Intérêt de la modulation pharmacologique des voies PI3K / Akt / mTOR et MAPK / ERK pour la sensibilisation des cancers de l'ovaire aux molécules BH3-mimétiques

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Intérêt de la modulation pharmacologique des voies

PI3K / Akt / mTOR et MAPK / ERK pour la

sensibilisation des cancers de l’ovaire aux molécules

BH3-mimétiques

Cecile Petigny-Lechartier

To cite this version:

Cecile Petigny-Lechartier. Intérêt de la modulation pharmacologique des voies PI3K / Akt / mTOR et MAPK / ERK pour la sensibilisation des cancers de l’ovaire aux molécules BH3-mimétiques. In-teractions cellulaires [q-bio.CB]. Normandie Université, 2017. Français. �NNT : 2017NORMC402�. �tel-01524513�

Intérêt de la modulation

et MAPK/ERK pour la se

aux m

Pour o

Pr

Céci

Thèse dirigée par Laurent

Unité de Recherche Interdis Axe 2 : Biologie et Thér (BioTICLA)

Thès

Mme Bettina COUDERC PU Mr David TUSLANE DR1 Mme Florence JOLY PU-PH Mme Johanne LEROY-DUDAL MCU Mme Marie VILLEDIEU MCU Mr Laurent POULAIN DR C

ion pharmacologique des voies P

r la sensibilisation des cancer

x molécules BH3-mimétiques

r obtenir le diplôme de doctorat

pects moléculaires et cellulaires de la bio

au sein de l’Université de Caen Normandi

Présentée et soutenue par

écile PETIGNY-LECHARTIER

nt POULAIN,laboratoire Inserm U1086 « A isciplinaire pour la Prévention et le Traitem hérapies Innovantes des Cancers Local

èse soutenue publiquement le 27 avril 2017 devant le jury composé de

PU Université de Toulouse III R1 CNRS, INSERM UMR8161, Lille

PU-PH INSERM U1086 et CLCC F. Baclesse, Caen CU ERRMECe EA 1391, Cergy-Pontoise

CU INSERM U1086 « ANTICIPE » - BioTICLA, Caen R CLCC, INSERM U1086 « ANTICIPE » - BioTICLA, Cae

ies PI3K/Akt/mTOR

cers de l’ovaire

biologie

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tement des Cancers alement Agressifs Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur aen Directeur de thèse











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1



Je ne pouvais pas partir sans une dernière recette…

Ingrédients



Eléments centraux du plat :

- _{1 premier contact de choix}

- _{1 ou 2 directeur(s) de thèse (selon les goûts)} - _{1 maître d’enseignement}

- _{Des « mamans » de labo} - _{D’autres sources de savoir}

- _{Les petits nouveaux et les suivants} - _{Des supers collègues de bureau}

Le liant : - _{Les amis} - _{La famille} La touche finale : Le jury

Préparation



1. Commencer par rencontrer un premier contact de choix pour découvrir le laboratoire et avoir la chance de postuler pour un stage de M1. Pour ma part ce fut Pascal que je remercie pour m’avoir aidé à transmettre ma candidature.

2. Etre encadré par un directeur voire deux. De mon côté, je peux en remercier deux : Marie et Laurent. Deux chefs qui m’ont acceptée, qui se sont battus pour mon financement de thèse, qui m’ont accompagnée et fait confiance malgré tout. Pour tout ce qu’ils m’ont apporté aussi bien au niveau professionnel qu’humain, je les remercie infiniment.

3. Découvrir l’enseignement. Je remercie Christophe pour son expérience et son dynamisme qui m’ont conforté dans mon envie d’enseigner.

4. Découvrir le laboratoire et les techniques avec les « mamans » du labo. Pour cela, merci à Florence, Marie-Hélène et Edwige pour leur aide et leur soutien (mais aussi les rigolades), aussi bien au niveau professionnel qu’humain, tout au long de cette thèse.

