Mat´ eriel et m´ ethodes

Dispositif de mesure : platine de transfection

Figure 4.1 – Sch´ema du dispositif de sonoporation : la platine ultrasonore avec transducteurs et la chaine de mesure externe (amplificateur et acquisition FPGA).

Le dispositif, con¸cu au laboratoire dans le cadre de la th`ese de P. Labelle[47], pr´esente l’avan- tage d’incorporer l’ensemble de la chaine ultrasonore d’´emission et de mesure (transducteur et hydrophone) au sein d’une platine de microscopie pour permettre des visualisations en temps r´eel d’interaction entre bulles et cellules durant un tir ultrasonore. Au centre de la platine est situ´e un puits de culture cellulaire (Labtek (Thermo Scientic Nunc, Rochester, NY, USA) ; dimensions : 20 x 20 mm2, volume : 2 mL) pouvant contenir de l’eau ou du milieu cellulaire. En particulier, cette platine est adapt´ee `a la sonoporation d’un tapis monocouche de cellules adh´erentes sur le puits de culture, mais le dispositif peut aussi ˆetre utilis´e pour des tirs sur cel- lules en suspension. Pour insonifier le milieu, deux transducteurs plans (barettes piezo´electriques

Ferroperm PZ 26 (Ferroperm, Kviss9 2 gaard, Denmark) ; fr´equence d’´emission : f₀ = 370 kHz ; dimensions : 18 x 3 mm2) sont plac´es au contact du puits sur 2 parois oppos´ees. Un gel de cou- plage ´echographique (Aquasonic ; Fisher ThermoScientic) est d´epos´e entre les transducteurs et le puits avant le tir pour faciliter la transmission de l’´energie et ´eviter une ´el´evation de temp´erature des transducteurs par r´eflexion d’onde. Cette adaptation, r´ealis´ee avec un syst`eme LC (bobine-condensateur) est inclus dans la platine. Sur une paroi libre du puits de culture, un hydrophone (HNR-0500 ; Onda, Sunnyvale, CA, USA) peu directif est plac´e pour ´ecouter le bruit de cavitation g´en´er´e au sein du milieu.

Caract´erisation de la structure modale dans le puit

Contrairement `a la configuration exp´erimentale d´ecrite dans le chapitre pr´ec´edent (cuve large et transducteur focalis´e), le champ ultrasonore dans les puits de culture pr´esente une structure stationnaire, avec des noeuds et des ventres de pression. Les figures 4.2a et 4.2b pr´esente la mesure de la pression sur le puits pour diff´erents plans d’observation. Dans ce cas de figure,

Pt= 0.8 Watts Longueur (mm) Largeur(mm) Hauteur (mm) Pression RMS (bars) Pt= 0.8 Watts Largeur (mm) Hauteur (mm) PRM S(bars)

Figure 4.2 – Cartographie en pression efficace du puits Labtek pour une puissance transmise

Pt = 0.8 W. a) Plans de coupe horizontaux - b) Plan de coupe vertical `a longueur x = 10 mm l’hydrophone utilis´e pour la mesure est un hydrophone `a fibre optique(Precision Acoustics) plac´e sur un bras robot (3-axes motoris´e, Owis) dont le balayage est automatis´e. Selon la di- rection verticale, le champ acoustique id´eal dans le puits doit v´erifier les conditions de pression maximale au fond du puits (z=0 mm) et une pression nulle `a l’interface libre eau/air. Dans un plan horizontal, le champ acoustique est proche d’un champ unidimensionnel entre les trans- ducteurs. Il est donc possible d’approximer la configuration modale mesur´ee dans le puits avec la forme de pression typique d’une cavit´e parall´el´epip´edique. En effet, si :

p(x, y, z, t) = A cos(kxx) cos(kyy) + cos(kzz)eiωt (4.1) avec kx = mπ/Lx; ky = nπ/Ly; kz = 3/2π/Lz, avec : Lz et Ly la largeur et la longueur du puits (20 mm) et Lz la hauteur du niveau de milieu (4 mm), alors :

fm,n = c 2π  mπ Lx ₂ +  nπ Ly ₂ +  3π 2Lz ₂ (4.2) Si l’on consid`ere ce mod`ele th´eorique pour f₀ = 370 kHz, on est proche de la configuration modale du type : n = 3 ; m = 6 (table ci-dessous) avec , l’incertitude sur la valeur de la c´el´erit´e dans l’eau (c = 1460 [± 15] m/s). n m f₀−  (kHz) f₀ (kHz) f₀+  (kHz) 5 5 372.37 376.23 380.10 3 6 363.50 367.27 371.05 4 6 375.86 379.76 383.66 1 7 372.37 376.23 380.10

Table 4.1 – Fr´equence des modes r´esonants dans le plan horizontal en fonction des indices n et m.

