Caractérisation moléculaire d'une sulfatase, d'une kappa-carraghénase et d'une iota-carraghénase chez deux bactéries marines : Alteromonas carrageenovora et Cytophaga Drobachiensis

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Caractérisation moléculaire d’une sulfatase, d’une

kappa-carraghénase et d’une iota-carraghénase chez

deux bactéries marines : Alteromonas carrageenovora et

Cytophaga Drobachiensis

Tristan Barbeyron

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Tristan Barbeyron. Caractérisation moléculaire d’une sulfatase, d’une kappa-carraghénase et d’une iota-carraghénase chez deux bactéries marines : Alteromonas carrageenovora et Cytophaga Drobachiensis. Biologie moléculaire. Paris 6, 1993. Français. �tel-01113011�

Au vu de la législation sur les droits d'auteur, ce travail de thèse demeure la

propriété de son auteur, et toute reproduction de cette oeuvre doit faire l'objet

d'une autorisation de l'auteur. (cf Loi n°92-597; 1/07/1992. Journal Officiel,

2/07/1992)

Photographie en couverture : clones Escherichia coli recombinants exprimant la kappa-carraghénase de Cytophaga drobachiensis sur une boite de Zd-kappa colorée au rouge Congo, après incubation à température ambiante.

A Eliane Sobzack A Yves Malpièce

Il faut être courageux et travailler dur avec efficacité pour avancer sans changer de chemin, et encore savoir s'affirmer non se vanter

Résumé

Afin d'étudier la structure des carraghénases bactériennes, des banques génomiques ont été construites à partir des bactéries marines carraghénolytiques Alteromonas carrageenovora, Alteromonas fortis et Cytophaga drobachiensis.

Un gène codant pour une sulfatase (atsA) dans A. carrageenovora (ATCC 43555), non inhibée par le sulfate inorganique, a été cloné. Sa séquence nucléotidique a été déterminée. L'étude de cette sulfatase démontre qu'elle n'est pas la glycosulfatase qui désulfate les produits terminaux d'hydrolyse issus de l'action de la kappa-carraghénase, mais est une arylsulfatase supplémentaire dans cette bactérie. La protéine déduite de la séquence du gène ne montre aucune homologie avec d'autres protéines connues.

Les séquences nucléotidique et protéique du gène cgkA codant la kappa-carraghénase de A. carrageenovora (Mr 44412 Da) sont présentées. Ce gène code pour une protéine de 397 acides aminés et un peptide signal de 25 acides aminés a été identifié. L'enzyme pourrait être coupée deux fois lors de son excrétion. La kappa-carraghénase montre des homologies avec diverses glucanases de la famille 16 des glycosidases ainsi qu'avec la β -agarase de Streptomyces coelicolor. Les résidus Glu163 _{dans la kappa-carraghénase et} Glu155 _{dans la} β_{-agarase seraient catalytiques. Ces résultats indiquent que des protéines} ayant des structures tertiaires similaires peuvent avoir des spécificités de substrat différentes.

L'insert de la iota-carraghénase de C. drobachiensis code pour une protéine qui aurait une masse moléculaire approximativement égale à celle de l'enzyme excrétée. Cependant, son extrémité NH2 ne fait pas directement suite au peptide signal. Ceci suggère que, là aussi, une seconde coupure pourrait être nécessaire à son excrétion. Il n'y a pas de séquence de Shine-Dalgarno en amont du gène de la iota-carraghénase mais les séquences appelées Oméga et Epsilon pourraient initier la traduction. Aucune homologie avec d'autres protéines connues n'a été trouvée.

Summary

Genomic libraries from three carrageenan-degrading marine bacteria Alteromonas carrageenovora, Alteromonas fortis and Cytophaga drobachiensis were realised to study carrageenase genes and their protein structures

A gene encoding an sulfatase from A. carrageenovora (ATCC 43555) which is not inhibited by inorganic sulfate, was cloned. The nucleotide sequence of the sulfatase gene (atsA) was determined. This study suggests that this sulfatase is not the glycosulfatase which desulfates the end-products obtained upon cleavage of kappa-carrageenan by the kappa-carrageenase but is a arylsulfatase. Sequence comparisons did not reveal any homology with known proteins.

The nucleotide and deduced amino acid sequences are reported for the structural gene cgkA for kappa-carrageenase (Mr 44 412 Da) from the marine bacterium Alteromonas carrageenovora. The cgkA gene encodes a protein of 397 amino acids, and a signal peptide of 25 amino acids was found. These results suggest that the protein would cut twice to be exported. The enzyme is a new member of glycosyl-hydrolases family 16 which comprises glucanases from various sources and the β-agarase from Streptomyces coelicolor. It is proposed that residue Glu163 _{in the kappa-carrageenase from A. carrageenovora and Glu}155 in the β-agarase from S. coelicolor are important for catalysis. These latter data show that proteins with similar tertiary structure hydrolyse differents substrates.

The DNA fragment for the iota-carrageenase from C. drobachiensis encodes a protein with a molecular mass nearly similar to the exported protein. However, the N-terminus does not directly follows the signal-peptide. This suggest that, here also, the protein would be cut twice before beeing exported. There is no Shine-Dalgarno sequence, but the Omega and Epsilon sequences, observed upstream of the ORF, could initiate the traduction. No homology was found with other protein sequences.

Remerciements

Quand je suis arrivé à Roscoff, au mois de septembre 1986, Monsieur Pierre Lasserre s'est sans doute posé la question suivante : que vais-je bien pouvoir faire d'un biologiste moléculaire à la Station ? d'autant qu'arrivant de l'Institut Pasteur avec mon DEA sous le bras, je lui avait fait part de mon désir de passer ma thèse. C'est en souvenir de cette période que je le remercie vivement car depuis, il m'a non seulement accueilli à Roscoff, mais il a su aussi me présenter aux personnes qui allaient me permettre "de faire mon trou" (je pense à Bernard Kloareg, bien sûr, mais aussi à Yvette Berger et à Simone Chamroux). De plus il m'a toujours soutenu dans mon entreprise et m'a aidé vis-à-vis de l'administration de Paris VI lorsque j'en avais besoin.

Je remercie chaleureusement Yvette Berger avec qui j'ai eu beaucoup de plaisir à travailler pendant pratiquement une année. Elle m'a appris ce qu'était une station marine (plutôt étrange au début), et a essayé de m'inculquer quelques rudiments de phycologie (pendant que je l'initiais à la bactériologie). De cette période il reste un article dans les Cahiers de Biologie Marine, mais surtout une très grande amitié. Merci Yvette.

Cette thèse n'aurait pu être entreprise sans la volonté, le dynamisme et l'enthousiasme communicatif de Bernard Kloareg. Sans lui, rien n'aurait été possible : ma thèse, bien sûr, mais aussi, plus simplement, mon épanouissement dans un laboratoire de recherche à Roscoff. Bernard m'a intégré dans son équipe parce qu'il avait pressenti le besoin, pour lui, d'inclure la biologie moléculaire comme outil d'investigation d'un matériel biologique qui lui est cher : les algues. En cela il m'a fait confiance et j'espère qu'au fil du temps je ne l'ai pas trop déçu. Après quelques déconvenues sur les algues (matériel biologique trop difficile pour moi), il m'a offert de travailler sur les bactéries, organismes avec lesquels j'entretiens des relations privilégiées et qui m'ont toujours apporté un peu de chance dans mon travail. C'est avec un peu de malice que je constate que, même en travaillant sur les algues, on a toujours besoin des bactéries.

Je voudrai ici, remercier tous mes professeurs de Paris VII que j'ai eu la chance de côtoyer à l'Institut Pasteur ou à l'Institut Jacques Monod, et qui ne m'ont pas seulement enseigné la génétique moléculaire, mais qui m'ont aussi donné le goût pour

II

la recherche. Je tiens aussi à remercier mes professeurs de bactériologie et notamment messieurs Roger Malcoste, professeur à l'IUT de Quimper, L. Gardans, chercheur INRA à l'université d'Angers, et Jean-Paul Aubert, professeur à l'Institut Pasteur.

Je remercie vivement tous les membres du jury d'avoir bien voulu, chacun, éclairé cette thèse de son avis d'expert. C'est avec une très grande satisfaction et un très grand plaisir pour moi d'avoir le Professeur Jean-Paul Aubert comme président du jury de cette thèse. C'est un honneur qu'il me fait et, en souvenir du temps passé, je l'en remercie chaleureusement. Merci à Michel Philippe qui, depuis mon départ de Paris, a toujours eu un regard bienveillant sur moi et qui a bien voulu examiner ce travail, ainsi qu'à Patrick Forterre qui a finalement accepté d'être rapporteur et dont la présence ici, il le sait, est une joie pour moi. Merci à Bernard Henrissat avec qui j'ai passé un agréable séjour à Grenoble et qui m'a initié à la méthode d'analyse des séquences protéiques par HCA ; à propos de cette méthode, je suis, pour lui, la petite graine qu'il a semé à Roscoff et qui doit répandre "la bonne parole", je le remercie de sa confiance. Merci aussi à Gérard Peaucellier qui a toujours répondu à mes questions avec gentillesse.

