R´ esultats : cellules en suspension

Les taux moyens de sonoporation et de mortalit´e sont pr´esent´es en fonction de la condition test´ee pour tous les tirs. La barre pr´esente l’´ecart type sur tous les essais `a la mˆeme configuration sur trois jours (ici 12 r´eplicats). Quatre configurations de tirs en boucle ouverte et 5 configurations de tirs en boucle ferm´ee sont ´etudi´ees, et cela avec et sans la pr´esence d’agents de contraste. En figure 4.6a, les taux de cellules sonopor´ees sont pr´esent´es pour la configuration en boucle ouverte. Quelle que soit la tension appliqu´ee, une ´emergence du taux de sonoporation est visible par rapport aux valeurs t´emoins `a 2-4%. Dans le cas sans UCA, une augmentation du taux de sonoporation est visible en fonction de la tension (de 10 % pour 300 mV jusqu’`a 50 % pour 600 mV) avec un ´ecart-type important (environ 18% pour 400, 12% pour 500 mV et 8-9% pour 300 et 600 mV). Avec UCA, les taux obtenus sont sup´erieurs `a ceux sans UCA. Le taux moyen est d’environ 30 % pour 300 mV (± 8 %) puis un plateau est observ´e sur des valeurs proches de 50% pour les hautes intensit´es (400 - 600 mV), avec une importante variabilit´e pour 500 mV (± 13%). En boucle ferm´ee, une diminution de la variabilit´e peut ˆetre observ´ee, avec des valeurs d’´ecart-type n’exc´edant pas 10%. Sans UCA, le taux de sonoporation croˆıt en fonction des valeurs de CI de consigne (7-8 % de sonoporation moyenne pour 16 dB jusqu’`a 43-44 % pour 30 dB). En pr´esence d’agents de contraste, il est int´eressant de remarquer que le niveau de sonoporation est globalement plus ´elev´e avec agents de contraste que sans UCA pour une mˆeme activit´e de CI. Une ´evolution monotone apparait de 10 % pour 16 dB jusqu’`a 50% pour 28 dB puis un plateau est visible `a 50 % autour 28-30 dB, comportement qui est comparable au cas de la boucle ouverte. Il semblerait `a priori qu’une limite en terme de sonoporation ait ´

et´e atteinte.

Sur les figures 4.6c-d sont compar´es les taux de mortalit´e en boucle ouverte et en boucle ferm´ee. La diff´erence entre les taux de mortalit´e cellulaire obtenus en comparaison au taux de sonoporation est frappante. Dans le cas sans agents de contraste et boucle ouverte (fig. 4.6b), les valeurs moyennes de mortalit´e ne d´epassent pas 10%. Pour 300 mV, le taux de mortalit´e n’exc`ede pas la valeur t´emoin avant d’augmenter progressivement jusqu’`a environ 9% pour 600 mV. L’ajout d’UCA se traduit par une augmentation des taux de mortalit´e compris entre 5 et 20 %, avec des valeurs moyennes de mortalit´e centr´ees autour 12-14% pour les hautes intensit´es (400 - 600 mV). En boucle ferm´ee, les niveaux moyens n’exc`edent pas 12% avec une variabilit´e faible 2-3% (sauf dans le cas avec UCA pour 30 dB, l’´ecart type ´etant 6 %).

En figure 4.6e, sont repr´esent´ees les valeurs moyennes de CI mesur´e en boucle ouverte en fonction de l’intensit´e du tir. Dans le cas sans UCA, une augmentation monotone de la valeur moyenne est visible, de 15 dB pour 300 mV jusqu’`a 30 dB pour 600 mV. L’´ecart type diminue progressivement de 4-5 dB pour 300 mV jusqu’`a 1 dB pour 600 mV. Avec la pr´esence d’UCA, la

Boucle Ouverte

(a)

Boucle Ferm´ee

(b)

Boucle Ouverte

(c)

Boucle Ferm´ee

(d)

Boucle Ouverte

(e)

Boucle Ferm´ee

(f)

Synth`ese sur 5 jours - 12 r´eplicats

Figure 4.6 – Taux de sonoporation cellulaire (a) en boucle ouverte et (b) en boucle ferm´ee et taux de mortalit´e cellulaire (c) en boucle ouverte et (d) en boucle ferm´ee. (e) Indice de cavitation inertielle moyen en fonction de la configuration en boucle ouverte et (f) tension avant amplification moyenne en fonction de la configuration en boucle ferm´ee. Ces valeurs sont trait´ees pour des tirs sur 5 jours sur des populations de cellules HT29 en suspension, avec ou sans ajout de Sonovue.

