cavitation pour la sonoporation

cel-lulaire

l’action des bulles. Bien que la cavitation ait ´et´e d´efinie comme le facteur principal responsable de la sonoporation cellulaire, les m´ecanismes responsables de l’internalisation des drogues ne sont pas encore pr´ecis´ement identifi´es. Dans cette partie sont d’abord d´efinis les m´ecanismes g´en´eraux d’internalisation des mol´ecules dans la cellule, puis les diff´erentes actions m´ecaniques induites sur la cellule par les oscillations faiblement ou fortement non lin´eaires des bulles.

1.2.1

Perm´

eabilisation membranaire

La cellule est un organisme compos´e d’un noyau baignant dans un cytoplasme, prot´eg´e du milieu ext´erieur par la membrane cellulaire. Par nature, les cellules pr´esentes dans l’organisme sont soit adh´erentes `a un substrat (cellules ´epith´eliales de la barri`ere h´ematoenc´ephalique) ou en suspension (cellules sanguines). La cellule adh´erente peut ˆetre mod´elis´ee comme un solide ´

elastique, adh´erent `a une paroi, pouvant se d´etacher de celle-ci si une contrainte de cisaillement suffisamment importante est exerc´ee (Hochmuth et al. 2000 [34]). Pour la cellule en suspension, elle peut ˆetre consid´er´ee comme un liquide entour´e par une coque ´elastique (Canadas et al. 2003 [7]). Pour ce qui est des m´ecanismes intercellulaires, l’influence du cytosquelette de la cellule est d´eterminante. Il est compos´e de polym`eres biologiques : des filaments d’actine, des microtubes et des filaments interm´ediaires. Ces polym`eres, renouvel´es en permanence par polym´erisation, sont les ”muscles” de la cellules, responsables des forces exerc´ees par la cellule pour se nourrir et se d´eplacer. Les filaments d’actine sont responsables de l’adh´esion inter-cellulaires et de l’extension de la membrane, les microtubules sont responsables de la r´egulation de la forme de la cellule, du transport des composants cellulaires ainsi que de la migration et de la division de la cellule, alors que les filaments interm´ediaires sont responsables de la r´egulation de la forme de la cellule ainsi que de l’adh´esion de la cellule au substrat. Il est donc important de pr´eciser que l’action des polym`eres, ainsi que le cycle cellulaire, a une influence sur la r´eponse m´ecanique de la cellule.

Trois m´ecanismes biologiques sont actuellement identifi´es pour expliquer l’internalisation des drogues (Bouakaz et al. 2016 [5]). Elle peut soit ˆetre naturelle (par voie d’endocytose), soit en cr´eant des pores sous l’influence du champ acoustique (sonoporation classique). L’effet de la cavitation sur la membrane est tr`es variable : il peut aller de la l´eg`ere d´eformation de la cellule jusqu’`a une fracture de la membrane entrainant la destruction de la cellule.

Endocytose - Le m´ecanisme d’endocytose correspond `a l’absorption naturelle de mol´ecules `

a l’int´erieur de la cellule. Elle peut se faire grˆace `a la cr´eation de v´esicules transportant les mol´ecules de l’ext´erieur `a l’int´erieur de la membrane, en pi´egeant la mol´ecule dans des puits de la membrane. De nombreuses ´etudes ont mis en ´evidence qu’une grande concentration de mol´ecules internalis´ees ´etaient observ´ees dans les puits et les v´esicules d’endocytose, par fluorescence (Lionetti et al. 2009, Meijering et al. 2009 [52, 63]) et par microscopie ´electroniques (Saito et al. 1999, Hauser et al. 2009 [90, 32], ainsi qu’une corr´elation entre l’internalisation des drogues et une grande concentration d’ions calcium Ca2+ dans le cytoplasme (Hauser et al. 2009 [32]).

