2. Expression de l'arylsulfatase par les clones et sous-clones recombinants

Quatre clones recombinants ont été isolés à partir de la banque génomique d'A. carrageenovora. Si l'expression de l'activité arylsulfatase de ces clones recombinants est mise en évidence aussi facilement qu'à partir d'A. carrageenovora, il apparaît

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néanmoins des différences dans les taux de cette production. Il est possible que ces différences soient dues aux différences de structure des inserts clonés.

SA2 et SA3, qui produisent l'arylsulfatase en quantité équivalente à A . carrageenovora, ont les inserts les plus grands. Des séquences essentielles à la régulation de l'expression de l'enzyme sont peut être présentes sur ces inserts, mais il faut remarquer que sur les cartes des plasmides, la partie en amont du gène atsA (à droite de la partie commune à tous les clones) du plasmide pSA3 est différente de celle présente sur le plasmide pSA2. Comme cette région de ce dernier plasmide est présente également sur le plasmide pSA1, il est vraisemblable qu'elle corresponde à la séquence réelle présente dans A. carrageenovora. La différence observée sur le plasmide pSA3 est peut être due soit à la ligature de deux inserts Sau3AI dans la même molécule d'ADN vecteur, soit à la présence d'un deuxième gène arylsulfatase. Cette dernière possibilité est peu probable au vu des résultats d'hybridation de la sonde sur le génome de A. carrageenovora, qui ne montrent qu'une seule bande de marquage, postulant ainsi l'existence d'un seul gène arylsulfatase chez A . carrageenovora..

Les séquences régulatrices, si elles existent, seraient donc plutôt dans la région située en aval du gène atsA. Cette région est présente à la fois sur les plasmides pSA2, pSA3 et pSA4. De plus, il est possible que ces séquences contrôlent positivement l'expression de l'arylsulfatase, car le seul plasmide ne les possédant pas, le pSA1, produit moins de 20 fois moins d'arylsulfatase que A. carrageenovora.

Le pSA4 qui produit deux fois plus d'enzyme qu'A. carrageenovora, ne présente aucune séquence d'A. carrageenovora en amont du gène atsA. Ce résultat permet de ne pas exclure la possibilité que ces séquences puissent jouer un rôle de régulateur négatif, ce qui expliquerait, là aussi, la faible production de pSA1 qui ne possède que ces séquences en plus du gène atsA. Cette dernière hypothèse, cependant, ne semble pas être confirmée par le taux d'expression de pSA3. En effet, si elle devait être juste, le pSA4 et le pSA3 devraient exprimer l'arylsulfatase à un taux similaire. Il semble plus probable que le facteur de 2 en faveur du pSA4 pour le taux d'expression de l'arylsulfatase soit dû à un nombre de copies du plasmide plus élevé dans la cellule, ceci en raison de la petite taille de l'insert (5,6 kb).

Il semble évident que l'expression de l'arylsulfatase par les quatre clones obtenus dans la banque est sous le contrôle du promoteur du gène arylsulfatase. Le gène atsA est en orientation inverse par rapport au promoteur du gène tétracycline présent sur le pAT153, dans les plasmides pSA2 et pSA4. Ce promoteur ne peut donc être efficace pour la production de l'arylsulfatase à partir de ces plasmides.

Chez E. coli, l'activité arylsulfatase semble aussi associée aux cellules, comme l'indiquent les dosages effectués à partir des surnageants. L'activité résiduelle constatée dans certains surnageants peut être due à la lyse cellulaire lorsque les cellules sont depuis trop longtemps en phase stationnaire. Il est étonnant cependant de constater la présence de l'activité en quantité de près de 10 fois supérieure dans le surnageant de culture du sous-clone SX3 par rapport aux autres surnageants (l'activité restant malgré tout majoritairement associée aux cellules de ce sous-clone).

Les cartes montrent un segment ayant une carte physique identique dans les quatre plasmides (entre les deux lignes en pointillés). Celà indique que le gène de l'arylsulfatase doit se trouver sur ce segment et est en un seul exemplaire dans A. carrageenovora (ce que confirment les hybridations). Un sous-clonage de trois fragments a été entrepris dans le pBluescript II KS-. Le sous-clone SXS3 (portant le fragment SalI-XbaI du pSA4) produit trois fois plus d'arylsulfatase que A. carrageenovora. Ce résultat confirme que le gène se situe à l'intérieur de cet insert et qu'il ne peut se localiser au-delà de la ligne en pointillés de gauche sur la carte, puisque cette zone n'existe pas dans le pSA1. Ce phagemide est connu pour être produit en grand nombre dans la cellule, ce qui expliquerait la sur-expression de l'arylsulfatase par cette souche. L'insert dans la souche SXS3 est dans la même orientation que le promoteur LacZ présent dans le phagemide. Cette forte expression peut donc aussi être due à un niveau plus élevé de la transcription à partir de ce promoteur. Cependant, des essais d'induction avec de l'IPTG ajouté au milieu de culture ne confirment pas cette hypothèse, puisqu'aucune augmentation de l'expression de l'arylsulfatase n'est observée chez la souche SXS3. Un autre argument en faveur de l'expression de l'arylsulfatase à partir de son propre promoteur dans les cellules de SXS3 est l'absence totale d'activité dans la souche SN1, qui, bien qu'ayant la quasi-totalité du gène atsA, est dépourvue du promoteur supposé, indiqué dans la séquence (Fig. II-11) puisqu'il se situerait en amont du premier site NdeI. Enfin, l'indication la plus importante en faveur d'une expression sous le contrôle du promoteur de l'arylsulfatase, est l'orientation de l'insert dans la souche SX3. Cette insert, présentant une carte physique similaire à celui de SXS3, est en orientation opposée au promoteur de la β-galactosidase (Fig. II-8) ; il ne peut donc pas promouvoir la transcription du gène de l'arylsulfatase.