Remerciements

5. Partager avec d’autres leurs connaissances et leur expertise. Merci à Emilie, Monique, Bernard, Mathieu, Mélanie et Maryline qui m’ont apporté la vision d’autres horizons et connaissances et avec qui j’ai eu l’occasion de partager de très bons moments. Je n’oublie pas Jérémie qui malgré la séparation d’un étage aura également été présent pour les rigolades mais aussi pour m’aider et me conseiller lorsque j’en avais besoin. Et merci Laëtitia pour le coup de main final.

6. Travailler, partager et transmettre aux suivants. J’ai d’abord été la petite nouvelle parmi d’autres doctorants qui m’ont beaucoup apporté et appris tout au long de mon apprentissage de ce qu’est d’être une doctorante. Merci à Julie, Charlotte, Abdel et Nicolas.

Même si je n’ai pas eu l’occasion de beaucoup voir certains, je garde de très bons moments passés ici avec les étudiants et je souhaite la bienvenue aux petits nouveaux. 7. Partager son bureau. Merci à mes deux supers collègues de bureau Siham et

Marie-Laure avec qui j’ai pu partager plus que de la science. Vous m’avez beaucoup apporté et je tiens à vous en remercier.

8. Se créer un environnement idéal. Merci à tous mes amis qui m’ont soutenu tout au long de cette thèse et qui m’ont apporté leur aide lorsque j’en avais besoin. Alors merci à vous, Stéphanie, Mathilde, Jérôme, Suzannah, la famille Lesage, toute l’équipe de dressage et j’en passe…

9. S’entourer de ses proches. Merci à toute ma famille, qu’elle soit en France ou en Pologne pour leur soutien moral sans faille. Je remercie infiniement ma mère Elzbieta Witek, mon père Gilbert Pétigny et mes grand-parents Annick Auquet, Irena Witek et Jozef Witek qui ont toujours été là pour moi malgré la distance et parfois même la barrière de la langue. Je remercie également ma tante et mon oncle, Urszula et Zbigniew Jurgiewicz, ainsi que mes cousins Sylwia, Konrad et Bartosz Jurgiewicz de qui je suis très proche malgré les kilomètres qui nous séparent. Je remercie également à Marylène, Patrick et Aubérie que je considère comme des parents et une sœur d’adoption. Et bien sûr merci à ma belle-famille et à mon mari Julien qui m’a épaulée et supportée tout au long de mes études.

10. Mettre la cerise sur le gâteau. Pour finir je tiens à remercier tous les membres du jury qui m’ont fait l’honneur d’accepter de venir à la présentation de mes travaux de thèse. Merci à Bettina Couderc, David Tuslane, Florence Joly et Johanne Leroy-Dudal.

Table

desmatières

Abréviations ... 15

Introduction générale ... 21

Etude bibliographique ... 25

Première partie : Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique ... 27

Chapitre I : Le cancer de l’ovaire : généralités ... 27

I. Quelques chiffres ... 27

II. Description d’une maladie complexe ... 28

II.1 Principaux facteurs de risque ... 28

II.2 Classification des cancers de l’ovaire ... 28

II.3 Origines envisagées du cancer de l’ovaire ... 31

III. Altérations moléculaires des cancers de l’ovaire ... 34

Chapitre II : Prise en charge thérapeutique des cancers de l’ovaire ... 37

I. Diagnostic ... 37

II. Traitement standard ... 38

II.1 La chirurgie ... 38

II.2 La chimiothérapie de première ligne ... 39

II.3 Thérapie ciblée : intérêt des anti-angiogéniques ... 41

III. Récidives, chimiorésistance et traitements associés ... 42

III.1 Récidives ... 42

III.2 Chimiorésistance ... 42

III.3 Traitement des rechutes ... 45

IV. Autres stratégies et essais thérapeutiques récents ... 46

IV.1 Les anti-angiogéniques ... 47

IV.2 Inhibiteurs de PARP ... 48

IV.4 Essai MONAVI ... 51

Deuxième partie : Contrôle de l’apoptose par la famille Bcl-2 : une opportunité thérapeutique dans les cancers ... 53

