pariétaux des algues marines
I- 2. Obtention des inserts à cloner
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I-2. Obtention des inserts à cloner
Outre le choix du vecteur de clonage, l'obtention d'inserts en quantité suffisante et de bonne qualité est une condition essentielle pour obtenir une banque qui ait un nombre de clones recombinants représentant à eux tous le génome entier de l'organisme étudié. Deux stratégies sont utilisées pour construire de telles banques : les banques partielles et les banques totales.
Les banques partielles sont faites, soit en réalisant une coupure totale de l'ADN (avec une enzyme de restriction) et en sélectionnant les fragments de la taille adéquate, soit en purifiant les ARN, en sélectionnant ceux dont la taille correspond à la protéine désirée (avec un gradient de saccharose à l'équilibre par exemple) puis en convertissant ces ARN en ADN complémentaires. L'intérêt d'une telle méthode est l'obtention d'une banque avec un nombre de clones limité, ce qui est très utile dans le cas d'organismes eucaryotes réputés pour avoir un grand génome. Mis à part les difficultés techniques qui incombent à cette méthode, les inconvénients sont de deux ordres. Premièrement cette méthode suppose que la taille du gène recherché (ou de la protéine) soit connue pour pouvoir sélectionner les fragments d'ADN ou les ARN ; deuxièmement, une coupure totale de l'ADN risque de casser le gène en plusieurs morceaux, ou, dans le cas où l'option ARN est choisie, cela suppose que le gène soit exprimé.
Les banques totales sont beaucoup plus utilisées. Le principe de la méthode est de générer AU HASARD des fragments de taille homogène représentatifs du génome total. La notion de hasard est très importante, elle est une des clefs de la réussite. La
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meilleure façon d'obtenir de tels fragments est de casser l'ADN en le passant en force à travers une fine aiguille, ou bien en le cassant avec une presse de French, ou encore en le mettant au four à micro-ondes. Ces méthodes sont les seules qui permettent l'obtention d'une banque dite "au hasard". L'avantage de la technique est qu'il est statistiquement toujours possible de cloner le gène dans son entier même s'il est morcelé dans d'autres clones de la banque. Les inconvénients sont de deux types. Il est parfois difficile de doser le degré de cassure de l'ADN. De plus, les fragments ainsi obtenus doivent être traités pour pouvoir être clonés dans un vecteur : ligature des extrémités des fragments avec un adaptateur portant le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction servant au clonage, coupure avec cette même enzyme pour générer des extrémités compatibles avec celles du vecteur, déphosphorylation des extrémités des inserts afin d'éviter la formation de concatémères, fréquente à cause des extrémités cohésives résultant de la coupure des adaptateurs. A cause de ce dernier point, on notera qu'il n'est donc pas possible de déphosphoryler l'ADN vecteur. Il peut donc en résulter un bruit de fond élevé (clones avec le vecteur sans insert).
Pour contourner les difficultés décrites ci-dessus, on casse l'ADN avec une enzyme de restriction de façon partielle, pour conserver à la banque son caractère "au hasard". On obtient ainsi des fragments directement clonables sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des adaptateurs. De par la nature de la répartition des sites de reconnaissance des enzymes de restriction le long du génome, on réalise en fait une banque dite "pseudo-hasard". En effet, ces sites ne sont pas répartis de façon aléatoire sur le génome. Pour que la banque reste néanmoins le plus possible "au hasard", on choisit une enzyme qui coupe l'ADN fréquemment, c'est à dire ayant un site de reconnaissance à 4 bases (un site de reconnaissance à 4 bases coupera statistiquement toutes les 256 bases, alors qu'un site à 6 bases coupera toutes les 4096 bases). L'enzyme de restriction isolée d'une souche de Staphylococcus aureus appelé Sau3AI et ses isoschisomères (NdeII et MboI) sont les plus utilisés car ils reconnaissent la séquence à 4 bases GATC. Cette séquence contient les quatre nucléotides qui entrent dans la composition de l'ADN, aussi sa répartition est indépendante de la composition de l'ADN. L'autre avantage de ces enzymes est que la coupure a lieu devant la guanine de la séquence GATC. Les fragments ainsi générés portent donc cette séquence à leurs extrémités, qui est compatible avec le site de reconnaissance des enzymes BamHI et BglII, très utilisées comme site de clonage dans les vecteurs. En résumé, une banque dite "pseudo-hasard" réunis les avantages suivants :
- la coupure partielle évite de casser le gène, ce qui est important si le criblage de la banque repose sur son expression,
- la coupure partielle et le choix d'une enzyme coupant fré-quemment l'ADN permet l'obtention de fragments de taille homogène, ce qui évite les fragments de trop grande taille non clonables,
- la coupure partielle permet d'obtenir des clones chevauchants (clones ayant entre eux des séquences identiques), très utiles lors du séquençage,
- et il n'est pas nécessaire de connaître la position des sites cibles des enzymes de restriction sur l'ADN.