Je remercie également tous les membres de l'équipe : Philippe Potin, que j'ai connu lorsqu'il encadrait le stage de phycologie, et qui a essayé (en vain) de m'apprendre quelques rudiments sur la taxinomie et l'identification des algues. C'est un compagnon très agréable, passionnant à écouter lorsqu'il parle non seulement des algues, mais aussi des oiseaux qu'il connaît si bien. Je le remercie également pour le temps qu'il a passé à corriger le texte de cette thèse. Avec Philippe il n'y a jamais de problèmes. Catherine Boyen qui, depuis l'époque où elle avait une bactérie alginolytique à identifier, est devenu la reine de l'ADN mitochondrial des algues. Catherine représente la bonne humeur de l'équipe. Je remercie globalement, mais non moins chaleureusement, tous les autres membres de l'équipe : Aldo Asensi, François-Yves Bouget, Corinne Kerbourc'h et Sylvie Rousvoal, ainsi que Charles C. Somerville pour toutes les discussions constructives que nous avons eu ensemble, Christophe Richard, qui a eu le sommeil perturbé par cette arylsulfatase et qui a beaucoup donné pour lui arracher quelques uns de ses secrets, Michèle Joncourt, qui a abordé, en ma compagnie, les techniques de biologie moléculaire avec une réussite et un plaisir évident, Jean-Marc Fontaine, qui a toujours le bon goût de me poser des questions pour lesquelles je n'ai pas les réponses, Hélène Benet, qui m'a toujours encouragé au moment de commencer à rédiger et Claire Billot qui, en toute amitié, en lisant quelques pages de cette thèse, m'a bien fait comprendre que je n'aurais jamais le prix Goncourt, Susan Loiseaux de Goër parce que, grâce à elle, j'ai appris à travailler seul, enfin, Anita Gérard qui m'a servi de secrétaire efficace à propos de nos occupations

extérieures au laboratoire. Je remercie aussi Nicolas Buisine qui a travaillé avec dynamisme et enthousiasme, ainsi que, Didier Flamand, qui est arrivé au moment où je commençais la rédaction de cette thèse, et pour lequel, donc, je n'ai sans doute pas assez consacré de temps. Cependant, cela lui a permis de montrer qu'il savait prendre de nombreuses initiatives.

Je remercie aussi Daniel Prieur et son équipe et notamment Gaël Erauso et Christian Jeanthon (travailleur de la pénombre). Grâce à eux j'ai eu, la confirmation que les bactéries marines étaient un sujet d'étude fascinant. J'ai trouvé beaucoup de plaisir à travailler avec Gaël (qui, en les faisant, m'a indiqué les erreurs techniques à ne pas faire). Les discussions sur la position taxinomique de telle ou telle bactérie que j'ai eues avec Christian ont été pour moi l'occasion de m'apercevoir que c'était encore un sujet qui me passionnait. Je le remercie également pour les corrections minutieuses qu'il a apporté à ce travail.

Comme dans mes activités il n'y a pas seulement le travail et la recherche, je terminerai ces remerciements en citant ceux sans lesquels un natif de la province du Maine (la Mayenne et la Sarthe pour ceux qui ne sauraient toujours pas où cela se trouve, malgré la publicité que j'en fais) comme moi, n'aurait pu, non seulement s'adapter, mais surtout apprécier à leurs justes valeurs les richesses de cette autre province qu'est la Bretagne. Je pense que Pierre Pondaven et Yvan Le Gall (alias Erwan Ar Gall) se seront reconnus. Ils m'ont appris à comprendre pourquoi on ne pouvait qu'être amoureux de la Bretagne (même quand il pleut). Yvan, avec qui je partage le souvenir des premiers temps du laboratoire, a été celui à qui j'ai appris un peu de bactériologie, à une époque ou il croyait que de couler des boites de Pétri était chose facile (illusion !). En échange, il m'a initié à la Bretagne (surtout au Haut-Léon), et en linguiste éclairé qu'il est, il m'a persuadé du bien fondé de préserver les parlés provinciaux et notamment, bien sûr, la langue bretonne. C'est avec une grande patience qu'il a corrigé le texte de cette thèse et je l'en remercie. Pierre, outre le fait qu'il ait eu la tâche ingrate de corriger les annexes de ce travail, m'a fait découvrir les paysages et aussi le kig-ha-farz (avec lipig) et a introduit avec plus ou moins de réussite un peu de breton dans mon vocabulaire. Il est aussi celui qui m'a initié à la voile, la pêche aux casiers et qui m'a appris à godiller (pas facile !) ; il m'a dit que j'ai été le meilleur élève qu'il ait eu, ce dont je suis très fier. Je les remercie aussi d'être très attentifs aux autres cultures, si j'en juge par le succès remporté auprès d'eux par l'eau de vie et les rillettes ramenées du Maine. Ils auront néanmoins suscité chez moi un regret : celui de pas connaître aussi bien la Sarthe que eux connaissent le Finistère. Je ne désespère pas néanmoins de leur faire apprécier les charmes du Maine, et ils sont nombreux.

IV

Note au lecteur

Le travail présenté dans ce mémoire est centré sur l'étude de trois gènes codant chacun pour une hydrolase. Cependant, trois parties principales peuvent être distinguées : une introduction générale, les résultats expérimentaux proprement dits, et les annexes.

Lors de la présentation des résultats expérimentaux, deux concepts reviennent souvent dans le texte : le concept de bactérie marine, et celui de galactane-hydrolase. C'est la raison pour laquelle, outre la volonté de ne pas vouloir coller au seul travail effectué, il m'est apparu indispensable de présenter aux lecteurs peu accoutumés à ces notions une introduction allant du très général, les bactéries marines, au plus précis, les galactanases.

L'introduction générale commence par une définition des bactéries marines au sens large, en essayant de mettre en évidence ce qui les distingue de leurs sœurs telluriques et ce qui caractérise le milieu marin. Ce chapitre se termine par une brève revue de la taxonomie des bactéries marines. La notion de galactanase, implique une relation entre les bactéries qui les sécrètent et les algues possédant les substrats pour ces enzymes. C'est pourquoi l'introduction générale se poursuit par une revue bibliographique des différents aspects que peuvent prendre les rapports entre ces deux types d'organismes. Enfin, cette première partie se terminera par une présentation des galactanes présents dans la paroi des algues et un aperçu sur les diverses galactanases connues et leurs différentes caractéristiques.

La seconde partie du mémoire présente le travail effectué sur les trois gènes étudiés. Son organisation est simple : un chapitre par gène avec en plus un chapitre plutôt méthodologique consacré à l'élaboration des banques génomiques. Ce dernier chapitre évite les redondances dans les suivants. Le chapitre consacré à la sulfatase a posé le problème de son emplacement. Le gène recherché étant une glycosulfatase et le gène identifié étant une arylsulfatase, j'aurais pu le placer en dernier à la fin du mémoire. Néanmoins, ainsi placé, il serait apparu plutôt comme un additif. C'est la raison pour laquelle j'ai choisi de le mettre en premier, parce que, d'une part, cela permet de placer l'un à coté de l'autre les deux gènes issus de la même bactérie et d'autre part cela correspond aux événements chronologiques (c'est le premier gène qui a été étudié). Cependant, le fait que la protéine de ce gène soit une arylsulfatase m'a conduit à m'interroger sur les connaissances que l'on avait sur ce type d'enzyme. Aussi, une revue bibliographique sur les arylsulfatases, leur expression, leur régulation et leur génétique est présentée en guise d'introduction à ce chapitre.

La troisième partie de ce mémoire est composée de quatre annexes. Les annexes 1, 2 et 3 permettent d'avoir des sections "Matériel et Méthodes" allégées. L'annexe 4 a été conçue pour décrire les principes généraux de telle ou telle méthode sans donner de détails. De plus, ces annexes donnent des renseignements complémentaires pouvant dépasser le cadre des études réalisées ici, mais intéressants et utiles à connaître.

Il apparaît donc que bien qu'ayant cherché à ce que ce mémoire soit le plus homogène possible, le cloisonnement dont il est l'objet permet au lecteur d'accéder rapidement à l'essentiel et aux renseignements qu'il souhaite, sans avoir à en lire son intégralité.