Chapitre I : La mort cellulaire par apoptose et son contrôle par les protéines de la famille Bcl-2 ... 53

I. Apoptose : son rôle physiologique ... 55

II. Signaux inducteurs de l’apoptose ... 56

III. Caractéristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose ... 56

IV. Les différentes voies d’induction de l’apoptose ... 57

IV.1 La voie des récepteurs de mort, dite « voie extrinsèque » ... 59

IV.2 La voie du réticulum endoplasmique (RE) ... 61

IV.3 Focus sur la voie mitochondriale : la « voie intrinsèque » ... 61

V. Les membres de la famille Bcl-2 et leurs interactions ... 63

V.1 Les pro-apoptotiques BH3-only ... 66

V.2 Les pro-apoptotiques multidomaines ... 67

V.3 Les anti-apoptotiques ... 68

Chapitre II : Les protéines de la famille Bcl-2 comme cibles thérapeutiques dans les cancers de l’ovaire ... 71

I. Bcl-xL et Mcl-1, deux cibles pertinentes dans les cancers de l’ovaire ... 71

I.1 Altérations des voies de l’apoptose dans les cancers ... 72

I.2 Bcl-xL et Mcl-1 sont fréquemment surexprimées dans les cancers ... 72

I.3 Bcl-xL et Mcl-1 : un verrou anti-apoptotique dans les cancers de l’ovaire ... 74

I.4 Effets de la modulation de Bcl-xL et Mcl-1 dans les cancers de l’ovaire ... 74

II. Bcl-xL et Mcl-1 comme cibles thérapeutiques des cancers de l’ovaire : quels outils ? 76 II.1 Inhibition de l’expression des anti-apoptotiques par transfert de nucléotides ... 76 II.2 Inhibition de l’activité des anti-apoptotiques par les molécules BH3-mimétiques 77

Troisième partie : Régulation des protéines de la famille Bcl-2 par les voies de signalisation

PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK ... 82

Chapitre I : La voie PI3K/Akt/mTOR, son lien avec les protéines de la famille Bcl-2 et ses altérations dans les cancers ... 82

I. La voie PI3K/Akt/mTOR : une voie de survie et de prolifération majeure pour la cellule ... 82

I.1 Les différents acteurs de la voie PI3K/Akt/mTOR ... 83

I.2 Mode d’activation et rôle de la voie PI3K/Akt/mTOR ... 88

I.3 Boucles de rétrocontrôle ... 90

II. Implication de la voie PI3K/Akt/mTOR dans la régulation de la protéine Mcl-1 et de ses partenaires BH3-only Bim, Puma et Noxa ... 92

II.1 Régulation de Mcl-1 par la voie PI3K/Akt/mTOR ... 93

II.2 Régulation des partenaires BH3-only de Mcl-1 par la voie PI3K/Akt/mTOR ... 94

III. Altérations de la voie PI3K/Akt/mTOR dans les cancers ... 95

III.1 Altérations en amont de la voie PI3K/Akt/mTOR ... 95

III.2 Altérations de la PI3K ... 96

III.3 Altérations de PTEN ... 98

III.4 Altérations d’Akt ... 99

III.5 Autres altérations ... 100

Chapitre II : La voie MAPK/ERK, son lien avec les protéines de la famille Bcl-2 et ses altérations dans les cancers ... 100

I. La voie MAPK/ERK : une voie de survie et de prolifération majeure pour la cellule 100 I.1 Les différents acteurs de la voie MAPK/ERK ... 101

I.2 Mode d’activation de la voie MAPK/ERK ... 103

I.3 Boucles de rétrocontrôle ... 105

II. Implication de la voie MAPK/ERK dans la régulation de la protéine Mcl-1 et de ses partenaires BH3-only Bim, Puma et Noxa ... 106

II.2 Régulation des partenaires pro-apoptototiques BH3-only de Mcl-1 par la voie

MAPK/ERK ... 108

III. Altérations de la voie MAPK/ERK dans les cancers ... 111

III.1 Altérations de Ras ... 111

III.2 Altérations de Raf ... 112

III.3 Surexpression de MAP3K8 ... 112

III.4 Altérations de MEK et de ERK ... 113

Chapitre III : Interconnexions et mécanismes de compensation entre les voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK ... 113