Poration - Une autre cause de cavitation est la cr´eation de micropores dans la membrane de la cellule. Une ´etude a montr´ee que des mol´ecules de taille comprise entre 3-8 nm ont ´

et´e retrouv´ees uniform´ement distribu´ees dans le cytoplasme, alors que des mol´ecules de taille sup´erieure (sup´erieure `a 17 nm) ´etaient int´egr´ees par endocytose (Meijering et al. 2009 [63]). D’autre part, il a ´et´e montr´e, en inhibant l’endocytose, que des mol´ecules ne pouvaient passer qu’a travers des pores de 20 nm `a 30 nm [28]. Yang (et al. 2008 [104]) a observ´e des pores dans la membrane, pouvant varier de 1 nm `a 4.3 μm en fonction de la pression (de 190 jusqu’`a 480 kPa, sans agents de nucl´eation). Hu (et al. 2013 [37]) a mis en ´evidence pour une bulle et une cellule la cr´eation de pores de 5.3 μm, synchronis´ee avec les collapses de bulle. Le temps de r´esorbation ´etait compris entre 6s et 20s, les pores larges compris entre 12-32.6 μm n’ayant pas pu se r´esorber. Des exp´eriences men´ees sur une cellule seule de 8.4 μm pour observer l’action

d’une bulle unique de 1.25 μm `a une amplitude de 0.12 MPa `a 0.834 MHz ont montr´e un temps de r´esorbation de 38 ms (Nejad 2015 [68]). Notons qu’il est possible d’exprimer la taille du pore sous la forme d’un ratio de l’aire du pore sur l’aire totale de la cellule ΔA_A . Selon Lokhandwalla et Sturtevant (2001 [56]), les ratios ΔA_A des pores rencontr´es peuvent varier de 1e-7 jusqu’`a 1e-5.

Fracture de la membrane - La porosit´e cellulaire d’une cellule est associ´ee `a la d´eformation de la membrane (Zhou et al. 2012 [113]). La membrane peut alors se porer, voire mˆeme se fracturer et se d´echirer pour des contraintes trop importantes. Pour des fractures de taille trop importante, le noyau de la cellule peut ˆetre aspir´e en dehors de la cellule, ce qui provoque la lyse imm´ediate de celle-ci (Tachibana et al. 1999 [95]). Pour des pores tr`es importants, la r´esorbation du pore devient alors un processus mettant en action des processus internes `a la cellule (McNeil et Terasaki 2001 [62]). Une ´etude th´eorique (Zarnitsyn et al. 2008 [111]) donne un ordre de grandeur sur le temps de r´esorbation d’un pore de 300 nm. La taille du pore diminue avec une demi-vie de 20 `a 50 secondes, pour ˆetre finalement r´esorb´ee au bout de 900 secondes. Lokhandwalla et Sturtevant (2001 [56]) consid`erent la rupture totale de la membrane `

a partir d’une valeur critique de ratio ΔA_A de 2.5e-2. Notons cependant que mˆeme pour des dommages tr`es importants, les cellules peuvent r´esorber la fracture en g´en´erant des ”blebs”, des petites bulles issues de la membrane plasmique, qui peuvent adh´erer aux parois de fracture de la membrane (Schlicher et al. 2010 [91]).

Compromis viabilit´e-sonoporation - Il est important cependant de pr´eciser que la sono-poration cellulaire n’est pas forc´ement corr´el´ee avec la viabilit´e cellulaire. Dans certains cas, les cellules sonopor´ees peuvent pr´esenter des comportements d´efectueux, comme l’incapacit´e `a la mytose voire mˆeme l’apoptose cellulaire (Zhong et al. 2011 [112]). Le processus de sonopo-ration par cavitation semble jusque l`a impliquer une bonne part d’al´eas (Bouakaz et al. 2016 [5]). Apr`es le contrˆole du processus de sonoporation, un des enjeux futurs est d’obtenir une importante viabilit´e cellulaire.

1.2.2

Ph´

enom`

enes acoustiques

Les m´ecanismes de cavitation potentiellement responsables de la sonoporation sont multiples : la cavitation stable cause la pr´esence de microstreaming ou des m´ecanismes dus `a l’oscillation d’une bulle proche ou au contact de la cellule. La cavitation inertielle cause la cr´eation de microjets et d’ondes de choc et des conditions de temp´eratures extrˆemes dues `a l’implosion.

