5. Hybridations et comparaison de séquence

Les hybridations sur les profils HindIII des génomes de A. fortis et C. drobachiensis se sont révélées négatives. A. fortis ici a servi de témoin puisqu'il n'a jamais été détecté d'activité arylsulfatase chez cette espèce. En revanche une activité arylsulfatase est présente chez C. drobachiensis. Ce résultat indique qu'il ne peut y avoir qu'une très faible homologie de séquence entre les deux gènes responsables de

cette activité. Un résultat identique a été obtenu avec les hybridations effectuées sur les ADN natifs déposés directement sur une membrane. Seule l'ADN de A . carrageenovora s'est logiquement révélé positif, alors qu'aucune autre souche testée n'a montré de séquences homologues, bien que la souche n° 8 possède une activité arylsulfatase.

L'ensemble de ces résultats est à rapprocher de ceux obtenus après interrogation de la base de donnée de l'EMBL, où aucune séquence n'a présenté d'homologie significative avec l'arylsulfatase d'A. carrageenovora. Il apparaît donc qu'aucune arylsulfatase de séquence connue (arylsulfatases humaines, d'oursins, d'algues, ou de bactéries (K. aerogenes et la protéine inactive d'E. coli)) ne présente d'homologie avec celle de A. carrageenovora. Ceci indique que l'éloignement taxinomique de ces différents groupes, même au sein des eubactéries (entre les Enterobacteriaceae et les Pseudomonadaceae), est suffisant pour que ces gènes aient divergé fortement les uns des autres. Ceci est à un tel point d'ailleurs, qu'entre deux genres de la même famille, comme Klebsiella et Escherichia, on constate la perte d'activité arylsulfatase dans ce dernier genre (Yamada et coll., 1978) et pas d'homologie entre les deux protéines (même si les anticorps fabriqués avec l'une réagissent avec l'autre).

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V. Conclusion

Alteromonas carrageenovora produit une arylsulfatase qui n'est régulée ni par la cystéine ni par les ions sulfates. La protéine d'environ 36 kDa (33,9 kDa après retrait du peptide-signal, déduit de la séquence nucléotidique), est synthétisée de façon constitutive sous la forme d'un précurseur, et passe dans l'espace périplasmique de la cellule par la voie du peptide-signal.

L'enzyme clonée dans E. coli possède des caractéristiques enzymatiques identiques à l'enzyme initiale et est également synthétisée de façon constitutive et localisée dans l'espace périplasmique des cellules de cette espèce (bien que probablement moins efficacement maturée). La présence du gène atsB en amont du gène de l'arylsulfatase atsA, semble indiquer une organisation en opéron, mais de toute évidence, un promoteur directement en amont du gène atsA permet son expression dans les souches ne possédant qu'un gène atsB tronqué.

L'arylsulfatase de A. carrageenovora ne désulfatant pas les oligo-carraghénanes, il s'agit d'une enzyme différente de la glycosulfatase responsable de la désulfatation de ces substrats, isolée à partir de la même bactérie. Elle ne désulfate pas non plus certains polyphénols isolés d'algues brunes. Les substrats naturels de cette enzyme restent à ce jour inconnus.

Excepté avec la protéine de Porphyromonas gingivalis, aucune homologie de séquence entre cette arylsulfatase et une autre protéine de séquence connue n'a été trouvée, même lorsque cette autre protéine possède également une activité arylsulfatase sur le même substrat. Il semble que ces activités soient portées par des protéines ayant précocement divergé.

Chapitre III :

La

kappa-carraghénase

de

Alteromonas

carrageenovora

122

I. Introduction

La paroi est l'organite le plus externe de la cellule. Son rôle dans la nutrition, l'acquisition de la forme cellulaire, et la protection de la cellule contre les brusques écarts de pression osmotique ou contre certains agents pathogènes est généralement admis (Bell, 1981). La paroi est un système biphasique composé d'une phase squelettique, où sont localisés des polysaccharides fibrillaires, et d'une phase matricielle, moins organisée, contenant des polysaccharides de structure. La phase matricielle enrobe la phase squelettique puis s'étend pour former l'espace intercellulaire et est responsable de la cohésion des cellules au sein des tissus. Chez les végétaux terrestres, la phase squelettique, composée de fibres de cellulose, représente la majorité de la paroi, alors que la phase matricielle, composée d'hémicellulose et de pectine, est minoritaire. Chez les végétaux marins, le rapport entre ces deux phases est inversé. C'est chez les algues que la phase matricielle est la plus abondante, composée de polysaccharides acides (acides polyuroniques) ou sulfatés (Kloareg & Quatrano, 1988). Si, chez les algues marines, la phase squelettique est composée de cellulose cristalline (cellulose I) comme pour les végétaux terrestres, la proportion en est plus faible et peut être accompagné de xylane ou de mannanes en quantité parfois importante (Kloareg & Quatrano, 1988 ; Craigie, 1990). La phase matricielle des algues brunes est composée essentiellement de polyosides acides constitués d'acides uroniques. Le plus connu de ces polymères et le plus utilisé dans l'industrie est l'alginate présent chez les Phéophycées, où il peut représenter 10 à 45% du poids sec du thalle (Kloareg & Quatrano, 1988). Les alginates forment des gels iono-réversibles, la transition solution-gel étant dépendante du calcium. Chez les algues rouges, les polyosides matriciels les plus connus sont des galactanes sulfatés tels que les agaro-colloïdes (agars et agaroïdes) et les carraghénanes. Ces composés forment des gels iono- et /ou thermo-réversibles.

La présence de ces polyosides sulfatés a été rapportée dans la paroi cellulaire d'organismes marins aussi variés que des procaryotes eubactériens (y compris les cyanobactéries), des eucaryotes végétaux archaegoniates supérieurs tels que les phanérogames, ou thallophytes comme les champignons et, bien sûr, les algues. Il est intéressant de constater que les équivalents terrestres ou d'eaux douces de ces groupes (y compris les algues) ont peu ou pas de polyosides sulfatés dans leur paroi (voir pour revue Kloareg & Quatrano, 1988)