Au cours de la rédaction, il est apparu quelques difficultés de traduction, inhérente à la langue française. Le terme de "ligation" décrit une réaction sur l'ADN qui correspond à ce que réalise un chirurgien lorsqu'il réunit deux extrémités de vaisseau sanguin, le terme de ligature a donc été employé ici. Certains termes, très utilisés dans la langue de Shakespeare, ne possèdent pas forcément d'équivalent dans la langue de Molière. Bien qu'ayant entendu, au cours d'un séminaire en français, l'expression de buvardage sudiste pour "Southern blot", j'ai préféré laisser à son auteur l'entière responsabilité de cette traduction et ai utilisé plus prosaïquement l'expression de transfert sur membrane d'ADN.

Des problèmes de vocabulaire ont également été rencontrés. A polysaccharide et à oligosaccharide, j'ai préféré les termes de polyoside et oligoside, car je pense que le suffixe saccharide qui fait référence à saccharose (qui n'a rien avoir ici) est moins précis que les mots oside ou ose employés pour indiquer les unités de base des glucides. De même, j'ai employé les termes de nucléoïde et d'ADN nucléoïdique, préférant réserver le terme de chromosome aux organismes eucaryotes.

Enfin, bien qu'ayant essayé de trouver dans tous les cas une traduction la plus correcte possible, j'ai choisi de conserver les abréviations anglaises les plus connues. Par exemple, la phosphatase alcaline intestinale de veau a conservée son abréviation de CIP.

VI

Sommaire

Remerciements I

Notes au lecteur IV

Sommaire VI

Liste des abréviations VII

Introduction générale 1

Chapitre I : Banques génomiques 37

I. Introduction 38

II. Matériel et méthodes 46

III. Résultats et discussion 56

IV. Conclusions 70

Chapitre II : L'arylsulfatase d'Alteromonas carrageenovora 73

I. Introduction 74

II. Matériel et Méthodes 85

III. Résultats 91

IV. Discussion 113

V. Conclusion 120

Chapitre III : La kappa-carraghénase d'Alteromonas carrageenovora 121

I. Introduction 122

II. Matériel et Méthodes 128

III. Résultats 131

IV. Discussion 149

V. Conclusion 155

Chapitre IV : La iota-carraghénase de Cytophaga drobachiensis 156

I. Introduction 157

II. Matériel et méthodes 158

III. Résultats 161

IV. Discussion 174

V. Conclusion 179

Résumé, conclusions et perspectives 180

ANNEXES 186

Bibliographie 242

Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique.

AMPc : Adénosine monophosphate cyclique.

AmpR ou S : _{Ampicilline résistant ou sensible (antibiotique).} ARN : Acide ribonucléique.

ATP : Adénosine triphosphate.

β-SH : β-Mercaptoéthanol (agent réducteur).

BET : Bromure d'éthydium (colorant des acides nucléiques). BSA : Sérum albumine bovine.

Ci : Curie (unité de radioactivité). CIP : Phosphatase intestinale de veau.

cpm : Coup par minute (unité de radioactivité). dATP : Désoxyribo-adénosine triphosphate. ddXTP : Didésoxyribonucléoside triphosphate. DO : Densité optique (unité d'absorbance). DTE : Dithioérythritol (agent réducteur). DTT : Dithiothréitol (agent réducteur). dUTP : Désoxyribo-uridine triphosphate. dXTP : désoxyribonucléoside triphosphate.

EMBL : Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire. IEF : Focalisation isoélectrique (électrophorèse). Iota : Iota-carraghénane.

Iotase : Iota-carraghénase.

IPTG : Isopropylthio-galactoside. Kappa : Kappa-carraghénane

VIII

Kappase : Kappa-carraghénase. kb : Kilo paire de base.

kDa : Kilo dalton (unité de masse moléculaire).

LB : Luria-Bertani (milieu de culture pour Escherichia coli). LBA : Luria-Bertani ampicilline.

LBAT : Luria-Bertani ampicilline, tétracycline. LBT : Luria-Bertani tétracycline.

MES : Acide 2 (N- morpholino) éthone sulfonique (Tampon). min : minute (unité de temps).

MUF : Méthylumbelliférone MUF-S : Méthylumbelliféryl-sulfate.

PAGE-SDS : Electrophorèse en gels de polyacrylamide avec du SDS pb : Paire de base (unité de longueur des acides nucléiques). PMSF : Fluorure de phénylméthyl-sulfonyl (anti-protéases) PVP : Polyvinylpyrrolidone.

S : Unité Svedberg (unité de coefficient de sédimentation). SDS : dodécyl-sulfate de sodium (détergent anionique). SSC : (chlorure) de sodium; citrate de sodium.

TetR ou S _{: Tétracycline résistant ou sensible (antibiotique).} Tris : Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane (tampon). UV : Ultraviolet.

V : Volt (unité de différence de potentiel). W : Watt (unité de puissance électrique).

Introduction

Générale

2

A. Les bactéries d'origine marine

Lorsque d'une plage ou d'une grève, l'on observe la mer, la première impression est d'être à la frontière de deux mondes qui se côtoient mais qui semblent s'ignorer. Bien qu'en réalité l'on sache bien qu'ils interagissent de façon étroite, il apparaît que le milieu marin n'a que peu de choses en commun avec l'environnement terrestre : température relativement stable et froide, densité du milieu élevé, ensoleillement et oxygénation plus faibles sont quelques caractéristiques du milieu marin. Malgré ces différences la mer a été largement colonisée par d'innombrables espèces d'organismes eucaryotes appartenant aussi bien au monde végétal qu'animal et c'est à partir de la mer que ces organismes ont conquis la terre ferme. La présence de végétaux comme producteurs primaires (phytoplancton et algues benthiques) et d'animaux qui les consomment, suggère la présence obligatoire d'organismes recyclant la matière organique et servant d'intermédiaire entre les animaux et les végétaux. A l'instar du milieu terrestre, ce rôle est essentiellement dévolu aux organismes procaryotes (eubactéries et archaebactéries). On constate ainsi que tous les acteurs participant au fonctionnement des écosystèmes, présents dans l'environnement terrestre, le sont également dans le milieu marin.

1). Exigence en Na

_{des bactéries marines}

Les premières études taxinomiques sur les bactéries vivant dans les océans remontent à la fin du siècle dernier (Fischer, 1894). Depuis, beaucoup des observations effectuées alors, ont été confirmées par de nombreux chercheurs qui ont montré que la très grande majorité des bactéries hétérotrophes rencontrées dans l'eau de mer sont des cellules en forme de bâtonnet droit ou incurvé ou en forme de spirale, Gram-négatives généralement mobiles à l'aide de flagelles. Aujourd'hui, selon les taxonomies les plus récentes, on peut ajouter que ces bactéries appartiennent à l'embranchement des Eubacteria (si l'on met au rang de règne le terme de Procaryota) à la classe des Proteobacteria et à la sous-classe des gamma-Proteobacteria (la dernière édition de The Prokaryotes préfère parler de division et de sous-division). L'observation importante de Fischer est de constater qu'il obtient un nombre plus élevé de souches lorsqu'il incorpore dans les milieux de culture soit de l'eau de mer soit 3% NaCl. Par la suite, ce résultat fut interprété comme un phénomène osmotique car beaucoup de bactéries marines se lysent lorsqu'elles sont mises dans des milieux dilués (Pratt, 1974). Cependant il a été démontré que l'utilisation de milieux complexes n'était pas adaptée à l'établissement de ce caractère car ces milieux contiennent toujours des quantités non négligeables d'ions inorganiques (Richter, 1928). Un milieu synthétique a donc été mis au point pour tester de façon plus fiable le besoin en NaCl

de souches isolées des océans (MacLeod, 1968). L'utilisation intensive de ce milieu pour un nombre toujours grandissant de souches, démontrait que la plupart sinon toutes les bactéries marines Gram-négatives ont un besoin spécifique en ion sodium (MacLeod, 1968 ; Baumann et coll., 1972). Les autres sels présents dans l'eau de mer peuvent également jouer un rôle important dans la croissance des bactéries marines. L'optimum de croissance et de rendement en biomasse est atteint entre 70 et 300 mM NaCl selon les espèces, lorsqu'il y a 50 mM Mg++ _{et 10 mM Ca}++ _{dans le milieu. Si} les concentrations en ces deux éléments sont abaissées à 2 mM et 0,55 mM respectivement, les optima seront atteints entre 100 et 400 mM NaCl (Reichelt & Baumann, 1974). Dans beaucoup de cas, des concentrations plus élevées en magnésium et en calcium permettent de réduire la concentration en chlorure de sodium. Certaines souches ont un besoin spécifique en magnésium et calcium indiquant que pour celles-ci, la simple addition de NaCl dans le milieu ne permettrait pas leur croissance (Pratt, 1974)

Le rôle du sodium a été analysé chez l'espèce Alteromonas haloplanktis. Le sodium est indispensable pour le bon fonctionnement des perméases à acides aminés, à potassium etc. (Thompson & MacLeod, 1973). Le sodium est également indispensable dans le maintien de l'intégrité de la paroi chez cette espèce. Ces observations ont été étendues à d'autre espèces marines (Baumann & Baumann, 1981). Ces résultats suggèrent que le besoin en sodium est un caractère multigénique qui ne doit pas être facile à faire perdre par mutation. Contrairement aux bactéries marines (et aux halophiles extrêmes qui nécessitent plus de 3 M NaCl pour croître), les bactéries telluriques n'ont pas de besoin en sodium, ou sinon, sur une gamme de concentrations beaucoup plus faibles (Reichelt & Baumann, 1974).