variabilit´e est r´eduite autour de 1 `a 3 dB. Globalement, le CI est plus important avec UCA pour de faibles intensit´es (300-400 mV) et de niveau similaire entre les cas avec et sans UCA pour les hautes intensit´es (500-600 mV). D’autre part, en figure 4.6f sont repr´esent´ees les tensions n´ecessaires pour r´eguler `a plusieurs consignes de CI. Sans UCA, une augmentation monotone est visible, de 0.27 V pour 16 dB, jusqu’`a 0.65 V pour 30 dB. L’´ecart-type est de 30-50 mV, sauf dans le cas `a CI = 24dB o`u il est de 100 mV. Avec UCA, une augmentation monotone est aussi observ´ee, de 0.2V pour 16 dB, jusqu’`a 0.63V pour 30 dB, avec une variation qui augmente en fonction de la consigne, de 20 mV jusqu’`a 90 mV. Il est int´eressant de constater que moins d’´energie est d´epens´ee pour le cas avec UCA, sauf dans les cas `a 28-30 dB pour lequels les tensions moyennes sont similaires.

4.1.3

Discussion

Figure 4.7 – Taux de sonoporation en fonction de la tension en entr´ee (gauche) et de l’indice de cavitation inertielle (droite) - Les configurations en boucle ferm´ee sans UCAs et en boucle ouverte sans UCAs sont compar´ees.

Effet du dispositif de contrˆole sur l’internalisation des drogues - Dans un premier temps, l’ensemble des r´esultats de sonoporation obtenus sur cellules en suspension est com- par´e `a une condition identique de milieu environnant (absence d’UCA ici) pour ´evaluer l’effet intrins`eque du contrˆole temps r´eel de cavitation sur l’efficacit´e et la reproductibilit´e de sonopora- tion. La figure 4.7 pr´esente ainsi les taux de sonoporation obtenus sans microbulles d’UCA, avec ou sans contrˆole, en fonction de la tension moyenne appliqu´ee aux transducteurs (`a gauche) ou de l’activit´e moyenne de cavitation inertielle (`a droite). Il apparait que le taux de sonoporation est mieux corr´el´e au CI moyen mesur´e qu’`a la tension appliqu´ee, ce qui explique l’augmentation de la reproductibilit´e des effets biologiques lorsque le contrˆole temps-r´eel (CI constant, boucle ferm´ee) est utilis´e. Par contre, `a activit´e moyenne identique sur la dur´ee des tirs, l’efficacit´e de sonoporation n’est pas am´elior´ee par le contrˆole en BF. De la mˆeme mani`ere, assurer un niveau de CI constant au cours du tir n’induit pas de mortalit´e suppl´ementaire en utilisant la strat´egie de contrˆole (fig 4.6c-d).

Effet de l’ajout d’agents de contraste - Lorsque des microbulles sont ajout´ees au milieu et font office de germes de cavitation microm´etriques, alors les effets m´ecaniques et biologiques induits par leur pr´esence, `a intensit´e acoustique appliqu´ee fixe, sont sup´erieurs au cas o`u la cavitation doit au pr´ealable ˆetre initi´ee sans germes (figure 4.8). En plus de l’augmentation de l’efficacit´e de sonoporation, cela se traduit aussi par une diminution de l’intensit´e n´ecessaire

pour obtenir un effet biologique ´equivalent. Cela se confirme sur les activit´es de cavitation inertielle sup´erieures obtenues `a intensit´e identique (figure 4.6e), particuli`erement pour les plus faibles intensit´es. Avec le dispositif de contrˆole de cavitation inertielle, des taux de sonoporation similaires sont attendus pour une mˆeme consigne dans les configurations boucle ferm´ee (avec ou sans UCA).

Figure 4.8 – Taux de sonoporation en fonction de la tension en entr´ee (gauche) et de l’indice de cavitation inertielle (droite) - Les configurations en boucle ferm´ee sans UCA et en boucle ferm´ee avec UCA sont compar´ees.

Sur la figure 4.8 sont repr´esent´es les taux de sonoporation obtenus en boucle ferm´ee, avec ou sans UCA, en fonction de la tension moyenne appliqu´ee (gauche) ou du CI moyen mesur´e (droite). Une tendance claire est `a l’augmentation des taux de sonoporation `a CI ´equivalent lorsque les microbulles sont ajout´ees (10 % d’´ecart en moyenne dans la zone 24-28 dB). Ceci montre que l’indice de cavitation inertielle mesur´e (par ´ecoute du bruit ´emis) est d´ependant de la population de bulles ´etudi´ee. Ici la concentration de bulles en nuage libre ne peut pas ˆ

etre exp´erimentalement mesur´ee, et le seul ´el´ement de comparaison ´evident entre les deux configurations (avec ou sans UCA) est le diam`etre moyen des microbulles. Les UCA pr´esentent une distribution ´etroite de tailles centr´ee sur R ∼ 1μm, alors que les bulles nucl´e´ees dans l’eau vont ˆetre caract´eris´ees par une distribution de taille plus large avec un maximum de taille autour de R ∼ Rres ∼ 8μm, par diffusion rectifi´ee des bulles vers le rayon r´esonant (issu de la formule de Minnaert). Pour estimer l’impact de cette variation de rayon moyen sur l’activit´e de cavitation inertielle g´en´er´ee, il est possible de consid´erer l’´energie d’implosion Eb d’une bulle. Cette ´energie d´elivr´ee par une bulle lors d’une implosion peut ˆetre ´evalu´ee `a partir de l’´energie potentielle de la bulle ayant atteint sa taille maximale Rmax avant collapse. Durant un collapse isobare, l’´energie de la bulle peut ˆetre obtenue en multipliant la pression appliqu´ee par le volume maximal de la bulle :