Oscillations stables et microstreaming - La bulle peut se comporter comme une micro-pompe avec des phases d’aspiration et de r´epulsion successives (push-pull) : au contact de la cellule, la bulle peut engendrer une d´eformation de la paroi cellulaire et la rupture des lipides de la membrane plasmique (Marmottant et Hilgenfeldt 2003, Postema et al. 2004 [59, 81]). A faible intensit´e ultrasonore, Nejad (et al. 2011 [65]) observe la pr´esence de pores ´eph´em`eres sans rupture de la membrane. Van Wamel (et al. 2006 [100]) a observ´e la cr´eation de pores ´eph´em`eres localis´es, avec un temps d’apparition tr`es court et synchronis´e sur l’oscillation de la bulle. Kudo (et al. 2009 [46]) a montr´e que l’on observait des pores uniquement o`u adh´eraient les bulles en premier lieu. Il a ´et´e montr´e aussi que l’action m´ecanique d’une bulle avait une influence sur le m´ecanisme d’endocytose. Tsukamoto (et al. 2011 [99]) a mis en ´evidence l’implication de la cavitation stable pour l’augmentation de la concentration d’ions Ca2+ dans le cytoplasme `a travers la signature acoustique de cavitation stable (sous-harmonique f₀/2). Selon Bouakaz (et

al. 2016 [5]), la pression m´ecanique sur la cellule avec une micropipette permet l’ouverture des canaux d’´echange ionique et une augmentation progressive de la concentration en ions calcium dans la cellule. L’oscillation stable g´en`ere aussi un flux stationnaire local appel´e microstreaming. La g´en´eration d’´ecoulement autour de la bulle peut cr´eer des pores nanom´etriques (Doinikov

et Bouakaz 2010 [20]), grˆace a la contrainte de cisaillement que l’´ecoulement exerce sur la cellule (Ohl et Wolfrum 2003 [73], Chen et al. 2004 [9]). Forbes (et al. 2008 [27]) met en avant l’effet important du microstreaming `a proximit´e d’une paroi. Selon Yang (et al. 2008 [104]), le m´ecanisme d’endocytose est aussi favoris´e par le microstreaming.

Implosions et microjets - L’implosion cr´ee une contrainte importante sur la cellule. Boua-kaz et Doinikov avancent que les ondes de chocs ont un effet sur la porosit´e cellulaire (Doinikov et Bouakaz 2010 [20]). Ohl et Ikink (2003 [73]) pr´ecisent que la poration cellulaire serait due `a l’interaction directe entre les ondes de chocs et la membrane. Zhou (et al. 2012 [113]) a mis en ´

evidence un effet dˆu `a la distance entre la bulle et la cellule sur la poration cellulaire, sugg´erant une distance critique pour sonoporer les cellules. Le mod`ele th´eorique utilis´e par Lokhandwalla (et al. [55]) pr´esente un allongement du pore inversement proportionnel `a la distance entre la cellule et la source d’´emission de l’onde de choc. Les microjets permettent aussi de percer la cellule (Ohl et al. 2006 [74], Dijkink et al. 2008 [19]). Les microjets cr´e´es par cavitation se comportent comme des microseringues, projetant le contenu th´erapeutique directement dans la cellule (Prentice et al. 2005 [82]).

R´eactions chimiques et thermiques - Localement, l’implosion des bulles peut causer des conditions extrˆemes de temp´erature et de pression (Flint et Suslick 1991 [25]). Au niveau mol´eculaire, les conditions extrˆemes de cavitation inertielle peuvent alors cr´eer des radicaux libres et des d´eriv´es r´eactifs d’oxyg`ene (ou ROS pour Reactive Oxygen Species). Ainsi, en plus de l’action des bulles, il a ´et´e montr´e que la pr´esence de d´eriv´es r´eactif d’oxyg`ene comme le peroxyde d’oxyg`ene H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dans le milieu augmentait l’internalisation des drogues. Juffermans (et al. 2006 [42]) a montr´e que la pr´esence de p´eroxyde d’oxyg`ene H₂O₂pouvait ˆetre corr´el´ee avec une augmentation de la production d’ions Ca2+ dans le cytoplasme. Le temps de recombinaison des radicaux libres ´etant tr`es court, le rˆole des radicaux libres `a des intensit´es faibles est peu pr´epond´erant et peut ˆetre ´ecart´e en comparaison des effets m´ecaniques (Clarke et Hill 1970 [13]). Par contre, pour de fortes intensit´es, les r´eactions chimiques peuvent jouer un rˆole important. Lionetti (et al. 2009 [52]) a montr´e qu’`a des amplitudes importantes de pression (un indice m´ecanique MI sup´erieur `a 1), l’internalisation des drogues ´etait deux fois moins importante avec la pr´esence d’inhibiteur de radicaux libres dans le milieu.