La conséquence écologique première de ce besoin en sodium chez les bactéries marines, est qu'elles sont dans l'impossibilité de conquérir la plupart des biotopes terrestres. Réciproquement, il y a de nombreuses données qui suggèrent que les bactéries hétérotrophes Gram-négatives d'origine tellurique ne peuvent survivre (ou pas longtemps) dans l'environnement marin (Moebus, 1972). Il s'en suit une séparation des bactéries Gram-négatives en terrestres et marines résultant d'une adaptation à leur habitat respectif. De ce point de vue, il est étonnant de constater que la plupart des souches marines poussent mieux dans des milieux contenant 50 à 75% d'eau de mer plutôt que 100% (Gundersen, 1976) et que les concentrations optimales de croissance de 70 à 300 mM NaCl citées plus haut sont notablement plus basses que celle de l'eau de mer naturelle (450 à 480 mM) (Reichelt & Baumann, 1974). Cette observation reste inexpliquée car aucune corrélation n'a pu être établie entre la concentration optimale de chlorure de sodium et le lieu de prélèvement. Dans les cas extrêmes on peut imaginer l'existence de bactéries marines qui n'ont pas de besoin strict en sodium ; le terme de bactérie marine résulterait seulement du fait que ces souches ont été isolées

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de l'eau de mer. Récemment le cas de deux bactéries marines Gram-négatives hétérotrophes pouvant croître sur des milieux complètement exempts d'ions sodium a été rapporté (Manuel et coll., 1993).

La séparation des bactéries Gram-négatives en isolats marins et terrestres, pose la question de savoir s'il existe des espèces spécifiques du milieu marin. Deux lots de bactéries hétérotrophes, l'un d'origine marine et l'autre d'origine tellurique, ayant une fonction biologique similaire, telle que la minéralisation d'un composé organique simple, ont été comparés. Lorsque des échantillons marins étaient déposés sur des milieux sélectifs pour des bactéries terrestres, la flore résultante était composée de souches différentes de celles trouvées dans l'environnement terrestre (Reichelt & Baumann, 1973 ; Baumann et coll., 1972). Ce résultat suggère que la dégradation d'un même composé organique est effectuée par des bactéries différentes selon qu'elles se situent dans un environnement terrestre ou marin. Au niveau pratique, en vu de l'identification d'espèces marines en utilisant des tests biochimiques et enzymatiques, il parait évident, à la lumière de ce qui vient d'être exposé, que l'addition de chlorure de sodium et/ou de magnésium-calcium dans ces tests est une condition essentielle à une interprétation correcte des résultats d'identification.

2). Taxinomie

Au risque de simplifier à l'extrême, les eubactéries marines Gram-négatives hétérotrophes chimio-organotrophes peuvent être regroupées dans cinq grandes familles : les Desulfovibrionaceae, les Desulfobacteriaceae, les Vibrionaceae, les Pseudomonadaceae et les Halomonadaceae.

2-1. Les bactéries sulfatoréductrices

Les Desulfovibrionaceae (comme les Desulfobacteriaceae) regroupent des bactéries sulfato-réductrices jouant un rôle important dans le cycle du soufre (Widdel & Bak, 1992). Ces bactéries font une respiration anaérobie du sulfate qui est réduit en acide sulfhydrique (H2S). Deux genres sont communément placés dans cette famille : le genre Desulfovibrio qui est composé de quelques espèces marines et le genre Desulfomicrobium qui n'en contient pas.

Les Desulfobacteriaceae sont composées d'une dizaine de genres. C'est dans cette famille que se trouve l'essentiel des bactéries marines sulfato-réductrices (Widdel & Bak, 1992).

Les deux familles (classées dans les delta-proteobacteria) ont des métabolismes identiques et sont essentiellement séparées sur la base de leur GC%. Les D e s u l f o v i b r i o n a c e a e ont un GC% allant de 50 à 66% alors que les Desulfobacteriaceae ont leur GC% qui va de 40 à 60%. L'habitat des représentants des deux familles se situe dans des zones anaérobies souvent sous la couche superficielle

des sédiments marins ; ce sont notamment ces espèces qui sont responsables du noircissement du sable dans cette zone. Les espèces marines ont un besoin absolu en NaCl et magnésium et certaines souches d'origine tellurique sont halotolérantes. Les souches de ces deux familles peuvent pousser soit en condition autotrophe-chimiolithotrophe (en présence d'acétate en plus du gaz carbonique), soit en condition hétérotrophe-chimiorganotrophe en présence de malate (pour les Desulfovibrionaceae) ou d'acétate (pour les Desulfobacteriaceae). D'autre composés peuvent être utilisés comme le pyruvate, le lactate ou l'éthanol. Une croissance chimiorganotrophique-hétérotrophique, en absence de sulfate, a été observée dans des cas de symbiose entre les membres du genre Desulfovibrio et des bactéries méthanogènes ; ces dernières abaissant la pression partielle en hydrogène, pour former du méthane, les Desulfovibrio ne peuvent respirer et attaquent donc leur substrat carboné par fermentation (Widdel & Bak, 1992).

2-2. Les Vibrionacées

Les Vibrionaceae regroupent les genres marins Vibrio, Photobacterium, Lucibacterium, Oceanomonas, Alginovibrio, Listonella (les genres Aeromonas et Plesiomonas ne sont pas composés d'espèces marines) (Farmer III, 1992). La multiplication du nombre de genres illustre le fait que cette famille regroupe à la fois des souches halotolérantes et des souches halosensibles. C'est particulièrement le cas du genre Vibrio. L'espèce type de ce genre est la bactérie pathogène V. cholerae, une espèce vivant uniquement dans les eaux douces. En dehors d'autres Vibrio pathogènes pour l'homme et les animaux, beaucoup d'espèces ont été isolées de l'environnement marin et ont été l'objet d'intenses études taxinomiques (Kaper et coll., 1983 ; West et coll., 1985 et 1986). Afin de simplifier la classification, la tendance actuelle est de regrouper les Vibrio halophiles non lumineux dans le genre Oceanomonas, et ceux lumineux dans le genre Lucibacterium (Farmer III, 1992). La création du genre Oceanomonas, est d'autant plus intéressante qu'elle corrobore les filiations phylogénétiques entre les Vibrio ; les Vibrio halophiles semblent être suffisamment éloignés phylogénétiquement des Vibrio non halophiles pour justifier ce nouveau genre (Farmer III, 1992) ; il s'agit là d'une des premières créations d'un genre sur des bases phylogénétiques. Le genre Photobacterium regroupe uniquement des espèces marines qui sont très proches des Vibrio. Elles se caractérisent par l'émission intense de lumière. Ces organismes seraient responsables de la lumière émise par certains organes lumineux de poissons vivant en grande profondeur, établissant ainsi une relation symbiotique avec leur hôte (Farmer III & Hickman-Brenner, 1992). Malheureusement ce caractère lumineux est souvent rapidement perdu au cours des repiquages au laboratoire. La protéine responsable de l'émission lumineuse, la luciférase, a été purifiée, et est aujourd'hui très utilisée dans de nombreux tests

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biochimiques (Watanabe et coll., 1982). Le clonage des opérons l u x de P. phosphoreum et de P. leiognati a permis l'étude de leur organisation et la mise au point de vecteurs de clonage où les gènes luxA et luxB (qui codent pour la luciférase) sont utilisés comme gènes rapporteurs dans des expériences de génétique moléculaire (Engebrecht et coll., 1985 ; Carmi et coll., 1987 ; Kirchner et coll., 1989). Le genre Listonella regroupe des espèces marines pathogènes pour les poissons et le genre Alginovibrio est composé d'espèces pouvant dégrader l'acide alginique, le polyoside pariétal majeur des algues Phéophycées. La famille des Vibrionaceae est entièrement composée de bactéries hétérotrophes, chimiorganotrophes aéroanaérobies fermentatives, et de ce fait, les niches écologiques occupées par les membres de cette famille sont très variées (à la surface d'organismes végétaux ou animaux, sur les rochers, sur ou dans le sédiment) et ces caractères en font des organismes ubiquistes peu inféodés à une localisation particulière (hormis dans le cas des relations symbiotiques mentionnées ci-dessus).