Utilisation de micro-bulles encapsul´ees

Un moyen d’initier plus facilement la cavitation est l’utilisation d’agents de contraste ultraso- nores comme germes de nucl´eation. Les agents de contraste utilis´es sont de type Sonovue dont une solution est pr´epar´ee `a partir de 5 ml de solution saline vers´ee dans le bocal avec les agents

´ Ev `enemen ts Diam`etre (μm) Jour 1 ´ Ev `enemen ts Diam`etre (μm) Jour 2 ´ Ev `enemen ts Diam`etre (μm) Jour 3 ´ Ev `enemen ts Diam`etre (μm) Jour 4 ´ Ev `enemen ts Diam`etre (μm) Jour 5 Concen tration en UCA Jour de tir Moyenne Ecart-type

Figure 4.3 – (a-e) Histogramme de r´epartition des diam`etres d’agents de contraste et (f) concentration en microbulles par mL estim´ee `a partir les images relev´ees avec la chambre de Malassez pour chaque jour de manipulation.

lyophilis´es. La concentration de microbulles est v´erifi´ee avant chaque jour de manipulation par comptage `a l’aide de cellules de Malassez. La chambre de Malassez est compos´ee de deux grilles avec 25 intersections et, pour chaque intersection de la grille, un microscope (LEIKA) est utilis´e pour compter les microbulles (routine de traitement d’image Matlab pour identifier, compter et relever le diam`etre des microbulles). La concentration totale d’UCA pour un puits Labtex de 2 mL est calcul´ee `a partir de la concentration d’UCA dans les 30 μl `a concentration dilu´ee pr´elev´ee pour l’observation avec la chambre. Les figures 4.3a-e pr´esentent les distributions de tailles d’UCA mesur´ees dans le milieu pour les cinq jours de manipulations avec cellules. Les figures montrent une r´epartition avec un pic maximal autour de 2 μm de diam`etre. L’´evolution de la concentration en microbulles par mL en fonction des jours est pr´esent´ee en figure 4.3f. La concentration moyenne est de 5.4.105 ± 2.2.105 micro-bulles/mL sur 5 jours. Il faut relever la variation importante de la concentration en fonction du jour de tir, et notons que la solution d’UCA utilis´ee a ´et´e renouvel´ee pour le 4`eme jour de tir.

(a)

CI

(dB)

Tension (mV)

Puissance

transmise

(W)

Tension (mV)

Tension (V)

CI (dB)

Figure 4.4 – (a) Indice CI moyen dans l’eau avec et sans ajout d’agents de contraste et (b) puissance ´electrique transmise par les barrettes ultrasonores en fonction de la tension avant amplification. (c-d) Concentration d’acide HTA fluorescent cr´ee dans le puits en fonction de (c) la tension avant amplification et (d) l’indice CI.

Caract´erisation des indicateurs de cavitation

Une ´etude pr´eliminaire est r´ealis´ee dans l’eau pour d´eterminer les dynamiques d’activit´e de cavitation inertielle (4.4a), avec ou sans agents de contraste, en fonction de l’intensit´e acoustique appliqu´ee. Les tirs ont ´et´e effectu´es en boucle ouverte pour plusieurs tensions, avec six r´eplicats et avec les mˆemes param`etres de tirs ultrasonores que ceux utilis´es pour le suivi et le contrˆole dans le chapitre pr´ec´edent (dur´ee de pulse : 250 ms ; rapport cyclique : 0.2 ; temps total : 60 s). En l’absence d’agents de contraste, le bruit large-bande ´emerge `a partir d’une tension seuil avant amplification de 200 mV, puis croˆıt de mani`ere monotone avec la tension appliqu´ee, avec une grande variabilit´e. Sur la gamme de tension utilis´ee, la dynamique est d’environ 20 dB. En pr´esence d’agents de contraste, il est int´eressant de noter que la cavitation inertielle apparait plus tˆot (autour de 100 mV), puis pr´esente une augmentation monotone en fonction de la tension. Le processus est aussi globalement plus r´ep´etable avec un ´ecart-type ne d´epassant pas 4 dB. A titre d’information, la relation quadratique obtenue entre la puissance transmise dans le milieu et la tension appliqu´ee avant amplification est pr´esent´ee en figure 4.4b. Dans l’objectif de pouvoir comparer les activit´es de cavitation inertielle entre diff´erents syst`emes, la quantit´e de radicaux libres hydroxydes (OH•) est dos´ee apr`es des tirs ultrasonores dans 2 ml de solution d’acide t´eraphtalique (TA). Le protocole de mesure est le mˆeme que celui d´etaill´e dans le chapitre pr´ec´edent (tirs en ´eprouvette). La concentration de HTA cr´e´e est repr´esent´ee en fonction de la tension en entr´ee (figure 4.4c) et de l’indice CI (figure 4.4d). Une relation quadratique est obtenue (figure 4.4d) entre la concentration de HTA g´en´er´e et l’activit´e de CI mesur´ee.