Comme chez A carrageenovora et chez les souches SA1 à SA4, la présence du substrat dans le milieu de culture n'augmente pas la production d'arylsulfatase à partir de SXS3, qui est constitutive. De même, l'arylsulfatase reste associée aux cellules de SXS3, comme l'indique la faible activité du milieu de culture débarrassé des cellules.

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IV-3. Le gène codant pour l'arylsulfatase de A. carrageenovora

La séquence présentée montre deux phases ouvertes. La première est incomplète puisqu'il y manque le promoteur et le codon d'initiation de la traduction, alors que la seconde possède toutes les caractéristiques d'un gène complet.

La séquence GAG, de par sa localisation (8 pb avant le codon ATG) est un bon candidat pour être le site de fixation du ribosome. Sa séquence est en accord avec la séquence consensus de Shine -Dalgarno de E. coli (Shine & Dalgarno, 1974). A titre d'exemple, la même séquence de Shine-Dalgarno a été trouvée devant le gène trpE de E. coli (Gold et coll., 1981).

En comparant les séquences consensus de promoteurs connus, une séquence pouvant initier la transcription a été identifiée 174 pb en amont de la séquence du codon ATG. Les boites "-35" et "-10 "de ce promoteur supposé ne sont pas identiques aux séquences consensus de E.coli (Rosenberg & Court, 1979), mais de telles divergences ont déjà été observées dans les promoteurs d'autres bactéries Gram négatif (Hawley & Clure, 1983 ; Raibaude & Schwartz, 1984 ; Harley & Reynolds, 1987). D'autres séquences en amont du codon ATG peuvent prétendre au rôle de promoteur, mais l'espacement entre les boites "-35" et "-10" excède les 20 pb recommandées pour une fixation efficace de l'ARN polymérase (Rosenberg & Court, 1979).

Après le codon stop, une boucle d'arrêt de transcription peut se former. L'énergie de formation semble suffisante pour que cette boucle puisse être stable et remplir son rôle dans la transcription. De plus, on observe directement après cette boucle une suite de 6 résidus thymine, caractéristique d'un arrêt de transcription Rho-indépendant (Fig. II-14).

La protéine déduite de la séquence de cette phase ouverte, a une masse moléculaire théorique de 35,8 kDa. On trouve, à son extrémité amino-terminale, un peptide signal de 25 résidus. Celui-ci une fois excisé, on obtient une protéine avec une masse moléculaire théorique de 33,9 kDa. Ces masses moléculaires sont en accord avec celles mesurées sur gel SDS pour l'arylsulfatase de A. carrageenovora et l'arylsulfatase recombinante.

Le fait d'avoir cette phase ouverte dans sa totalité, avec ses séquences régulatrices en amont et en aval, localisée sur les inserts sous-clonés dans les souches SXS3 et SX3 et codant pour une protéine ayant une masse moléculaire similaire à celle observée sur gel SDS, indique qu'il s'agit du gène de l'arylsulfatase de A . carrageenovora, appelé atsA. La présence d'un peptide-signal et l'observation que l'activité arylsulfatase est toujours associée aux cellules suggèrent une localisation de l'enzyme dans l'espace périplasmique à la fois chez A. carrageenovora et chez E. coli,

comme c'est le cas pour l'arylsulfatase de K. aerogenes et Pseudomonas C12B (Murooka et coll., 1977b ; Fitzgerald & George, 1977).

Un second cadre de lecture ouvert de 1069 pb, présent en amont du gène atsA pose le problème de l'organisation génomique dans cette région. La séquence codante s'arrête 2 pb avant la séquence de Shine-Dalgarno du gène atsA. Cette observation laisse à penser que nous sommes en présence d'un opéron. De plus, cette supposition est à mettre en parallèle avec l'existence d'une organisation en opéron rapportée pour le gène de l'arylsulfatase de K. aerogenes (Murooka et coll., 1990). Par analogie aux résultats obtenus chez K. aerogenes, cette phase ouverte a été appelée atsB. Toutefois, si cet opéron existe vraiment, alors le promoteur du gène atsA doit être en amont du premier cadre ouvert, et la description du promoteur décrit plus haut devient caduque. Cependant la séquence en amont de la jonction BamHI/Sau3AI n'est présente ni dans le plasmide pSA4 ni dans le pSA3 (qui possède une carte physique différente dans cette région), et n'est pas non plus présente dans les phagemides pSXS3 et pSX3. Il faut donc admettre que l'expression de l'arylsulfatase à partir de ces constructions, ne peut être initiée qu'à partir d'un promoteur situé en aval de la jonction BamHI/Sau3AI, réhabilitant ainsi le promoteur décrit plus haut. Malgré tout, ces considérations n'excluent pas l'existence d'un opéron. On peut imaginer en effet, un système fonctionnant en un opéron dans A. carrageenovora, et dans les souches SA1 et SA2, mais, lorsque les deux gènes atsA et atsB sont découplés, comme c'est le cas dans les souches SA4, SA3, SXS3 et SX3, un promoteur de "secours" en amont du gène atsA, reconnu par l'ARN polymérase de E. coli, permettrait le maintien de l'expression de l'arylsulfatase dans ces souches.