1.3

Contrˆ

ole temporel par mesure acoustique

Ph´enom`ene non-lin´eaire et sensible `a de nombreux param`etres ultrasonore et de milieu, la cavi-tation apparait comme un ph´enom`ene al´eatoire, instable dans le temps et non r´ep´etable `a cause d’une initiation difficile `a pr´evoir. Au del`a des param`etres ultrasonores comme la fr´equence, l’in-tensit´e et la dur´ee des trains d’ondes, le ph´enom`ene d´epend aussi de la pr´esence de germes ou de parois, de la nature exacte du milieu, de la temp´erature et de la pression. Pour illustrer ce ph´enom`ene, la figure 1.2 pr´esente un exemple des indicateurs moyens de cavitation inertielle enregistr´es sur un tir en fonction de la tension appliqu´ee aux bornes du transducteur. La figure 1.2a montre les indicateurs moyens obtenus pour chaque tir alors que la figure 1.2b montre la variabilit´e de l’activit´e de cavitation en fonction d’une consigne de tension. Les barres d’er-reur repr´esentent l’´ecart-type obtenu pour diff´erentes exp´eriences. Pour obtenir une activit´e de cavitation inertielle constante (de 11 dB, figure 1.2b), il faut potentiellement faire varier la tension en entr´ee (de 200 et 250 mV, figure 1.2b). P. Muleki-Seya a mis en ´evidence durant sa th`ese (2014 [47]) la pr´esence d’un effet d’hyst´er´esis : pour un balayage `a amplitude de for¸cage croissante, l’activit´e de cavitation inertielle apparait pour une intensit´e plus importante que pour un balayage `a amplitude d´ecroissante (Muleki-Seya et al. 2015 [92]). Cependant, dans le but de contrˆoler les effets induits par cavitation stable et inertielle, il est n´ecessaire de discri-miner les r´egimes de cavitation en fonction du temps, de mani`ere `a identifier pr´ecis´ement les

causes (effets biologiques induits sur les cellules). L’objectif est donc d’isoler chaque r´egime de cavitation grˆace `a une strat´egie de contrˆole. Ainsi, dans le but d’obtenir une activit´e de cavitation r´ep´etable, utiliser des param`etres ultrasonores fixes n’est pas suffisant. En mesurant directement et en contrˆolant l’activit´e de cavitation stable et inertielle en temps r´eel, il pourrait ˆ

etre possible de quantifier l’action m´ecanique produite par le nuage de cavitation, et `a terme maˆıtriser les effets m´ecaniques induits par cavitation. Le type de strat´egie choisie ici est un suivi acoustique de l’activit´e de cavitation grˆace `a des indicateurs spectraux bien d´efinis dans la litt´erature. Dose de Ca vitation Inertielle (dB) Tension (V)

(a)

(b)

Figure 1.2 – Activit´e de cavitation inertielle en fonction de la tension avant amplification. Les exp´eriences ont ´et´e effectu´ees avec la cuve grande ´echelle utilis´ee dans le chapitre 3.

1.3.1

Signatures acoustiques de cavitation

Dans le cas de la cavitation inertielle, l’indicateur spectral est le niveau de bruit large bande. L’´emission de bruit large bande est li´ee directement `a l’implosion des bulles et la g´en´eration d’onde de choc et pour des applications th´erapeutiques, l’indicateur de bruit large bande a ´et´e corr´el´e `a des effets biologiques, comme les pores et la viabilit´e cellulaire (Sundaram et al. 2003 [94], Zhou et al. 2008 [114]), le taux d’h´emolyse (Everbach at al. 1997 [24]) et la p´en´etration transscl´erale (Razavi et al. 2014 [87]). Pour plusieurs ´etudes, les effets de cavitation inertielle sont quantifi´es `a l’aide d’une dose (int´egration en fonction de temps) du bruit large bande ´

emis (Qiu at al. 2010 [86]). Grˆace au mod`ele d’un nuage monodisperse, Yasui (et al. 2010 [107]) donne une autre cause possible `a la g´en´eration du bruit large bande : il serait dˆu `a la fluctuation des bulles du nuage par fragmentation. Dans les deux cas, le lien a ´et´e fait entre les implosions et la mesure de bruit large bande grˆace `a des r´eactions sonochimiques dans le milieu (Dosage d’acide HTA, Mason et al. 1994 [61]).