2-3. Les Pseudomonadaceae

La famille des Pseudomonadaceae regroupe des bactéries hétérotrophes chimiorganotrophes (les espèces lithotrophes facultatives ont été transférées dans le genre Hydrogenophaga) mais à l'inverse de la précédente, elles sont aérobies et oxydatives (les Pseudomonas inertes sur milieu de Hugh et Leifson glucosé ont été transférés dans le genre Comamonas) (Willems et coll., 1992). Les genres officiels, rassemblés dans cette familles sont Pseudomonas, Zoogloea, Frateuria et Xanthomonas (Palleroni, 1992). Pour des raisons de commodité de présentation, et parce qu'ils présentent toutes les caractéristiques physiologiques et biochimiques de la famille, j'inclurai ici les genres Alteromonas et Marinomonas. La famille regroupe des espèces typiquement rencontrées dans le sol et les eaux douces en tant que saprophytes (Pseudomonas et Zoogloea), ou qui peuvent être phytopathogènes (Pseudomonas et Xanthomonas) ou zoopathogène (Pseudomonas). Bien qu'aucun Pseudomonas de la liste officielle ne soit d'origine marine (Pseudomonas perfectomarina une espèce marine dénitrifiante a été reclassé comme P. stutzeri) (Döhler et coll., 1987), il a cependant été décrit de nombreuses souches isolées de l'eau de mer et incluses dans ce genre. Par exemple, des espèces vivant en association avec des vers annélides polychètes, résistantes aux métaux lourds ont été isolées de sources hydrothermales profondes et quelques unes d'entre elles ont été identifiées comme appartenant aux genres Pseudomonas (Jeanthon & Prieur, 1990). Des espèces de Pseudomonas vivant à la surface de frondes d'algues brunes (Corre & Prieur, 1990), vertes et rouges (Barbeyron & Berger, 1989) ont été également décrites. De même, dans une étude portant sur une alginate-lyase bactérienne (une enzyme qui dégrade l'acide alginique), la bactérie responsable a été identifiée comme P. alginovora (Boyen et coll., 1990).

Dans tous ces exemples et pour toutes les espèces de Pseudomonas marins décrites dans les anciennes versions du Bergey's Manual (Breed et coll., 1957) ainsi que dans le Traité de systématique de Prévot (Prévot, 1961), aucune détermination du GC% n'a été réalisée. Il est donc possible que les espèces rencontrées soient de véritables membres du genre Pseudomonas, ou bien des souches mal nommées appartenant aux genres Alteromonas ou Marinomonas (De Vos et coll., 1989). Ces deux derniers genres regroupent des bactéries typiquement d'origine marine. Le genre Alteromonas a été créé en rassemblant des espèces précédemment placées dans le genre Pseudomonas, et qui avait un coefficient de Chargaff beaucoup plus bas que celui des autres Pseudomonas (Baumann et coll., 1972 ; Baumann et coll., 1984). Le genre Marinomonas a été créé pour séparer quelques espèces d'Alteromonas sur la base d'analyse des ARN ribosomaux. De plus, les études sur les caractères culturaux des deux genres, montrent que de nombreux tests biochimiques peuvent permettre leur séparation aisée (en exemple, aucune espèce de Marinomonas présentent une activité protéolytique sur la gélatine, alors que toutes les espèces d'Alteromonas sont gélatinolytiques) (Van Landschoot & De Ley, 1983).

Les espèces d'Alteromonas et de Marinomonas sont rencontrées dans tous les océans et mers du monde entier. A l'exception de A. nigrifasciens qui peut être rencontré dans des environnements non marins à la condition qu'il y ait suffisamment de chlorure de sodium (beurre salé par exemple), les Alteromonas et Marinomonas sont absents des biotopes terrestres (Gauthier & Breittmayer, 1992). Les espèces de ces deux genres ont été rencontrées aussi bien dans les mers chaudes que dans les mers froides à la surface de matériels submergés, biologiques ou non. Ce sont en général des espèces psychrophiles rencontrées dans des eaux bien aérées pour satisfaire les besoins en oxygène de ces bactéries aérobies strictes (eaux côtières, surfaces du sédiment, fermes piscicoles, cultures d'algues en bassins). A. denitrificans a été isolée dans les mers de Norvège jusqu'à 100 m de profondeur. Shewanella colwelliana (anciennement A. colwelliana) (Coyne et coll., 1989) a été décrite comme une espèce vivant dans les parcs à huîtres où elle stimule la fixation des larves de ces mollusques (Gauthier & Breittmayer, 1992). Enfin, plusieurs espèces d'Alteromonas pigmentées produisent des substances antibiotiques (Gauthier & Breittmayer, 1992). En plus de la douzaine d'espèces d'Alteromonas inscrits sur la liste officielle, deux autres espèces, classées auparavant comme des Pseudomonas, viennent d'y être adjointes (Akagawa-Matsushita et coll., 1992) : A. atlantica, qui produit une agarase et A. carrageenovora qui produit deux carraghénases. Ces deux types d'enzymes dégradent l'agarose et le carraghénane respectivement, deux galactanes pariétaux rencontrés chez les Rhodophycées.

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2-4. les Halomonadaceae

Les Halomonadaceae regroupent deux genres de bactéries Gram-négatives halophiles. Le genre Halomonas est composé d'espèces pouvant pousser dans un environnement très riche en NaCl (marais salants, fabriques de sels). La croissance a été obtenue très facilement sur des milieux complexes avec des concentrations en chlorure de sodium allant de 0,016 M à 5,5 M (Vreeland, 1992). De par cette très grande tolérance au sel, ce ne sont pas à proprement parler des bactéries marines, cependant, leur présence dans l'eau de mer a été rapportée en Mer Morte, en Antarctique et sur les nodules de manganèse dans l'océan Pacifique. Les espèces de ce genre accompagnent souvent les archaebactéries halophiles de la famille des Halobacteriaceae (Vreeland, 1992). Le genre Deleya est composé de bactéries halophiles modérées nécessitant entre 75 mM et 1 M de NaCl (Kersters, 1992). Ce sont des bactéries typiquement marines qui étaient classées auparavant dans les genre Alcaligenes ou Pseudomonas. La création de ce genre repose sur les résultats d'hybridations ADN-ARNr (Baumann et coll., 1983 ; De Vos et coll., 1989). Elles sont aérobies strictes, oxydatives et mobiles à l'aide de flagelles péritriches (excepté D. marina qui est lophotriche) ce qui les distingue des familles précédentes, dont les cellules possèdent toutes des flagelles polaires monotriches ou lophotriches (Kersters, 1992) (Fig. 1).

Il est bien évident que d'autres taxons renferment d'autres bactéries marines, mais on ne peut les mentionner toutes. Si l'on voulait être complet, il faudrait parler des bactéries phototrophes, des bactéries se déplaçant en glissant sur leur substratum (Herpetosiphon, Beggiatoa, Cytophaga etc.), du cas difficile concernant le genre Flavobacterium, des firmicutes (bactéries Gram-positives) unicellulaires et filamenteuses, et des archaebactéries. Dans un travail récent, une nouvelle espèce d'archaebactéries marines, isolée de sources hydrothermales, a été décrite, et un plasmide cryptique a été isolé (Erauso et coll., 1992 ; Charbonnier et coll., 1992).

Ce rapide survol de la taxonomie de quelques familles et genres bactériens (dont les caractéristiques principales sont résumées dans le tableau 1) montre que tous les groupes trophiques sont représentés dans l'environnement marin, et que les espèces les composant, entretiennent tous les types de relations écologiques avec les autres organismes marins : commensalisme, parasitisme, ou symbiose. Une des relations les plus étudiées est celles développées entre les bactéries et les algues protophytes ou métaphytes.

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B. Les relations algues-bactéries

On sait depuis longtemps qu'au cours de leur croissance, la plupart des êtres vivants excrètent des substances dans le milieu extérieur qui influencent à distance la croissance d'autres organismes (Lucas, 1947). Les effets de telles substances sont évalués en termes d'activité stimulatrice ou inhibitrice vis-à-vis de l'organisme cible, mais dans la pratique, une séparation aussi tranchée ne correspond pas toujours à la réalité, et l'effet résultant est souvent dépendant de la concentration. Une substance stimulatrice de la croissance à faible concentration, peut devenir un inhibiteur à des concentrations plus élevées ; c'est le cas de vitamines ou d'hormones. De même, une substance considérée classiquement comme inhibitrice, tel un antibiotique, peut s'avérer stimulatrice à concentration élevée. C'est le phénomène de l'hormésis décrit en bactériologie (Chabbert, 1963) et qui a été également observé chez les algues phytoplanctoniques (Bonin, 1969).

