5. Criblage des banques génomiques

a) Evaluation du bruit de fond

Afin d'évaluer le bruit de fond dans les banques obtenues (nombre de clones ayant été transformés par un plasmide sans insert), les clones ont été repiqués au moyen d'un velours sur milieu LBT.

Les clones de chaque banque ont été individuellement ensemencés dans des plaques de microtitration (96 puits) contenant 300 µl de LBA. Après croissance pendant 18 heures à 37°C, chaque puits a reçu 200 µl de glycérol 80%. Les banques sont conservées à -20°C.

b) Détection de l'activité sulfatase

A partir des microplaques stocks, chaque clone des banques issues de A . carrageenovora et de C. drobachiensis a été ensemencé dans des microplaques contenant 200 µl de LBA additionné de 50 µg/ml de méthylumbelliféryl-sulfate (MUF-S). Après croissance à 37°C pendant 24 heures, la recherche des clones positifs a été effectuée en exposant les microplaques sous lumière ultraviolette (360 nm). L'apparition d'un puits fluorescent indique la présence d'un clone sulfatase positif, capable de dégrader le MUF-S en méthylumbellférone (MUF), fluorescente à 360 nm.

c) Détection des activités galactanases

Les banques ont été repiquées sur des boites de Zd solidifiées avec le galactane substrat de l'activité recherchée. Les boites ont été mises à l'étuve à 30°C pendant 24 heures, puis stockées à température ambiante. Le lambda-carraghénane ne formant pas de gels, les clones ont été repiqués en plaques de microtitration, dans du milieu Zd additionné de lambda-carraghénane, mis à 30°C pendant 24 heures, puis stockés à température ambiante durant 1 mois avant d'effectuer le crible.

1) Kappa-carraghénase de Alteromonas carrageenovora

Deux tests ont été employés pour détecter l'activité kappase des clones re-combinants de la banque issue de A. carrageenovora.

1- Coloration des boites au rouge Congo (Teather & Wood, 1982) : cette coloration est très utilisée pour la détection des activités glucanase et xylanase. Les colonies sur boite Zd Kappa sont recouvertes de rouge Congo 0,1% et laissées 15 min à température ambiante. Après la coloration, le colorant est éliminé et remplacé par une solution de NaCl 1M durant 15 min. Enfin, le chlorure de sodium est remplacé par de l'acide chlorhydrique 1 N. La couleur bleue résultant de la chute du pH facilite la lecture des boites. Les boites apparaissent avec un fond bleu contrastant avec les zones d'hydrolyses, qui elles apparaissent bleues foncé, violettes ou noires selon l'importance de l'activité.

2- Observation visuelle des boites Zd kappa : la gélose doit présenter une dépression plus ou moins importante autour des clones positifs.

2) Lambda-carraghénase de Alteromonas carrageenovora

Le test employé pour détecter l'activité lambda-carraghénase est basé sur la co-précipitation des protéines et des polyosides en milieu acide (Kitamikado et coll., 1990) en utilisant une solution d'albumine sérique de bovin (BSA). Après culture sur le milieu Zd contenant du lambda-carraghénane purifié, 200 µl de culture sont mélangés à 2 ml d'une solution de BSA (3,26 g/l d'acétate de sodium, 4,56 ml/l d'acide acétique, 1 g/l de BSA fraction V. La solution est ajustée à un pH de 3,7 avec HCl). Comparée à un témoin sans activité lambdase, la non apparition d'un floculât (complexe polyoside-BSA) indique la présence d'une activité lambdase.

3) Kappa-carraghénase et carraghénase de Cytophaga drobachiensis, et iota-carraghénase de Alteromonas fortis

La kappase et la iotase de C. drobachiensis, ainsi que la iotase de A. fortis ont été criblées par observation visuelle des boites. L'apparition d'une dépression dans la gélose révèle un clone positif pour l'activité considérée.

4) Agarase de Cytophaga drobachiensis

L'activité agarase de C. drobachiensis a été criblée à l'aide de deux observations. 1- Coloration des boites au réactif de Gran (Hodgson & Chater, 1981) : les colonies sur boite Zd agar, sont immergées dans la solution de Gran (120 mM iodure de potassium et 50 mM iode). Une zone jaune claire apparaît autour des clones positifs, sur un fond brun.

2- Observation visuelle des boites Zd agar : la gélose doit présenter une dé-pression plus ou moins importante autour des clones positifs.

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Les spectres de la figure I-5 sont ceux de C. drobachiensis et A. carrageenovora avant et après gradient de chlorure de cesium. Ces spectres indiquent que, dans le cas de A. carrageenovora, l'ADN est peu contaminé car les spectres, avant et après gradient pour cet ADN, restent inchangés. Dans le cas de C. drobachiensis en revanche, le gradient sur chlorure de césium a permis d'éliminer des molécules contaminantes qui absorbaient à 240 nm (probablement des polyosides) avant gradient. Après gradient de CsCl, les spectres indiquent, pour les rapports de longueur d'onde 260/280 et 240/280 nm, les valeurs suivantes :

A. carrageenovora A. fortis C. drobachiensis

260/280 nm 2,09 1,85 1,95

240/280 nm 1,25 1,05 0,95

Ces valeurs indiquent que les ADN sont débarrassés de protéines et des polyosides.

