4. Homologies entre la kappa-carraghénase et les autres glycosyle hydrolases

Les hybridations indiquent la présence de séquences homologues chez d'autres bactéries carraghénolytiques. Les bandes d'hybridation mises en évidence suggèrent que ces séquences sont uniques chez ces bactéries, comme cela semble être le cas pour la kappase de A. carrageenovora. Globalement, on peut distinguer, en se basant sur la taille de la bande d'hybridation, trois groupes de souches kappase positives : le groupe 1 composé de A. carrageenovora, le groupe 2 composé des souches 2, 3 et 4 et le groupe 3 composés des souches 5 et 6. La kappa-carraghénase de la souche 5 a été purifiée jusqu'à homogénéité électrophorétique, et elle semble très proche de celle de A. carrageenovora (Greer, 1984). Il est possible que ces groupes correspondent à autant d'espèces différentes. Ceci semble être confirmé par les profils de restriction HindIII, qui montrent des profils identiques pour les souches 2, 3 et 4 d'une part, et

pour les souches 5 et 6 d'autre part, et enfin pour A. carrageenovora. Il semble que les souches 2 à 6 répondent aux critères des genres Pseudomonas ou Alteromonas. L'absence d'hybridation sur l'ADN des souches kappa-carraghénolytiques n° 7 et C. drobachiensis suggère que ces bactéries sont taxinomiquement trop éloignées de A. carrageenovora et que leur gène kappase a divergé de celui de A. carrageenovora de façon plus importante. Plus étonnante est l'absence d'hybridation avec les souches iota-carraghénolytiques n° 8 et A. fortis. Ceci suggère que, au sein du même genre Alteromonas, il n'y ait que très peu d'homologie entre les gènes kappase et iotase. Une activité carraghénolytique à partir d'extraits protéiques de protoplastes de Chondrus crispus ayant été détectée, des hybridations sur l'ADN nucléaire de cette algue ont été effectuées en utilisant la kappase d'A. carrageenovora comme sonde. L'absence d'hybridation montre qu'aucune homologie ne semble exister entre les deux gènes.

Les similitudes de séquences mises en évidence par HCA indiquent que la kappa-carraghénase de A. carrageenovora appartient à la famille 16 des glycosyle hydrolases. Cette famille est composée de 4 lichénases (β-1,3-1,4-glucanases) et d'une laminarinase (β-1,3-glucanase). Le fait que les résidus les plus conservés dans ces enzymes qui peuvent jouer un rôle catalytique, sont également présents dans la kappase, suggère qu'ils peuvent aussi avoir ce rôle dans cette protéine. Récemment, une expérience de mutagenèse dirigée a confirmé que l'acide aminé Glu134 est le site catalytique dans la β-1,3-1,4-glucanase (lichénase) de Bacillus licheniformis (Planas et coll., 1992). Il est vraisemblable que l'acide aminé correspondant dans la kappa-carraghénase, la Glu163, présent dans la région la plus conservée, est catalytique. Une homologie a également été trouvée entre la kappase et l'agarase de S. coelicolor (déviation standard de 4,22 SD). Ce résultat permet de ranger cette agarase, qui n'avait pu être classée auparavant, dans la famille 16 des glycosyles hydrolases. L'agarase a les mêmes régions conservées que la kappase et les autre glucanases, avec les trois mêmes résidus Glu155, Asp157 et Glu160. Cette observation suggère, là encore, un rôle catalytique possible pour la Glu155 dans la β-agarase de S. coelicolor. En revanche, aucune homologie n'a été trouvée par HCA entre la kappase et la β-agarase de Alteromonas atlantica. L'existence d'une homologie entre les deux β-agarases (Belas, 1989) avait pourtant été rapportée, sur la base des profils hydropathiques des séquences et de substitutions chimiques. Aucune homologie n'a également été trouvée entre la β-agarase de A. atlantica et les autres glucanases de la famille 16. Cette β -agarase reste à ce jour non classée. L'étude des comparaisons de séquences illustre bien que des enzymes ayant des spécificités de substrats différentes (glucanase et galactanase), peuvent être classées dans une même famille HCA (Grabnitz et coll., 1991 ; Henrissat, 1991 ; Jespersen et coll., 1991). Cette constatation devrait aboutir à l'établissement d'une nouvelle classification des enzymes, où un nombre, représentant