Des substances ayant un effet inhibiteur sur la croissance d'un organisme donné ont été mises en évidence en mettant en contact deux organismes différents. Les études les plus nombreuses mettaient en jeu des cultures mixtes d'algues unicellulaires et de bactéries. Ainsi il a été montré que la diatomée Thalassiosira rotula présente une croissance maximale qui varie en fonction de la densité de la population bactérienne qui l'accompagnait (Berland et coll., 1972a). L'action inhibitrice sur la croissance de cette diatomée peut être obtenue aussi bien à partir de bactéries telluriques pathogènes pour l'homme qu'à partir de bactéries marines isolées de cultures d'algues. Pour ces deux types de bactéries, ils ont constaté que l'effet d'antibiose n'apparaissait qu'à la fin de la phase exponentielle de croissance de l'algue. Au début de la culture, l'algue dispose d'une grande quantité de sels minéraux et l'équilibre est en sa faveur. En effet, les bactéries ne peuvent se multiplier qu'au détriment de métabolites excrétés par l'algue, ou au dépens de quelques cellules algales mortes. D'autre part, c'est au cours de la pleine croissance de l'algue que celle-ci excrète dans le milieu extérieur le plus de substances antibactériennes. Lorsque l'algue atteint la phase stationnaire de croissance, l'équilibre se déplace en faveur des bactéries. Du fait de la lyse cellulaire, la teneur en matière organique augmente, la production de substances antibactériennes diminue, toutes conditions qui ne peuvent que provoquer un accroissement brutal de la population bactérienne. La production de métabolites bactériens excrétés augmente d'autant, et certains d'entre eux peuvent devenir toxiques pour l'algue (Berland et coll., 1972a). Des expériences mettant en présence des algues et des filtrats bactériens autoclavés ont montré que ces substances inhibitrices sont thermolabiles (Berland et coll., 1972a). La production de substances inhibant la croissance bactérienne de la part de certaines algues avait déjà été suggérée dans des cultures de la diatomée

Chaetoceros affinis, où il avait été observé une diminution de la population bactérienne lorsque la densité en diatomées était élevée (Bonin, 1969).

Afin de prouver que les interactions entre bactéries et algues reposent bien sur des phénomènes d'antibiose, la purification et la caractérisation des substances concernées a été entreprise. C'est ainsi que deux substances inhibant la croissance bactérienne ont été isolées d'un filtrat de culture de la diatomée Fragilaria pinnata (Berland et coll., 1972b). Malgré ce résultat, un doute subsiste quant à l'efficacité de telles substances dans le milieu naturel car en culture, en milieu confiné, les conditions peuvent être orientées pour favoriser soit les bactéries soit l'algue. De plus, les concentrations de substance(s) efficaces pour agir sur un organisme peuvent être facilement atteintes. C'est pourquoi des tentatives de purification de tels principes actifs ont été entreprises à partir de l'eau de mer naturelle. Ainsi, une molécule de masse moléculaire de plus de 10000 Da présentant des propriétés antibactériennes a été isolée (Saz et coll., 1963). De même, une molécule de nature nucléosidique, observée dans des broyats de cellules d'Asterionella japonica, aurait été retrouvée en mer (Aubert, et coll., 1970).

La caractérisation des composés antibiotiques ou antiseptiques est assez rare. On peut citer l'acide acrylique isolé de Phæocystis pouchetii. Cet acide gras se retrouve dans le tube digestif des Euphausiaceae qui se nourrissent de cette algue, puis, à leur tour, ces animaux sont consommés par les pingouins. Il en résulte une accumulation d'acide acrylique dans le tractus digestif de ces oiseaux. Cet acide est en grande partie responsable de l'extrême pauvreté de leur flore intestinale (Sieburth, 1961). On peut citer également les chlorophyllides, composés issus de la dégradation des chlorophylles. Ces substances sont en abondance dans les populations vieillissantes d'algues et il semble probable que tous les organismes photosynthétiques puissent relarguer des chlorophyllides, ne serait ce qu'au moment de la mort cellulaire. Etant donné leur faible spécificité d'action, ces deux composés agiraient sur les bactéries plutôt comme antiseptiques que comme antibiotiques (Sieburth, 1964). D'autres produits agissant comme des antibiotiques ont été identifiés comme des lipopolysaccharides de haut poids moléculaire (entre 30 et 50 kDa) produits par des bactéries des genres Pseudomonas et Chromobacterium (Gauthier, 1970) ou ccomme des composés aromatiques produits par quelques Pseudomonas (Lovell, 1966) et Alteromonas. Les algues produisent également des antibiotiques comme l'acide kaïnique extrait de la Rhodophycée Digenea.

On constate donc que beaucoup d'organismes peuvent produire des antibiotiques. On considère qu'environ 25% des espèces d'algues connues possèdent cette faculté (Aubert 1971). Dans cette course à la production des antibiotiques, ce ne sont pourtant pas les algues qui arrivent en tête. Dans une étude concernant la frange littorale située près de Cumes, on constate que sur 100 organismes capables de produire des

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antibiotiques, 70 sont des champignons, 28 des bactéries et seulement 2 des algues (Paoletti, 1970). Il apparaît évident que les phénomènes d'antibiose sont fortement dépendant de la concentration en molécule(s) active(s). Sieburth (1961) a montré que l'acide acrylique ne pouvait agir qu'à des concentrations comprises entre 12 et 500 mg/ml, ce qui suppose un nombre d'organismes producteurs élevé, car ces substances généralement labiles ne peuvent s'accumuler dans l'eau de mer. On peut donc se poser la question suivante : de telles concentrations peuvent-elles se rencontrer dans le milieu marin ? Les principes actifs isolés par Berland et coll. (1972b) étaient issus de filtrats où la densité cellulaire (de Fragilaria pinnata) atteignait 7.109 _{cellules/ml. Les} concentrations cellulaires théoriques, après concentration du filtrat, étaient estimé à 7.1012 _{cellules/ml, une valeur bien supérieure aux densités phytoplanctoniques} comprises généralement entre 104 _{et 10}6 _{cellules/ml, et qui n'atteignent que très} exceptionnellement 108 _{cellules/ml dans les zones eutrophisées. Ces résultats font} douter ces auteurs de l'importance à accorder à de tels phénomènes d'antibiose in situ. De plus, il faut remarquer que la fraction dissoute en matière organique présente dans les mers est faible (de 1 à quelques mg/ml). Or, les bactéries et les algues sont généralement sensibles aux antibiotiques les plus efficaces de la pharmacopée lorsque leur concentration dépasse 1 mg/ml. Il faudrait donc que, dans le meilleur des cas, toutes les substances naturelles soient aussi actives que les plus efficaces des antibiotiques pour que l'effet d'antibiose apparaissent. Enfin, dans un écosystème en équilibre, on peut penser que tous les organismes présents sont adaptés et résistants aux éventuelles substances excrétées par les membres de cet écosystème. Tous ces arguments tendent à minimiser l'importance de l'antibiose dans le milieu marin et à ne faire considérer ce phénomène qu'au cours de cultures in vitro, où les conditions écologiques sont très altérées par rapport à l'environnement naturel.

Les relations entre les bactéries et les algues ne se limitent pas aux phénomènes d'antibiose. Des contacts plus intimes existent entre ces deux groupes. Comme l'épiderme des animaux, les algues hébergent à leur surface une multitude de bactéries qui peuvent être commensales saprophytes, symbiotiques ou pathogènes (Fig. 2). La surface des frondes des grandes algues du genre Laminaria, représente un des cas les plus étudiés. Les macrophytes marins produisent de grandes surfaces, qui permettent la concentration par adsorption et la libération de composés organiques, fournissant ainsi un substratum idéal au développement bactérien (Corre et coll., 1989a). Au cours du développement de Laminaria digitata, il a été constaté que le peuplement bactérien, toujours important (entre 1.107 _{et 4.10}7 _cellules/cm2_{) change progressivement. Sur les} tissus jeunes, les bactéries sont peu diversifiées, ont un métabolisme plus spécialisé et sont probablement commensales. Ce phénomène est peut être dû à la spécificité des

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des substrats contenus dans la paroi de ces algues ou à la production de tanins pouvant limiter le peuplement bactérien. Sur les tissus âgés et sur les débris, les bactéries sont beaucoup plus diversifiées, les besoins nutritionnels moins spécialisés et sont probablement saprophytes, ce qui peut être expliqué par la libération de divers substrats dûs à la lyse cellulaire (Corre et coll., 1989a et b). Il a également été constaté que la densité de population à la surface des frondes composées de tissus sains variait avec les saisons, atteignant un maximum en été et un minimum en hiver. Ce résultat était corrélé avec la température et la densité en germes libres dans l'eau de mer environnante. Sur les tissus âgés ou décomposés, ces fluctuations saisonnières n'étaient pas enregistrées, montrant ainsi que la microflore épiphyte était dépendante de la biologie et du cycle de vie de l'algue (Corre & Prieur, 1990). Il a été noté que les tissus sains avaient des densités de peuplement plus faibles que les tissus endommagés et que les bactéries étaient, à près de 85%, des coccobacilles capsulés dont beaucoup n'étaient pas cultivables. On a observé aussi que la production de polyphénols coïncidait avec la réduction de la densité bactérienne, suggérant que ce composé pouvait agir comme un agent sélectif à l'encontre de certains types bactériens et que quelques bactéries s'en protégeaient par la production d'une capsule. Sur les tissus âgés le pourcentage de cellules épiphytes en forme de bâtonnet était plus élevé (72% sur les petits fragments), de même que la proportion cultivable de ces cellules (Corre & Prieur, 1990).