I. Régulation de la voie MAPK/ERK par la voie PI3K/Akt/mTOR ... 114

II. Régulation de la voie PI3K/Akt/mTOR par la voie MAPK/ERK ... 115

III. Convergence entre les deux voies ... 117

Quatrième partie : Intérêt des inhibiteurs de la voie PI3K/Akt/mTOR et de la voie MAPK/ERK pour moduler l’expression de Mcl-1 et de ses partenaires BH3-only et sensibiliser à l’ABT-737 ... 119

Chapitre I : Les différents inhibiteurs des voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK ... 119

I. Molécules inhibitrices de la voie PI3K/Akt/mTOR ... 119

I.1 Inhibiteurs de PI3K ... 120

I.2 Inhibiteurs d’Akt ... 125

I.3 Inhibiteurs de mTOR ... 129

I.4 Doubles-inhibiteurs PI3K/mTOR ... 134

II. Molécules inhibitrices de la voie MAPK/ERK ... 138

II.1 Inhibiteurs de Ras ... 138

II.2 Inhibiteurs de Raf ... 140

II.3 Inhibiteurs de MEK ... 145

II.4 Inhibiteurs de ERK ... 148

Chapitre II : Intérêt de l’inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR ou de la voie MAPK/ERK pour réguler Mcl-1 et ses partenaires et sensibiliser à l’ABT-737 ... 149

I. Impact de l’inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR par le BEZ235, l’AZD8055 et le MK-2206 sur l’expression de Mcl-1 et de ses partenaires pro-apoptotiques BH3-only .... 150

I.1 Effets de ces inhibiteurs sur l’expression de Mcl-1 ... 150 I.2 Effets de ces inhibiteurs sur l’expression et l’activité des partenaires BH3-only de Mcl-1 : Bim, Noxa et Puma ... 151 II. Intérêt de l’association de l’inhibition de la voie PI3K/Akt/mTOR et de l’inhibition de Bcl-xL par l’ABT-737 ... 152 III. Impact de l’inhibition de la voie MAPK/ERK sur l’expression de Mcl-1 et de ses partenaires pro-apoptotiques BH3-only ... 153

III.1 Effets des inhibiteurs de la voie MAPK/ERK sur l’expression de Mcl-1 ... 153 III.2 Effets des inhibiteurs de la voie MAPK/ERK sur les partenaires BH3-only de Mcl-1 : Bim, Puma et Noxa ... 154 IV. Intérêt de l’association de l’inhibition de la voie MAPK/ERK et de l’inhibition de Bcl-xL par l’ABT-737 ... 155 Chapitre III : Intérêt de l’association des inhibiteurs des voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK pour induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses, avec ou sans ABT-737 156

I. Effets de l’inhibition concomitante des deux voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK 156

II. Effets de l’inhibition concomitante des deux voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK en association avec l’ABT-737 ... 157 Contexte et objectifs de la thèse ... 159 Résultats ... 163 Publication n°1 : « Le double inhibiteur PI3K/mTOR NVP-BEZ235 réduit l’expression de Mcl-1 et sensibilise les cellules de cancer de l’ovaire aux stratégies ciblant Bcl-xL, à condition que Bim soit induit » ... 167 Publication n°2 : L’inhibiteur de mTORC1/2 AZD8055 renforce l’efficacité de l’inhibiteur de MEK trametinib pour réduire le ratio Mcl-1/[Bim et Puma] et pour sensibiliser les cellules de cancer de l’ovaire à l’ABT-737. ... 183 Publication n°3: Les oligopyridines, foldamères mimes d’hélice , inhibent Mcl-1 et sensibilisent les cellules de carcinome ovarien aux stratégies anti-Bcl-xL ... 201

