Cytophaga drobachiensis
III- 3. Localisation de l'activité iotase sur l'insert PvuII
Le fragment PvuII commun à tous les plasmides iotase positifs se trouvant être le seul à conférer l'activité iotase après sous-clonage, j'ai entrepris d'évaluer la taille minimum de ce fragment pouvant conserver l'activité iotase. Une banque ExoIII a été préparée à partir des phagemides pICP07 et pICP16. Le même couple d'enzymes XhoI/SalI a été utilisé sur les deux phagemides afin d'attaquer l'insert par les deux extrémités (voir Fig. IV-4).
A partir de la banque de pICP07, 5 clones positifs sur Zd-iota ont été identifiés. Le premier au temps 4 min (temps de dégradation de l'exonucléase III) montre un insert réduit à 1800 pb. Les 4 autres, tous relatifs au temps 12 min, sont identiques avec un insert de 1400 pb. Ces clones ont été appelés ICP074 et ICP0712 respectivement. Pour élucider la séquence nucléotidique du gène iotase, j'ai dû rechercher un clone portant un plus petit insert. Ceci fut fait en identifiant un clone portant un insert de 900 pb au temps 38 min. Ce clone appelé ICP0738 est iotase négatif.
A partir de la banque issue de pICP16, aucun clone avec un insert dégradé ne montre une activité iotase. Afin de combler un "trou" lors des réactions de séquence, j'ai dû chercher un clone qui ne soit que très peu dégradé. Un clone au temps 8 min, portant un insert de 2800 pb a été retenu et appelé ICP168. Egalement au temps 8 min, j'ai trouvé deux clones iotase positifs. Après analyse de l'ADN phagemidique par coupures de restriction, il a été mis en évidence qu'il s'agit de clones portant l'insert original de 3300 pb non dégradé.
Un résumé des différents sous-clones et clones "ExoIII" obtenus, montrant les cartes physiques alignées et l'expression de l'activité iota-carraghénase, est illustré en figure IV-5.
III-4. Séquence nucléotidique du gène codant pour la
iota-carraghénase de Cytophaga drobachiensis
La séquence nucléotidique de l'insert du phagemide pICP0712 a été entièrement déterminée à l'aide des différents sous-clones et clones "ExoIII" obtenus (et avec quelques amorces de synthèse). La stratégie mise en oeuvre pour élucider cette séquence est montrée (Fig. IV-6). La séquence nucléotidique de l'insert du pICP0712
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est composée de 1837 pb. La traduction des six cadres de lecture n'a révélé qu'une seule phase ouverte appelée cgiA.
Le codon d'initiation potentiel se situe 333 pb au-delà de l'extrémité 5'P de la séquence (Fig. IV-7). La séquence située en amont du codon initiateur n'est pas codante. Aucune séquence consensus avec la séquence de Shine-Dalgarno n'a été trouvée dans le voisinage immédiat de ce codon ATG. Cependant, des séquences de type Epsilon (TTAACCTTAAATT) et Oméga (ACAATT) (Firpo & Dahlberg, 1990) sont présentes de part et d'autre du codon ATG. Sur la base des séquences consensus des promoteurs connus de E. coli, il a été possible d'identifier dans cette région une séquence TATAAT en tous points conforme à la séquence consensus de la boite de Pribnow (Rosenberg & Court, 1979). Une hypothétique séquence "-35", située à 17 pb en amont de la séquence "-10", serait moins conservée (TgGAag). Une séquence répétée inversée, pouvant former une structure secondaire en boucle avec une variation d'énergie libre de formation de -9,2 kcal/mole (Tinoco et coll., 1973) est également présente dans cette région (Fig. IV-7 et 8a). Cette boucle non suivie de résidus T pourrait jouer le rôle d'un terminateur Rho-dépendant d'un gène situé en amont de la séquence présentée en figure IV-7.
Le codon stop du gène cgiA, TGA, est situé au nucléotide 1806, 1473 nucléotides après le codon d'initiation. Afin d'analyser la présence éventuelle de séquences régulatrices après le gène cgiA, la séquence allant au-delà du site PvuII a été déterminée sur 160 nucléotides en utilisant le plasmide pIC1. Une seconde phase ouverte appelée cgiB est présente 57 nucléotides après le codon stop du gène cgiA. Entre les deux gènes on constate la présence d'une répétition inversée. L'énergie libre de formation d'une éventuelle structure secondaire en boucle serait, selon les valeurs données par Tinoco et coll. (1973), de -26,2 kcal/mole (Fig. IV-8b). Là encore, aucune séquence présentant des homologies avec celle de Shine-Dalgarno n'est observée à proximité du codon ATG potentiellement initiateur de cette seconde phase ouverte. En revanche on constate la présence d'une autre séquence Oméga (Firpo & Dahlberg, 1990) située juste après le codon stop du gène cgiA.
Le GC% de la séquence totale (1997 pb) est de 40,96%. Le coefficient de Chargaff de l'ADN total a été établi par la méthode d'Ulitzur (1972) (44%), et par la méthode de Karlovsky & De Cock (1991) (48,8%). Ces pourcentages sont compris dans l'intervalle admis pour le genre Cytophaga (Reichenbach, 1989).
La séquence protéique déduite de la séquence de cgiA est composée de 391 acides aminés, ce qui correspond à une masse moléculaire théorique de 53,4 kDa. Le profil hydropathique de cette protéine montre une région hydrophobe couvrant les 24 premiers acides aminés. La présence d'un acide aminé chargé positivement (Lys) suivit d'un corps hydrophobe, puis d'un segment polaire de six acides aminés suggère,
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comme dans le cas de l'arylsulfatase et de la kappa-carraghénase de Alteromonas carrageenovora, que ce domaine pourrait être un peptide signal (Fig. IV-9a et b) (Von Heijne, 1985). Selon les analyses effectuées par Von Heijne, la signal-peptidase couperait entre la valine (Val24) et la thréonine (Thr25) (Dalbey & Von Heijne, 1992). La protéine mature dénuée de son peptide signal aurait une masse moléculaire théorique de 50,7 kDa. L'identité du gène cgiA a été confirmée par la détermination des acides aminés du côté NH2 de la protéine partiellement purifiée. La séquence obtenue est conforme à celle déduite de la séquence nucléotidique. Le premier acide aminé se situe à 14 résidus de l'extrémité NH2 générée par la signal-peptidase. La présence des deux prolines qui suivent les acides aminés déterminés par microséquençage ayant perturbé légèrement l'ordre d'apparition des résidus N-terminaux, la séquence d'un oligopeptide interne, purifié par HPLC après coupure à la trypsine, a été établie (Fig. IV-7). La séquence NH2ATYKCOOH obtenue, se situe vers l'extrémité C-terminal de la iotase (résidus 396 à 399).
La séquence protéique déduite de cgiB a été établie pour les 44 premiers acides aminés. Le profil hydropathique montre un début de protéine franchement hydrophobe sans l'organisation d'un peptide signal (Fig. IV-10).