Mesure des taux cellulaires par cytom´etrie de flux

L’activit´e de cavitation cr´ee des pores dans les cellules qui vont permettre l’internalisation de mol´ecules. L’usage de marqueurs fluorescents permet de quantifier les cellules sonopor´ees et les cellules mortes et pour cela, la cytom´etrie de flux est utilis´ee. Le cytom`etre de flux per- met d’isoler les cellules de sorte `a les faire passer devant des d´etecteurs les unes `a la suite des autres. L’utilisation de lasers `a longueurs d’onde d’excitation choisies permet de mesurer non seulement la fluorescence, et de ce fait la pr´esence du marqueur dans la cellule, mais aussi la taille et la granulosit´e des cellules. En d’autres termes, le principe est le mˆeme que pour le spectrofluorim`etre avec le HTA, sauf que le cytom`etre est en mesure de donner des informa- tions g´eom´etriques en plus sur les ´el´ements passant devant les d´etecteurs. Les ´ev`enements sont ainsi s´electionn´es de sorte `a premi`erement exclure les d´ebris mais aussi les cellules qui passent en doublons devant le d´etecteur de mani`ere `a ne pas les comptabiliser dans le calcul des pour- centages des ´ev`enements marqu´es. Les pourcentages de sonoporation et de mortalit´e sont ainsi calcul´es `a partir de 10000 ´ev`enements valides. Les op´erations de tri effectu´ees par le logiciel d’interfa¸cage avec le cytom`etre de flux sont illustr´ees en figure 4.5a-d.

Avant et apr`es tir sont ajout´es des marqueurs fluorescents pour marquer la sonoporation et la mortalit´e cellulaire. Le marqueur de sonoporation est le Dextran (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), sucre de taille variable (3 `a 2000 kDa ou g/mol), greff´e au fluorochrome AlexaFluor 488, pour quantifier le taux de sonoporation dans les cellules. Le marqueur de mortalit´e cellulaire est le 7AAD, agent intercalant de l’ADN et ne p´en´etrant donc que dans les cellules mortes. Il est important de signaler que contrairement au siRNA, marqueur de sonoporation couramment utilis´e, le dextran est une mol´ecule inerte. Le siRNA r´eagit avec l’ARN messager de la cellule, ce qui indique que le marqueur a r´eussi `a p´en´etrer dans la cellule. Le Dextran ne r´eagit avec rien dans la cellule, son fluorochrome permet d’identifier sa pr´esence. Il est donc crucial de rincer plusieurs fois les cellules pour ´eliminer le Dextran qui n’aurait pas p´en´etr´e les cellules, de sorte `

a ne pas fausser les r´esultats au cytom`etre de flux. Si le Dextran `a fluorochrome a p´en´etr´e la cellule, alors une longueur d’onde verte (λex = 488 nm, λem = 530 nm) est ´emise, alors que si le 7AAD a r´eagi avec l’ADN du noyau, la longueur d’onde rouge (λex = 488 nm, λem = 647 nm) est ´emise.

(a) D´ebris _(b)

Doublons

Singulets

(c)

Cellules

Sonopor´ees CellulesMortes

(d)

Figure 4.5 – Capture de fenˆetre du logiciel DIVA pour analyser les r´esultats du cytom`etre de flux. (a) Les d´ebris sont d’abord exclus grˆace au premier filtre, puis (b) les doublons sont exclus grˆace au deuxi`eme filtre et enfin (c) l’´emission de fluorescence permet de discriminer la pr´esence de l’absence du marqueur de sonoporation (Alexa fluor 488) et de mortalit´e (7AAD). La figure (d) montre les pourcentages correspondants ainsi que le nombre total d’´ev`enements trait´es par cytom´etrie. La cat´egorie Q1 correspond aux ´ev`enements de sonoporation sans mortalit´e et la cat´egorie P3 (´equivalente `a la somme de Q2 et Q4) correspond aux cellules mortes.

Protocole de tirs

Les taux de sonoporation et de mortalit´e sont compar´es pour un jeu de 4 configurations : avec ou sans r´etroaction et avec ou sans agents de contraste. Le puits LabTex est rempli de 2 ml de milieu cellulaire (RPMI 1640 complet, suppl´ement´e de 10 % de s´erum de veau f´etal (FCS), et de 200 UI/mL de p´eniciline et 200 μg/mL de streptomycine) et de cellules en suspension. Le mod`ele cellulaire utilis´e, HT29, est une lign´ee de cellules de cancer colorectal humain. Ces cellules ont ´et´e d´evelopp´ees par Dr Lina Bolotine (Universit´e Henri Poincar´e Nancy 1, France). La concentration de cellules dans chaque puits est d’environ 3.106 cellules par puits. 10 μL de dextran est ajout´e avant chaque insonification du puits et une concentration d’UCA (n = 0.54 (±0.22) 106 microbulles/mL) est vers´ee dans les puits test´es. La dur´ee de l’excitation ultrasonore est toujours de 60 s, avec une configuration de tir en train d’onde avec un rapport cyclique de 0.2 et une dur´ee de cycle de 250 μs. Apr`es insonification, le milieu est pr´elev´e et vers´e dans des tubes qui sont centrifug´es. Ensuite, le marqueur de mortalit´e 7AAD est ajout´e et les cellules sont plac´ees dans l’obscurit´e pendant 10 minutes pour ´eviter un perte de fluorescence.