Discussion ... 205

Conclusions générales et perspectives ... 223

Matériel et méthodes ... 229

I. Lignées cellulaires ... 231

II. Les substances actives étudiées ... 231

II.1 ABT-737 ... 231 II.2 AZD8055 ... 232 II.3 MK-2206 ... 232 II.4 BEZ235 ... 232 II.5 BGT226 ... 232 II.6 Trametinib ... 232 II.7 CI-1040 ... 232

III. Caractérisation de l’apoptose ... 233

III.1 Le DIAminoPhénylIndole (DAPI) ... 233

III.2 La cytométrie en flux ... 233

IV. Recherche du clivage des caspases 3 et de la PARP par western-blot ... 234

IV.1 Etude de l’expression des protéines par western-blot ... 234

V. Immunoprécipitation ... 236

VI. Stratégie ARN interférence ... 237

VII. Analyse de la cytotoxicité en temps réel (xCELLigence) ... 237

VIII. RT-qPCR ... 238

VIII.1 Extraction des ARN totaux ... 238

VIII.2 Synthèse d’ADNc par transcription inverse ... 238

VIII.3 Amplification par PCR Quantitative en temps réel ... 238

Liste

desfigures

Figure 1 : Estimation du nombre de cas de cancer (A) et de décès (B) en France, en fonction de la localisation chez la femme entre 1980 et 2012 (d’après www.e-cancer.fr). L-CO-P :

lèvre – cavité orale – pharynx ; SNC : système nerveux central ... 27

Figure 2 : Modèle de transformation de l’épithélium de surface ovarien avec inclusion des kystes (Levanon et al., 2008). ... 32

Figure 3 : Transfert de l’épithélium de la trompe de Fallope vers l’ovaire (Kurman and Shih, 2010). Proximité anatomique de la trompe de Fallope avec l’ovaire (A). L’ovulation avec rupture de la surface de l’épithélium ovarien, expulsion et transfert de l’ovocyte vers le pavillon de la trompe de Fallope (B). Transmission de cellules épithéliales tubaires vers l’ovaire au niveau du site dénudé après ovalution (C). Transfert de cellules tumorales épithéliales tubaires vers l’ovaire (D). ... 33

Figure 4 : Origines cellulaires potentielles des different sous-types de carcinomes ovariens (Ovarian Cancers: Evolving Paradigms in Research and Care, 2016). ... 34

Figure 5 : Impact du résidu post-résection chirurgicale des tumeurs ovariennes sur la survie globale (du et al., 2009). ... 38

Figure 6 : Index de carcinose péritonéal (PCI) de Sugarbaker (Yonemura et al., 2012). ... 39

Figure 7 : Structures chimiques du paclitaxel, du cisplatine et du carboplatine. ... 40

Figure 8 : Mécanisme d’action du cisplatine (Galluzzi et al., 2014). ... 40

Figure 9 : Les différents moyens de résistance aux dérivés du platine (Galluzzi et al., 2014). 44 Figure 10 : Mécanismes de résistances aux taxanes (Kavallaris, 2010). ... 45

Figure 11 : Schéma des composants de la voie angiogéniques et agents anti-angiogéniques (http://www.targetedonc.com). ... 48

Figure 12 : Principe de fonctionnement des inhibiteurs de PARP et concept de létalité synthétique (Polyak and Garber, 2011). SSB : single-strand break ; DSB : double-strand break ; LOH : loss of heterozygosity ... 49

Figure 13 : Comparaison de la survie sans progression entre le bras traité au ninaparib et le bras placebo chez des patientes en rechute sensible de cancer de l’ovaire BRCA muté. ... 50

Figure 14 : Les différentes perspectives thérapeutiques dans les cancers de l’ovaire (Petrillo et al., 2016). ... 50

Figure 15 : Les trois voies majeures de mort cellulaire (Hotchkiss et al., 2009). ... 53