Pour la cavitation stable, le nuage de cavitation ´emet une pression rayonn´ee avec des compo-santes sp´ecifiques. On rel`eve des ´emissions harmoniques, sous-harmoniques et ultra-harmoniques, dues `a l’oscillation faiblement non-lin´eaire du nuage. La composante sous-harmonique f₀/2 est

consid´er´ee depuis longtemps comme l’indicateur principal de cavitation stable (De Santis et al. 1967, Eller et Flynn 1969 [16, 22]). Malgr´e le fait que des composantes harmoniques soient produites par le nuage, elles peuvent ˆetre aussi produites par distorsion harmonique par des non-lin´earit´es dues `a la propagation dans le milieu ou par le transducteur ultrasonore. Les ´emissions sous- et ultraharmoniques, quant `a elles, ne seraient dues qu’`a la pr´esence et l’oscillation de bulles dans le milieu. Pour quantifier les effets biologiques de la cavitation stable, certaines ´

fonc-dans certaines ´etudes `a des effets biologiques comme la perm´eabilisation cellulaire (Morton et al. 1983 [66]), l’endocytose cellulaire (Tsukamoto et al. 2011 [99]) et les excavations d’erythro-cytes (Tsai et al. 2016 [98]). Contrairement `a la cavitation inertielle, l’activit´e de cavitation stable est trop faible pour pouvoir g´en´erer des r´eactions sonochimiques dans le milieu. Il est donc d´elicat de comparer l’action m´ecanique de cavitation stable entre diff´erents syst`emes, et diff´erents champs ultrasonores.

La cause d’apparition d’une importante ´emission de sous-harmonique f₀/2 est encore

mal-comprise. Son origine peut ˆetre multiple et est encore discut´ee (Bader et Holland 2013 [3]). La premi`ere hypoth`ese retenue est la pr´esence de bulles d’un rayon proche de deux fois le rayon r´esonant : 2Rres. La fr´equence de r´esonance de ces bulles est la fr´equence moiti´e de la fr´equence de l’onde ultrasonore. Cela ´equivaut donc `a exciter les bulles sur l’harmonique premi`ere du mode de r´esonance volumique. Cette hypoth`ese a fait l’objet de nombreuses ´etudes th´eoriques qui ont permis de tracer un seuil d’apparition d’´emission sous-harmonique pour des bulles libres (Prosperetti 2013 [85]) et encapsul´ees (Katiyar et Sarkar 2011 [43]). La deuxi`eme cause est l’importante oscillation volumique des bulles proches du rayon r´esonant Rres. Pour des pressions de for¸cage importantes, la bulle montre un comportement d’oscillateur non-lin´eaire, avec l’apparition d’une non-lin´earit´e de doublement de p´eriode. Ce comportement est li´ee `a la bifurcation vers le chaos d’un oscillateur, menant vers un comportement ap´eriodique pour un forcage plus important (Lauterborn et Cramer 1981 [49]). Deux autres hypoth`eses peuvent ˆ

etre mentionn´ees : la pr´esence de modes de surface des bulles, avec le mode de d´eformation `

a la fr´equence moiti´e (Longuet-Higgins 1989 [57]), et la pr´esence d’ondes de choc p´eriodiques (Johnston et al. 2014 [40]). Notons que toutes les hypoth`eses pr´esent´ees sont bas´ees sur la dynamique d’une bulle unique et ne prennent pas en compte la pr´esence d’interaction entre bulles. Il a cependant ´et´e montr´e exp´erimentalement que la fr´equence de r´esonance d’un nuage ´

etait plus faible que dans le cas d’une bulle unique (Yoon et al. 1990 [109], Nicholas et al. 1994 [71]) et th´eoriquement que la quantit´e de pression rayonn´ee ´etait plus faible en consid´erant un nuage de bulle monodisperse et homog`ene (Yasui et al. 2008 [105]). Au vu de ces ´el´ements, il semble int´eressant de consid´erer l’influence des interactions entre bulles sur l’´emission sous-harmonique du nuage.