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la famille HCA, serait mis à la suite du numéro EC (Henrissat, 1991). Comme il vraisemblable que la structure tertiaire des protéines s'est mieux conservée durant l'évolution que la structure primaire, il est probable que les enzymes appartenant à une même famille montrent des structures secondaires et donc tertiaires très similaires. Il en résulte que la spécificité de substrat n'est pas due au repliement global de la protéine, mais à de fins détails dans ce repliement. Il est dommage qu'aucun membre de la famille 16 n'est été étudié en cristallographie aux rayons X. Ceci aurait permis d'établir un modèle de structure tertiaire pour la kappa-carraghénase de A . carrageenovora. Enfin une dernière observation pour laquelle je n'ai aucune explication plausible : il est étonnant de constater que tous les membres de la famille 16 sont des bactéries Gram positives (Bacillus, Fibrobacter, Clostridium et Streptomyces), à l'exception d'A. carrageenovora. Ce paradoxe est poussé à un point tel que, comparée aux deux β-agarases connues (l'une venant d'une bactérie Gram négative et l'autre d'une bactérie Gram positive), la kappase d'A. carrageenovora montre des homologies avec la β-agarase de la bactérie Gram positive et ne montre pas d'homologie avec la β-agarase d'Alteromonas atlantica (Belas, 1989), malgré la parenté taxinomique des deux bactéries.

V. Conclusion

Alteromonas carrageenovora produit une enzyme dégradant le kappa-carraghénane appelée kappa-carraghénase ou kappase. Cette enzyme est synthétisée sous la forme d'un précurseur de 44 kDa et excrétée dans le milieu extérieur grâce à un processus qui ferait intervenir la voie classique du peptide signal et une coupure protéolytique de côté C-terminal de la chaîne polypeptidique, un produit fini de 35 kDa. L'analyse des hybridations indique que la kappase d'A. carrageenovora est apparentée à des gènes d'autres bactéries carraghénolytiques. Les comparaisons de séquences mettent également en évidence des homologies entre la kappase d'A. carrageenovora et les glucanases classées par HCA dans la famille 16. La comparaison par HCA entre les séquences de la kappase et celle de la β-agarase de S. coelicolor a permis le classement de cette dernière dans cette même famille, donnant un exemple supplémentaire de protéines présentant un repliement dans l'espace similaire, avec une spécificité de substrat différente. Par analogie avec l'un des deux acides aminés catalytiques connus chez B. licheniformis, ce classement a aussi permis d'identifier un des deux acides aminés catalytiques de la kappase (Glu163) et de la β -agarase de S. coelicolor (Glu155). En revanche, il semble qu'il n'y ait aucune homologie avec la β-agarase ni avec la iota-carraghénase de bactéries appartenant pourtant au même genre, A. atlantica et A. fortis respectivement. Enfin, il existe d'autres gènes kappase sans homologie avec celui de A. carrageenovora dans des bactéries comme C. drobachiensis. Il apparaît qu'un deuxième gène, formant avec celui de la kappase un opéron, pourrait participer au métabolisme du kappa-carraghénane. Cet opéron pourrait être régulé (positivement?) par une protéine codée par un troisième gène situé en amont. Cette protéine régulatrice présente un motif de fixation à l'ADN et est homologue avec les régulateurs de la transcription appartenant à la famille AraC. Dans l'avenir, il serait intéressant de compléter la séquence du gène cgkB, d'élucider son rôle, et de vérifier notamment s'il ne s'agit pas de la glycosulfatase purifiée par McLean et Williamson (1979b), qui désulfate le kappa-néocarrabiose-sulfate produit terminal de l'action de la kappa-carraghénase. Enfin, il serait intéressant de pouvoir cristallographier la kappa-carraghénase afin d'établir sa structure tertiaire, ce qui permettrait d'établir un modèle tridimensionnel pour l'ensemble de la famille 16 des glycosyle hydrolases.

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Chapitre IV :

La

iota-carraghénase

de

Cytophaga