I-3. La ligature
L'autre étape clef avant l'obtention de la banque consiste à ligaturer les fragments d'ADN obtenus par une des méthodes décrites précédemment avec l'ADN vecteur. Selon que l'on a utilisé un phage λ (ou un cosmide) ou un plasmide, la conformation des molécules produites par la ligature devra être différente. La réaction d'encapsidation in vitro nécessite de longues molécules linéaires, concatémères de phages recombinants. L'efficacité de transformation de bactéries Gram négatif est beaucoup plus élevée avec des molécules circulaires qu'avec des molécules linéaires. L'analyse des produits de la ligature en fonction de plusieurs paramètres tels que les concentrations de vecteurs et d'inserts, la taille de ces molécules, le temps et la température d'incubation de la réaction en présence de ligase a été réalisée par Dugaiczyk (1975).
Brièvement, on distingue dans une réaction de ligature deux valeurs appelées j et
i liées aux molécules d'ADN : le facteur j est la concentration d'une extrémité dans le
voisinage immédiat de l'autre extrémité de la même molécule. Elle est dépendante de la longueur de la molécule l et de sa conformation dans l'espace b. Les paramètres l et b ont été mesurés et calculés pour l'ADN du bactériophage λ (13,2 µm et 7,17.10-2µm respectivement), donnant ainsi pour cet ADN la valeur de j appelé jλ (3,6.1011 ext./ml). La valeur de j pour une molécule d'ADN quelconque est obtenue en la rapportant à celle du phage λ par l'équation suivante où MM représente la masse moléculaire (MMλ est de 30,8.106 Da) :
j= j
λ(MM )
MM
λ 3 2/ (ext./ml ) ext. = extrémitéCette équation illustre bien que le facteur j est indépendant de la concentration en ADN dans le mélange de ligature.
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La deuxième valeur est la concentration totale d'extrémités i dans le mélange de ligature. La valeur de i est dépendante de la concentration molaire en ADN. Selon que les fragments d'ADN ont des extrémités auto-complémentaires ou non (identiques ou non), la valeur de i s'obtient par les équations suivantes :
-3 0
i = 2N M . 10
i = N M . 10
0 -3 (ext./ml) (ext./ml) ou (extrémités identiques)(extrémités non identiques)
où M est la concentration molaire des molécules d'ADN et N0 est le nombre d'Avogadro.
C'est le rapport j/i qui conditionne la forme que prendront les molécules issues du résultat de la ligature. Lorsque i est supérieur à j (j/i < 1), une majorité de molécules linéaires sera obtenue, quand i est inférieur à j (j/i > 1) la circularisation aura préférentiellement lieu durant la ligature. Des courbes représentant la concentration d'ADN en fonction de la masse moléculaire ont été tracées pour différentes valeurs de j/i (Dugaiczyk et coll., 1975).
Dans une réaction de ligature, il y a deux espèces d'ADN : les molécules vecteur et les inserts. L'efficacité avec laquelle on obtiendra des molécules chimères dépend non seulement de j et de i mais aussi des concentrations relatives d'extrémités des inserts par rapport à celles du vecteur. Les rendements maximums en molécules recombinantes dans le cas d'un clonage dans un plasmide sont obtenus avec une concentration d'ADN vecteur donnant une valeur de j/i comprise entre 1 et 3, et avec une concentration d'extrémités des inserts approximativement 2 fois celle du vecteur.
En pratique, ces équations sont très utiles pour connaître les quantités d'ADN à mettre dans la réaction. Le plus difficile à estimer est la quantité d'inserts potentiels, surtout lorsqu'il y a eu beau coup d'étapes pour obtenir cet ADN. Enfin il est vraisemblable que certaines des extrémités en présence dans le mélange de ligature soient endommagées par la préparation des ADN.
Les principes rappelés précédement ont guidé la préparation de banques génomiques à partir des bactéries étudiées. Ce chapitre méthodologique décrit dans le détail la préparation de banques génomiques de Alteromonas carrageenovora, A. fortis et Cytophaga drobachiensis et présente les résultats du criblage de ces banques pour les diverses activités recherchées.
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