Figure 17 : Illustration des changements morphologiques de la cellule au cours du processus d’apoptose (Kerr, 1995). ... 57 Figure 18 : Les différentes voies d’induction de l’apoptose possibles (Marzban et al., 2014).58 Figure 19 : Activation du complexe CAD/iCAD par la caspase-3 et fragmentation de l’ADN (Samejima and Earnshaw, 2005). ... 58 Figure 20 : Activation des caspases (Fuentes-Prior and Salvesen, 2004). ... 59 Figure 21 : Les différents récepteurs de mort et plateformes moléculaires de signalisation (Ashkenazi, 2002). ... 60 Figure 22 : Voie des récepteurs de mort de l’apoptose (Igney and Krammer, 2002) ... 60 Figure 23 : Schéma d’induction de la voie mitochondriale de l’apoptose (Green and Llambi, 2015). ... 62 Figure 24 : Structures des membres de la famille Bcl-2 (Walensky, 2006). ... 63 Figure 25 : Rôle et interactions des protéines de la famille Bcl-2 entre elles en réponse à un stress. ... 65 Figure 26 : Réseau d’interactions fonctionnelles entre les membres pro- et anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Moldoveanu et al., 2014) ... 65 Figure 27 : Les différents signaux cytotoxiques pouvant recruter les protéines BH3-only (Walensky, 2006). ... 67 Figure 28 : Schéma du modèle de l’ancrage et d’activation de Bax au niveau de la membrane externe mitochondriale (Czabotar et al., 2013). ... 68 Figure 29 : Structure des protéines Bcl-xL (A) et exemple d’interaction du domaine BH3 de Bim dans la poche hydrophobe de Mcl-1 (Czabotar et al., 2014). ... 69 Figure 30 : Schéma simplifié de la voie PI3K/Akt/mTOR (Holmes, 2011). ... 82 Figure 31 : Les classes de la famille des PI3K et leurs substrats préférentiels (Thorpe et al., 2015). ... 83 Figure 32 : Structures et mode d’activation des différentes classes de PI3K (Vanhaesebroeck et al., 2012). ... 84 Figure 33 : La structure des trois isoformes d’Akt (Nicholson and Anderson, 2002). ... 85 Figure 34 : Akt, un effecteur majeur de la PI3K aux cibles multiples (Vanhaesebroeck et al., 2012). ... 86 Figure 35 : Protéines formant les deux complexes de mTOR (Laplante and Sabatini, 2012). 87 Figure 36 : Les différents signaux d’activation de mTORC1 et mTORC2 et implications de ces deux complexes dans les processus cellulaires (Laplante and Sabatini, 2012). ... 87

Figure 37 : Le fonctionnement de la voie PI3K/Akt/mTOR et l’implication de ses cibles dans

différents processus cellulaires. ... 90

Figure 38 : Boucles de rétrocontrôle négatif de la voie PI3K/Akt/mTOR. ... 91

Figure 39 : Boucles de rétrocontrôle positif de la voie PI3K/Akt/mTOR ... 92

Figure 40 : Implication de la voie PI3K/Akt/mTOR dans la régulation des protéines de la famille Bcl-2 : Mcl-1, Bim, Puma et Noxa. ... 93

Figure 41 : Schéma des composants majeurs des quatre voies MAPK (Berwick and Harvey, 2011). ... 101

Figure 42 : Schéma de la voie MAPK/ERK (Uehling and Harris, 2015). ... 104

Figure 43 : Exemples de rétrocontrôles négatifs exercés au sein de la voie MAPK/ERK (Lake et al., 2016). ... 106

Figure 44 : Implication de la voie MAPK/ERK dans la régulation des protéines de la famille Bcl-2 : Mcl-1, Bim, Puma et Noxa. ... 107

Figure 45 : Régulation de la stabilité de Mcl-1 par la voie MAPK/ERK (Balmanno and Cook, 2009). ... 108

Figure 46 : Régulation des protéines FOXO par par le protéasome suite à sa phosphorylation par ERK (D’après Huang & Tindall, 2011). ... 109

Figure 47 : Régulation post-traductionnelle de Bim par ERK1/2. (Balmanno and Cook, 2009) ... 110

Figure 48 : Exemples d’interactions permettant à la voie PI3K/Akt/mTOR de réguler la voie MAPK/ERK. Les traits bleus correspondent aux interactions qui permettent d’induire la voie MAPK/ERK et les traits rouges correspondent aux interactions qui l’inhibent. ... 115