Dans le but de cerner le type de relation que les bactéries épiphytes entretiennent avec leur algue hôte, il était devenu impératif d'obtenir des cultures d'algues axéniques c'est-à-dire complètement dépourvues de bactéries. Ces cultures se sont avérées par la suite très utiles dans des expériences de physiologie, de biologie cellulaire (culture de cellules isolées in vitro), de biochimie et de génétique moléculaire, lors d'extraction à partir d'algues de macromolécules telles que les acides nucléiques ou les protéines, afin que celles-ci ne soient pas contaminées par leurs homologues bactériens. La mise au point de ces cultures nécessite d'avoir une idée, ne serait ce qu'approximative, de la position taxinomique des bactéries épiphytes et surtout une connaissance de leur comportement vis-à-vis des composés antibactériens (antiseptiques et antibiotiques). La connaissance du comportement de l'algue vis-àvis de ces mêmes composés est également nécessaire.

Une étude sur l'influence de différents antibiotiques sur la croissance de la diatomée Chaetoceros affinis en culture a été entreprise (Bonin, 1969). Les antibiotiques testés dans cette étude étaient la pénicilline, le chloramphénicol, la tétracycline et la streptomycine. Aucun de ces antibiotiques, pris séparément, ne s'avère capable de détruire l'ensemble de la flore bactérienne sans léser irrémédiablement la diatomée. Le chloramphénicol et la tétracycline sont

particulièrement nocifs envers l'algue, alors que la streptomycine et la pénicilline (jusqu'à 10000 U/ml pour ce dernier), qui sont bien tolérées par la diatomée, ne diminuent que très peu la population bactérienne (Bonin, 1969). Le problème majeur dans ce genre d'expérience vient du fait que, face à une seule espèce d'algue, il cohabite une population très hétérogène de bactéries, et que la suppression de quelques types bactériens ne fait qu'enrichir la culture algale en germes plus résistants, et donc encore plus difficiles à éliminer.

Le même type d'expérience a été réalisé à partir de la culture de l'algue phéophycée Pylaiella littoralis. Trois espèces bactériennes Gram-négatives ont été isolées et dont la sensibilité à divers antibiotiques a été testée (Loiseaux & Rozier, 1978). Sur la quarantaine d'antibiotiques testés, seule la rifampicine inhibe les trois souches sans porter préjudice à l'algue. Celle-ci a été rendue axénique par l'emploi d'un mélange de pénicilline et de streptomycine, suivi d'un léger traitement aux ultrasons en présence d'un détergent non ionique (le Tween 80) puis enfin d'un traitement à la rifampicine.

Les études taxinomiques des bactéries épiphytes sont peu nombreuses. Une étude systématique a été entreprise sur 25 souches isolées à partir d'algues en culture (Berland et coll., 1970). Ces auteurs démontrent que les bactéries, en absence de facteurs de croissance dans le milieu de culture, utilisent comme substrat plutôt les acides aminés et les acides organiques que les glucides. Certains des substrats utilisés sont connus pour être excrétés par des algues phytoplanctoniques (Berland et coll., 1970). Les genres rencontrés dans cette étude, sont essentiellement Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium et Agarbacterium (aujourd'hui Deleya). Les genres Staphylococcus et Micrococcus, également mentionnés, correspondent probablement à des genres opportunistes, présents dans l'eau de mer car halotolérants. Une espèce de Xanthomonas est citée, mais il doit s'agir là d'une espèce mal nommée. Une étude similaire faite sur 58 souches de bactéries isolées à partir de diverses algues Chlorophycées, Phéophycées et Rhodophycées, mentionne également les mêmes genres (Kong & Chan, 1979). Ces auteurs estiment que la flore bactérienne associée aux algues est relativement spécifique des trois phyla algaux et qu'elle est différente de celle présente dans l'eau de mer environnante.

Une étude associant à la fois une identification taxinomique et l'utilisation d'antibiogrammes a été réalisée sur des bactéries épiphytes à partir de cultures de la Rhodophycée Antithamnion plumula et de la Chlorophycée Cladophora rupestris (Fig. 2). Une collection de 27 espèces de bactéries a été réalisée et les bactéries identifiées sur la base de leurs caractères phénotypiques (Barbeyron & Berger, 1989). Les genres mentionnés sont ceux classiquement rencontrés dans le milieu marin : Pseudomonas, Alteromonas, Deleya, Flavobacterium et Cytophaga. Une seule espèce du genre Vibrio a été isolée comme V. parahaemolyticus, mais probablement mal nommée. Les

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antibiogrammes ont été réalisés avec 19 antibiotiques sur 20 souches. Ils ont révélés, comme dans le cas des souches isolées de Pylaiella littoralis (Loiseaux & Rozier, 1978) que la rifampicine était un antibiotique très efficace (11 souches sensibles sur 20). Il semble également que la carbénicilline soit assez efficace car, sur les 5 souches testées, toutes étaient sensibles à cet antibiotique (Barbeyron & Berger, 1989). Ce dernier résultat peut être intéressant au regard de la sensibilité à la lumière de la rifampicine. Si l'on observe les résultats d'identification de Berland et coll. (1970), d'une part, et ceux de Barbeyron & Berger (1989), d'autre part, il semble que la surface des thalles héberge préférentiellement des bactéries aérobies (de type Pseudomonas et Alteromonas), plutôt que des bactéries aéroanaérobies (de type Vibrio).

En dehors des simples relations de commensalisme et de saprophytisme, il a été rapporté de rares cas de symbiose entre les bactéries et les algues hôtes. Ainsi lors de l'axénisation de Pylaiella littoralis (Loiseaux & Rozier, 1978), sur les trois espèces de bactéries isolées, une est bénéfique à la croissance de l'algue et semble vivre en étroite association avec elle, et une, formant des colonies jaunes, ne pousse qu'en l'absence des deux autres. De plus, il a été montré que l'algue rendue axénique, a un besoin impératif en vitamines (thiamine, vitamine B12) alors que l'algue non axénique ne montre aucune besoin. Cette observation suggère que une ou plusieurs des trois bactéries isolées est responsable de la sécrétion de facteurs de croissance nécessaires à l'algue (Loiseaux & Rozier, 1978). Ce type de relation décrit un phénomène de symbiose entre les bactéries et l'algue hôte.

De même, il a récemment été rapporté l'isolement de trois espèces de bactéries à partir d'une culture de l'algue rouge phytoplanctonique Porphyridium cruentum (Iqbal, 1993). Lorsque l'algue était mise en culture avec uniquement la bactérie n°1, une diminution de 18% de la biomasse et de 20% de la production de polyosides était enregistrée. Si à la culture algale on ajoutait la souche n°1 avec une des deux autres souches bactériennes, les inhibitions observées étaient de bien moindre importance ; enfin, si les trois souches de bactéries étaient ajoutées aux algues, aucune diminution dans la croissance ou la production de polyosides n'était constatée. Sur la base de l'effet cumulatif enregistré, les auteurs ont également classé ce type de relation comme une forme de symbiose (Iqbal, 1993).