1.3.2

Strat´

egies de contrˆ

ole temporel d’activit´

e de cavitation

Pour contrˆoler temporellement le ph´enom`ene, on peut utiliser plusieurs strat´egies, bas´ees sur la mesure quantitative, grˆace `a des indicateurs int´egr´es sur le temps et `a des boucles de r´etroaction en temps r´eel. En d´efinissant une consigne d’indicateur, il est possible de moduler l’intensit´e ultrasonore de mani`ere `a mesurer une activit´e de cavitation constante au cours du temps. Des chercheurs du labTAU ont mis au point une strat´egie de r´egulation de la cavitation inertielle sur le niveau de bruit large bande. Sabraoui (et al. 2011 [89]) a d´evelopp´e un syst`eme de r´egulation pour une sonoporation en tir ultrasonore continu avec une boucle de r´etroaction de 5 ms. Desjouy et al. (2013 [18]) ont am´elior´e cette strat´egie pour permettre des insonifications en tirs puls´es et de r´eguler avec une boucle de r´etroaction de 2 ms. Cette strat´egie de contrˆole a permis de sonoporer des cellules in-vitro dans un champ stationnaire (Muleki-Seya et al. 2014 [67]). Pour une application du contrˆole de la cavitation inertielle `a la sonothrombolyse, A. Poizat (2016 [79]) a d´evelopp´e durant sa th`ese un contrˆole ultrarapide de la cavitation inertielle avec un temps de r´etroaction inf´erieur `a la microseconde (environ 430 μs).

D’autre part, pour certaines applications, on souhaite r´eduire l’influence de la cavitation iner-tielle. Il a alors ´et´e pens´e des strat´egies comme l’utilisation de signaux modul´es en phase (Cha-pelon et al. 1996 [8]) ou en faisant varier la dur´ee entre les trains d’ondes (Huber et al. 1999 [38]). Au contraire, pour stimuler la cr´eation de cavitation inertielle, l’utilisation d’un signal bifr´equentiel a ´et´e propos´ee pour abaisser le seuil de cavitation (Gilles et al. 2006 [30]). Thomas et al. (2005 [97]) cherchent un rapport cyclique optimal pour maintenir une activit´e de cavita-tion. Hockman et al. (2010 [35]) ont propos´e de r´eguler grˆace `a un contrˆole de la temp´erature

avec une boucle de r´etroaction de 50 ms.

Une dose de cavitation stable (Stable Cavitation Dose) a ´et´e utilis´ee pour quantifier l’action d’ouverture de la barri`ere h´emato-enc´ephalique en int´egrant dans le temps les ´emissions sous-harmoniques (Tsai et al. 2016 [98]), ultra-harmoniques (Sun et al. 2015, Wu et al. 2016 [93,103]) ou encore la somme de diff´erentes composantes harmoniques (Marquet et al. 2014 [60]). En plus de strat´egies de suivi classique, il existe des strat´egies d’asservissement du ph´enom`ene de cavitation stable, notamment pour l’ouverture de la barri`ere h´ematoenc´ephalique. O’Really et Hynynen (2012 [76]) ont impl´ement´e un contrˆole de cavitation stable sur le niveau de sous-harmoniques et d’ultra-harmoniques. Tsai (et al. 2016 [98]) a propos´e une strat´egie de r´eactivation du composant sous-harmonique en utilisant des pulses longs `a intensit´e acoustique fixe. Les deux strat´egies reposent sur l’utilisation d’agents de contraste et sont bas´ees sur un temps de r´etroaction court (10 ms). De plus, l’activit´e de cavitation inertielle est mesur´ee `a tra-vers le bruit large-bande autour du pic f<sub>0</sub>/2 `a cause de la limitation en fr´equence du r´ecepteur [98].