Les quantités d'acides nucléiques totaux déterminées par l'absorbance à 260 nm, obtenus pour A. carrageenovora (6 g de cellules), A. fortis (5 g de cellules) et C. drobachiensis (11 g de cellules) sont de 14,3 mg , 15 mg, et 17 mg respectivement. Les gradients ont été effectués avec des quantités aliquotes des préparations d'acides nucléiques.

Afin de connaître l'état des méthylations des séquences GATC, les ADN ont été coupés par différentes enzymes de restriction reconnaissant cette séquence. La séquence GATC est la cible chez E. coli de la méthylase codée par le gène dam, qui méthyle l'adénine de cette séquence, en position 6 (Razin & Friedman, 1982). La 6-méthyl-adénine résultant de cette modification, inhibe l'enzyme NdeII. Au contraire, cette méthylation est nécessaire à la reconnaissance de cette séquence par l'enzyme DpnI. La présence de la 6-méthyl-adénine est sans effet sur l'action de Sau3AI, mais cette enzyme est inhibée par la méthylation de la cytosine.

La figure I-6 illustre les génomes de A. carrageenovora et C. drobachiensis coupés par ces trois enzymes. On constate que l'ADN de A. carrageenovora n'est pas coupé par NdeII et est logiquement coupé par Sau3AI et DpnI. Ces résultats indiquent que l'ADN nucléoïdique de cette bactérie a ses séquences GATC méthylées sur l'adénine. Le même résultat a également été obtenu avec l'ADN de A. fortis. Plusieurs études traitant du rôle de la méthylase Dam ont rapporté l'absence de cette modification dans la famille des Rhyzobiaceae, genres Agrobacterium et Rhyzobium,

et dans la famille des Pseudomonadaceae, genres Alcaligenes, Pseudomonas et Xanthomonas (Broocks et coll., 1983). Le genre Alteromonas en tous points conforme à la définition de la famille des Pseudomonadaceae, excepté le GC% (Baumann et coll., 1972), a cependant été rapporté comme ayant un phénotype Dam+ tout comme les membres des familles des Parvobacteriaceae, des V i b r i o n a c e a e et des Enterobacteriaceae (Barbeyron et coll., 1984), des eubacteries Gram positif (Dreiseikelmann & Wackernagel, 1981) et des mycoplasmes (Dybvig et coll., 1982). Les résultats observés chez A. carrageenovora et A. fortis sont donc en accord avec ceux préalablement rapportés. La présence de la 6-méthyl-adénine dans le genre Alteromonas, semble une caractéristique intéressante pour le différencier du genre Pseudomonas.

Le profil NdeII de l'ADN de Cytophaga drobachiensis indique un phénotype Dam négatif. Il n'est donc pas surprenant de voir l'enzyme DpnI sans effet sur cet ADN. Plus étonnant est le comportement de l'enzyme Sau3AI, qui ne coupe pas l'ADN, démontrant ainsi la présence d'une méthylase dans cette eubactérie, ayant pour cible la cytosine dans la séquence GATC. Cette méthylase n'est pas homologue à celle codée par le gène dcm dans E. coli puisque la séquence de reconnaissance de cette dernière est différente. Il a préalablement été rapporté l'existence d'autres méthylations, notamment chez les eubactéries présentant un phénotype Dam- ; les mycoplasmes, par exemple, ont leurs séquences GATC méthylées sur la cytosine (Dybvig et coll., 1982).

Ces observations auront permis de déduire quelles sont les enzymes les plus appropriées pour réaliser les coupures partielles chez ces bactéries : l'enzyme de restriction Sau3AI a été utilisée pour obtenir les fragments d'ADN à partir des deux espèces d'Alteromonas, et l'enzyme NdeII pour constituer la banque à partir de C. drobachiensis.

La figure I-7a montre deux exemples de cinétique enzymatique obtenus à différentes concentrations d'enzyme avec les ADN de A. carrageenovora et C. drobachiensis. Les conditions de coupure ont été optimalisées pour générer un maximum de fragments compris entre 4 kb et 10 kb. On observe, qu'à concentration égale d'enzyme, des fragments plus petits (0,5 kb à 1,5 kb en 20 min à 37°C) apparaissent à partir de l'ADN de A. carrageenovora par comparaison avec celui de C. drobachiensis (2 kb à plus de 10 kb dans les mêmes conditions). Cette observation peut s'expliquer par la répartition différente des sites GATC.

Les conditions de coupure définitives ont été établies à 0,15 U de Sau3AI et 0,3 U de NdeI par microgramme d'ADN de A. carrageenovora et de C. drobachiensis respectivement. Pour Alteromonas fortis, les conditions employées ont été celles de A. carrageenovora. 200 µg de chacun des ADN ont été coupés par fractions de 25 µg à

37°C pendant 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 min (pour le temps 3 min, 50 µg ont été coupés). La figure I-7b montre les profils obtenus dans ces conditions pour A. carrageenovora et C. drobachiensis.

Les ADN ainsi coupés ont été déposés sur un gradient de saccharose. La figure I-8 montre les différentes fractions des gradients pour A. carrageenovora et C . drobachiensis. Des profils identiques ont été obtenus pour Alteromonas fortis. Les fractions contenant une majorité de fragments d'une taille comprise entre 4 et 10 kb étaient réunies et dialysées.