Figure 49 : Exemples d’interactions permettant à la voie MAPK/ERK de réguler la voie PI3K/Akt/mTOR. Les traits bleus correspondent aux interactions qui permettent d’induire la voie PI3K/Akt/mTOR et les traits rouges correspondent aux interactions qui l’inhibent. .... 116

Figure 50 : Exemples de molécules ciblant des protéines de la voie PI3K/Akt/mTOR. ... 120

Figure 51 : Structure chimique du MK-2206 (CAS 1032350-13-2). ... 128

Figure 52 : Effet des rapalogues sur la voie PI3K/Akt/mTOR. ... 130

Figure 53 : Effets des asTORis sur la voie PI3K/Akt/mTOR. ... 132

Figure 54 : Structure chimique de l’AZD8055 (CAS 1009298-09-2). ... 133

Figure 55 : Structure chimique de l’AZD2014 (CAS 1009298-59-2). ... 134

Figure 56 : Effets des doubles-inhibiteurs PI3K/mTOR sur la voie PI3K/Akt/mTOR. ... 135

Figure 57 : Structure chimique du BEZ235 (CAS 915019-65-7). ... 137 Figure 58 : Exemples de molécules ciblant les différents éléments de la voie MAPK/ERK. 138

Figure 59 : Exemples de mécanismes de résistance aux inhibiteurs de Raf et MEK (Samatar and Poulikakos, 2014). ... 144 Figure 60 : Schéma des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK, leur lien avec les protéines de la famille Bcl-2 et les inhibiteurs utilisés lors de cette étude (BEZ235, CI-1040 et ABT-737). ... 168 Figure 61 : Schéma des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK, leur lien avec les protéines de la famille Bcl-2 et les inhibiteurs utilisés lors de cette étude (AZD8055, MK-2206, BEZ235, trametinib et ABT-737). ... 184 Figure 62 : Effets de l’association de l’AZD8055 et du trametinib sur les protéines de la famille Bcl-2 et l’induction de l’apoptose dans la lignée IGROV1-R10. ... 213 Figure 63 : Effets de l’AZD8055 et du BEZ235 sur les protéines de la famille Bcl-2 et réponse à l’ABT-737 dans les différentes lignées étudiées (IGROV1-R10, OVCAR3 et SKOV3). L’association de l’AZD8055 avec l’ABT-737 n’induit pas l’apoptose dans les trois lignées étudiées (A). Le BEZ235 induit une apoptose massive en combinaison avec l’ABT-737 dans la lignée IGROV1-R10 (B). Le BEZ235 n’induit pas Bim et ne sensibilise pas les cellules de la lignée SKOV3 à l’ABT-737 (C). ... 214 Figure 64 : Effets du trametinib sur les protéines de la famille Bcl-2 et en réponse à l’ABT-737 dans les lignées IGROV1-R10 et OVCAR3. ... 215 Figure 65 : Effet de l’association d’un inhibiteur de l’AZD8055, du MK-2206 ou du BEZ235 avec le trametinib sur les protéines de la famille Bcl-2 et réponse à l’ABT-737. ... 216 Figure 66 ... 231 Figure 67 : Morphologie nucléaire observée après coloration des noyaux par le DAPI. (A) Noyaux normaux (objectif x40), (B) Noyaux condensés et fragmentés caractéristiques de l’apoptose (objectif x40). ... 233 Figure 68 : Histogrammes de contenu en ADN obtenus par cytométrie en flux. (A) exemple d’un profil de cellules témoin (B) Exemple d’un profil de cellules traitées. ... 234

Liste

destableaux

Tableau 1 : Facteurs de risqué des cancers de l’ovaire (Alvarez et al., 2016). ... 28

Tableau 2 : Classification FIGO des stades des cancers de l’ovaire, des trompes de Fallope et du péritoine (Prat, 2015). ... 29