1.3.3

Agents de contraste

Ces microbulles de taille nanom´etrique ou macrom´etrique (ne d´epassant pas un rayon de 4 microns) sont manufactur´ees avec diff´erents contenants, avec des coques souples ou rigides et peuvent ˆetre inject´ees directement dans l’organisme pour des applications d’imagerie ultraso-nore et de d´elivrance de drogues. Le fait de pouvoir utiliser des micro-bulles comme contenant pour transporter les m´edicaments dans un liquide comme le sang pr´esente des avantages : dans le cas de l’ouverture de la barri`ere h´emato-enc´ephalique par exemple, l’utilisation d’agents de contraste et d’un champ ultrasonore focalis´e permet non seulement de contrˆoler temporellement le ph´enom`ene mais aussi spatialement, en s´electionnant avec la tache focale la zone du vaisseau `

a porer. A part l’application in vivo, l’usage des agents de contraste est int´eressant car il permet d’augmenter la reproductibilit´e des r´esultats et d’abaisser le seuil de cavitation en introduisant des germes de nucl´eation dans le milieu.

Cependant, dans certaines situations, se passer d’agents de contraste pr´esente des avantages. Pour des applications in-vivo, la cr´eation d’un nuage de bulle sans agents de nucl´eation per-mettrait d’acc´eder et de cr´eer un nuage de cavitation dans des zones non directement irrigu´ees par des vaisseaux sanguins. Desjouy et al. (2015 [17]) ont montr´e qu’une activit´e de cavita-tion inertielle ´equivalente `a celle obtenue avec agents de contraste pouvait ˆetre obtenue en se passant d’agents de contraste `a l’aide d’une strat´egie de r´egulation, et cela pour des intensit´es ultrasonores comparables. Il a ´egalement montr´e que les agents de contrastes ´etaient d´etruits rapidement pour une activit´e de cavitation inertielle (20-30 secondes), ce qui en l’absence de strat´egie de r´egulation, ne garantissait plus une action m´ecanique constante et r´ep´etable pour de longs tirs ultrasonores. Dans le cas d’une sonoporation in-vitro, Chettab (et al. 2015 [10]) a mis en ´evidence de bons r´esultats de sonoporation avec un dispositif de tir avec transducteurs confocaux en se passant d’agents de contraste.

Chapitre 2

Activit´

e de cavitation stable d’un

nuage de bulles

Dans un premier temps, on s’attache `a mettre en ´evidence les causes d’apparition de la cavi-tation stable dans le cas d’une bulle unique en mod´elisant num´eriquement la dynamique de la bulle et l’´emission de l’indicateur de cavitation stable. Le seuil d’apparition de l’indicateur de cavitation stable th´eorique est ensuite exprim´e analytiquement grˆace `a la m´ethode de pertur-bation de Bogoliubov-Krilov. Enfin, pour prendre en compte l’interaction entre les bulles d’un nuage, la dynamique du nuage de bulles monodisperse et homog`ene est consid´er´ee grˆace `a la prise en compte de la densit´e du nuage avec un terme de couplage.

2.1

Dynamique d’une bulle de cavitation

La composante spectrale sous-harmonique de la fr´equence fondamentale est classiquement consid´er´ee dans la litt´erature comme indicateur principal de cavitation stable (oscillation vo-lumique fortement non-lin´eaire et oscillations lin´eaires pour R∼ 2 Rres), une ´etude num´erique sur la dynamique d’une bulle unique est r´ealis´ee, permettant d’identifier des seuils de cavitation stable et inertielle dans l’espace (R₀, pa).

2.1.1

Amplitudes des composantes spectrales en fonction de la

pres-sion et du rayon de la bulle

Pour appr´ehender la dynamique d’une bulle de cavitation ultrasonore proche du rayon r´esonant, le mod`ele de Keller-Miksis est simul´e `a l’aide du langage de programmation Python et d’un int´egrateur adapt´e pour la r´esolution d’´equations non lin´eaires (stiff, ODE15 ). Ce mod`ele, int´egrant les effets visqueux, de tension de surface et de compressibilit´e du fluide, permet de repr´esenter finement les oscillations de fortes amplitudes de la bulle et d’estimer les transitions oscillations-implosions de bulles. Suivant ce mod`ele, l’´evolution du rayon R(t) d’une bulle sup-pos´ee sph´erique dans un liquide infini, soumis `a une perturbation acoustique p(t), est r´egie par :  1− ˙ R c  ρR ¨R + 3 2ρ ˙R 2  1− ˙ R 3c  =  1 + ˙ R c  p₁+ R c dp₁ dt (2.1) avec : p₁ =  pstat+ 2σ Rn   Rn R _3χ − pstat− 2σ R − 4μ ˙R R − p(t) (2.2) et : p(t) = pasin(2πfet) (2.3)