Très peu de choses sont connues sur d'éventuelles bactéries pathogènes vis-à-vis de leurs algues hôtes. Au cours de recherches au niveau ultrastructural sur la Phéophycée Cystoseira nodicaulis, la colonisation microbienne de parties anciennes dénudées des axes a été observée (Pellegrini & Pellegrini, 1982). La lyse des cellules superficielles semble être progressivement accomplie par diverses bactéries. Certaines d'entre elles doivent posséder une activité alginolytique leur permettant d'envahir la

paroi cellulaire et de progresser en profondeur. L'invasion bactérienne est toujours observée dans les couches superficielles et n'endommage que légèrement le thalle. Elle s'accompagne de la production de matériel fibrillaire dont l'origine bactérienne ou algale n'est pas claire. Les bactéries observées et isolées sont des bâtonnets droits ou légèrement incurvés possédant toutes une activité alginase (ou alginate-lyase) et pouvant être rattachées aux genres Alginomonas (Pseudomonadaceae) ou Alginovibrio (Vibrionaceae)

Dans le but d'étudier la composition de la paroi des algues brunes, son organisation macromoléculaire et la structure des alginates, des recherches de bactéries marines produisant des enzymes pouvant dégrader la paroi ont été entreprises (Doubet & Quatrano, 1982 ; Boyen et coll., 1990 ; Corre, 1991). Les souches étaient isolées le plus souvent à partir d'algues en décomposition, sans qu'il ait été déterminé si ces germes sont pathogènes ou saprophytes.

Une équipe japonaise a décrit une maladie observée dans les cultures de Porphyra. La maladie appelée "Green spot rotting" est causée par une bactérie du genre Pseudomonas (Fujita & Migita, 1985). Les enzymes issues de cette souche ayant été utilisées dans l'obtention de protoplastes de Porphyra, il est probable que sa pathogénécité soit liée à la production de ces enzymes. Des études similaires à celles concernant la paroi des Phéophycées ont été réalisées chez les Rhodophycées, et l'isolement de plusieurs bactéries marines (pathogènes ou saprophytes ?) produisant des agarases et/ou des carraghénases a permis d'élucider la structure des galactanes concernés et d'obtenir des protoplastes à partir d'algues rouges telles que Porphyra (Fujita & Migita, 1987) ou Chondrus crispus (Le Gall et coll., 1990). Là encore, ce sont les thalles en décomposition qui ont permis l'isolement de la plupart des bactéries galactanolytiques.

C. Biodégradation des polyosides

pariétaux des algues marines

La connaissance des grands groupes taxinomiques des bactéries marines et de leur écologie permet non seulement d'effectuer des études de taxinomie et d'écologie bactérienne, mais aussi d'effectuer des criblages adaptés à ces souches en vue de la production d'enzymes pouvant dégrader les polyosides pariétaux des algues et notamment ceux ayant un intérêt commercial. Les alginates des Phéophycées, les agars et les carraghénanes des Rhodophycées sont économiquement de première importance. Ces polymères, ayant la propriété de former des gels, sont utilisés principalement dans l'industrie alimentaire, pharmaceutique et en agriculture. L'agar est le plus vieux phycocolloïde utilisé et a été découvert par Minoya Tarazaemon en 1658 au Japon où il était appelé kanten. En Occident l'agar était décrit par Payen en

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1859 qui l'appelait gélose. C'est Koch, le père du bacille qui porte son nom, qui en 1882, le premier, utilisa l'agar en bactériologie. Depuis, les applications de l'agarose et de ses dérivés se sont multipliées (Armisen, 1991). Ces applications vont des plus traditionnelles comme l'utilisation des agars dans la cuisine orientale, jusqu'aux plus modernes, comme leur utilisation dans les laboratoires de recherche lors d'électrophorèses de protéine ou d'ADN, pour lesquelles les agaroses de toujours plus grande pureté doivent être utilisés (Armisen, 1991). Les carraghénanes sont très utilisés dans l'industrie alimentaire où ils sont toujours employés dans un but technologique à l'exclusion de tout but nutritionnel direct, du fait qu'ils ne sont pas absorbés par le tractus gastro intestinal humain. Le but technologique est uniquement de modifier le comportement rhéologique des denrées alimentaires dans lesquelles ils sont incorporés, en allant du simple épaississement jusqu'à la gélification en passant par tous les stades intermédiaires (Deslandes, 1989). Les carraghénanes sont également très utilisés dans le domaine pharmaceutique notamment lors de traitements d'ulcères gastriques (Deslandes, 1989). En agriculture, l'emploi des algues fournit un autre exemple de valorisation industrielle. Dès le XVIIe siecle elles sont directement incorporées au sol qu'elles enrichissent en matières azotées et minérales. Aujourd'hui elles sont également utilisées dans l'alimentation du bétail. Depuis une dizaine d'années, des engrais liquides, préparées avec des extraits d'algues sont utilisés (Patier et coll., 1993). Il a été démontré que la laminarine (β-1,3-glucane) provenant d'extraits de l'algue brune Ascophyllum nodosum et présente dans ces engrais liquides, pouvait induire les activités laminarinase et α-amylase de cellules de Rubus fructicosus in vitro (Patier et coll., 1993). De façon plus générale, il a été démontré que les oligosides provenant de polyosides pariétaux de plantes supérieures et de champignons possèdent des propriétés élicitrices sur les cellules végétales en culture in vitro ou en plein champ (McNeil et coll., 1984). Ces propriétés concernent les domaines les plus variés de la biologie cellulaire tels que les défenses immunitaires (Ryan, 1988), la régulation de la croissance (McDougall & Fry, 1990) ou la différenciation cellulaire (Tran Thanh Van et coll., 1985 ; Eberhard et coll., 1989). De même, des oligosides rendus fluorescents ont été utilisés avec succès comme sondes pour localiser au sein même de la paroi chez des algues, les polyosides dont ils sont issus (Zablackis et coll., 1991). Les oligosides sont ainsi des outils précieux pour aider à élucider l'organisation pariétale chez ces végétaux.

Les travaux des chercheurs japonais (Araki, 1966) et du groupe de W. Yaphe (1966), associant des études chimiques avec la dégradations enzymatiques des polyosides pariétaux des algues rouges, ont permis d'élucider leur structure. Les conditions d'hydrolyse enzymatique sont douces et les produits des réactions ne subissent pas de modifications artéfactuelles dues aux conditions peu physiologiques des dégradations chimiques (hydrolyse à chaud ou hydrolyse acide). De plus, les

enzymes sont spécifiques d'un substrat et leur mode d'action ne s'exerce que sur un seul type de liaison glycosidique, en générant des produits de dégradation réguliers (Potin, 1992). C'est ainsi que l'emploi d'alginate-lyases bactériennes a permis d'étudier l'organisation de la paroi du zygote de Fucus (Doubet, 1983). Toutes ces applications montrent combien la connaissance de la structure des parois des algues et de celle des polyosides qui les composent, ainsi que l'obtention d'oligosides à partir de ces polyosides, sont tributaires de l'obtention d'enzymes spécifiques des principaux polymères présents dans ces parois. L'isolement de bactéries agarolytiques et carraghénolytiques, afin d'obtenir des agarases et des carraghénases, est donc nécessaire. De plus, la transposition de techniques de culture in vitro employées chez les plantes supérieures dans le domaine de la phycologie, comme l'obtention de protoplastes, que ce soit dans le cadre de l'amélioration des végétaux ou que ce soit dans le cadre d'expériences de biochimie ou de génétique, accentue encore le besoin en ces enzymes. Enfin, des études peuvent être menées pour élucider les mécanismes gouvernant la spécificité de ces enzymes vis-à-vis de leur substrat. On constate donc que l'étude de la biodégradation des polyosides pariétaux des algues intéresse autant le substrat, les produits de dégradation, que l'enzyme elle-même.

1. Principaux galactanes présents dans la paroi

des algues Rhodophycées

Les carraghénanes et les agars (l'agarose et ses dérivés substitués) sont des galactanes composés d'une alternance de α−(1,3)-D-galactose et de β− (1,4)-3,6-anhydro-galactose (Rees, 1969 ; Kloareg & Quatrano, 1988) ; ce dernier résidu pouvant, dans certains polyosides, être remplacé par une unité galactopyranose (les précurseurs de l'agarose et des carraghénanes ainsi que dans le lambda-carraghénane par exemple). Les résidus osidiques sont généralement sulfatés (sauf dans l'agarose qui ne contient aucune substitution) et plus rarement methylés en différentes positions, et occasionnellement on peut trouver de l'acide pyruvique (Craigie, 1990). La différence entre les carraghénanes et les agars est que, pour les premiers, l'unité galactose liée en C-4 est de configuration D, alors qu'elle est de configuration L dans les seconds. L'analyse aux rayons X de ces molécules révèle des structures secondaires en doubles hélices. Les carraghénanes forment des hélices droites, tandis que l'agarose forme une hélice ayant un pas à gauche (Craigie, 1990). Il est admis que la conformation ordonnée en hélice apparaît lors de la formation de gels à froid, où les hélices s'emboîtent les unes dans les autres. Dans le cas des carraghénanes, les interactions avec les cations favorisent la formation des doubles hélices et leur empilement en domaines pseudocristallins. Un phénomène identique a lieu avec l'agarose sans interaction de cations. A chaud, une conformation désordonnée en pelote statistique