Eb = 4/3πRmax3 (P∞− Pv) (4.3)

avec Rmax le rayon maximal atteint avant d´emarrage de la phase d’implosion, P_∞ la pression hydrostatique agissant sur la bulle et Pv la pression de vapeur saturante. A pression acoustique et fr´equence fix´ees, les bulles libres (proches de la r´esonance) vont naturellement subir une dilatation sup´erieure aux UCA (excit´ees `a f<sub>0</sub> ∼ 500 kHz ∼ fres/6, et ainsi Rlibremax est sup´erieur `

a RU CA

max). L’´energie d’implosion associ´ee `a une bulle unique v´erifie alors que EbU CA est inf´erieur `

a Elibre

b . Puisque le contrˆole du bruit large bande ´emis peut ˆetre vu comme un contrˆole de l’´energie de collapse cumul´ee sur l’ensemble des ´ev`enements et implosions, on obtient :

avec Ecollapse l’´energie rayonn´ee d´efinie comme la somme des ´energies ´emises par chaque mi- crobulle implosante. Alors, pour un niveau donn´e, le nombre d’´ev`enements issus d’implosions d’agents de contraste doit ˆetre sup´erieur `a celui de bulles libres (NU CA

coll sup´erieur `a Ncolllibre). Ceci est exp´erimentalement assur´e par la concentration utilis´ee d’UCA qui assure (une fois un seuil de pression atteint) une activit´e de cavitation inertielle sur une large population de bulles. L’augmentation intrins`eque du nombre d’´ev`enements d’implosion, `a consigne CI donn´ee, pour la population d’UCA se traduit alors (en probabilit´e d’interaction bulle implosante-cellule) par une augmentation du taux de sonoporation.

Figure 4.9 – Taux de sonoporation en fonction de la tension en entr´ee (gauche) et de l’indice de cavitation inertielle (droite) - Les configurations en boucle ferm´ee sans UCA et en boucle ouverte avec UCA sont compar´ees.

Peut-on vraiment se passer d’agents de contraste ? - Dans une ´etude pr´ec´edemment men´ee au laboratoire, il avait ´et´e dit que l’activit´e de cavitation en terme de CI avec UCA pouvait ˆetre contrebalanc´ee par le contrˆole en terme d’activit´e mesur´ee [17]. Un des objectifs de ce chapitre est de savoir si l’activit´e avec contrˆole sans UCA permet de sonoporer aussi bien qu’avec UCA sans contrˆole. A premi`ere vue, l’effet des agents de contraste reste quand mˆeme majeur. Il permet des taux importants (50 % pour 400 mV contre 45 % pour 600 mV) pour une intensit´e faible. Il est cependant important de garder en tˆete que l’usage d’agents de contraste est d´elicat et on´ereux (une solution devient inutilisable au bout de 3 jours). La capacit´e de sonoporer sans ajout de nucl´ei suppl´ementaires pour la transfection in-vitro peut alors ˆetre int´eressante. Dans le cas d’une sonoporaton in-vivo, o`u le d´epˆot thermique dans les tissus doit ˆ

etre minimis´e, l’usage d’agents de contraste reste n´ecessaire. Notons aussi que le contrˆole coupl´e `

a l’ajout d’UCA permet d’augmenter la r´ep´etabilit´e des r´esultats de sonoporation compar´e `a la configuration boucle ouverte avec UCA. Le niveau de sonoporation atteint pour la configuration en boucle ferm´ee avec UCA permet d’atteindre un taux de sonoporation de 50 % avec peu de variation pour une consigne CIcible de 30 dB.

Par ailleurs, l’´etude th´eorique men´ee dans le chapitre pr´ec´edent a montr´e que la concentration de bulles du nuage avait une incidence sur l’apparition du seuil de cavitation inertielle. Or le comptage avec la chambre de Malassez a permis ici de mettre en ´evidence une variation importante de la concentration d’agents de contraste de jour en jour. Il est donc n´ecessaire d’effectuer des exp´eriences pour calibrer la r´eponse des agents de contraste chaque jour. L’utili- sation de diff´erentes concentrations permettrait d’identifier une densit´e optimale exp´erimentale (lien avec chapitre 2) et l’utilisation de diff´erentes tailles de bulles permettrait de valider ou invalider l’hypoth`ese d’un bruit de cavitation d´ependant de la taille des bulles.