Tableau 3 : Caractéristiques clinico-pathologiques des carcinomes ovariens de Type I et Type II (Kurman and Shih, 2016). ... 31

Tableau 4 : Synthèse des caractéristiques clinico-pathologiques et des altérations moléculaires de deux types de cancers de l’ovaire (Koshiyama et al., 2014). ... 36

Tableau 5 : Altérations des isoforme de PI3K de classe I dans les cancers (Thorpe et al., 2015). ... 98

Tableau 6 : Altérations de PTEN dans les cancers (LoRusso, 2016). ... 99

Tableau 7 : Altérations des isoformes d’AKT dans les cancers (Liu et al., 2009). ... 100

Tableau 8 : Exemples d’altérations des isoformes de RAS (Santarpia et al., 2012). ... 111

Tableau 9 : Exemples d’altérations des isoformes de RAF (Santarpia et al., 2012). ... 112

Tableau 10 : Exemples d’inhibiteurs de PI3K en essai clinique (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en janvier 2017). ... 121

Tableau 11 : Inhibiteurs de la voie PI3K/Akt/mTOR en essais cliniques dans les cancers de l’ovaire (recherche effectuée sur https://clinicaltrials.gov en février 2017). ... 125

Tableau 12 : Exemples d’inhibiteurs d’Akt en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en janvier 2017). ... 126

Tableau 13 : Exemples d’inhibiteurs du site actif de mTOR en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en juillet 2016). ... 131

Tableau 14 : Exemples de doubles-inhibiteurs PI3K/mTOR en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en septembre 2016). ... 136

Tableau 15 : Exemples d’essais cliniques évaluant l’efficacité du tipifarnib (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en janvier 2017). ... 140

Tableau 16 : Exemples d’inhibiteurs de Raf en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en janvier 2017). ... 142

Tableau 17 : Inhibiteurs de la voie MAPK/ERK en essais cliniques dans les cancers de l’ovaire (recherche effectuée sur https://clinicaltrials.gov en février 2017). ... 142

Tableau 18 : Exemples d’inhibiteurs allostériques de MEK en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en septembre 2016). ... 146

Tableau 19 : Exemples d’inhibiteurs allostériques de ERK en essais cliniques (* données extraites d’une recherche sur https://clinicaltrials.gov en février 2017). ... 149 Tableau 20 : Description des différents anticorps utilisés en western-blot. ... 236

4E-BP1 eIF4E Binding Protein 1 ADN Acide DésoxyriboNucléique AIF Apoptosis Inducing Factor

Akt / PKB Protein Kinase B

AMM Autorisation de Mise sur le Marché APAF1 Apoptotic Protease-Activating Factor 1 APO E Apolipoprotéine E

ARID1A AT-Rich Interaction Domain 1 A ARN Acide RiboNucléique

ARNm Acide RiboNucléique messager ASK1 Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 ATP Adénosine TriPhosphate

ATPase Adénosine TriPhosphate hydrolase AUC Area Under the Curve

Bad Bcl-xL/Bcl-2 Associated Death protein

Bak Bcl-2 homologous Antagonist-Killer protein Bax Bcl-2-Associated X protein

Bcl-2 B-cell lymphoma 2 Bcl-w Bcl-2-like 2

Bcl-xL B cell lymphoma x Long isoform

BER Réparation par Excision de Base

Bfl1/A1 Bcl-2-related protein A1 BH Bcl-2 Homology

Bid BH3 interacting domain death agonist protein Bik Bcl-2 interacting killer

Bim Bcl-2 interacting mediator of cell death Blf B-cell lymphocyte kinase

Bmf Bcl-2-modifying factor Bok Bcl-2-related ovarian killer

BOO/DIVA Bcl-2 homologue Of Ovary

BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B BRCA BReast CAncer gene

CA 125 Cancer Antigen 125

CAD Caspase-Activated DNase Caspase Apoptosis-related cysteine peptidase

CDK Cyclin Dependent Kinase

CED Cell death protein

CHOP CCAAT-enhancer-binding protein Homologous Protein

Abréviations

CLCC Centre de Lutte Contre le Cancer CTNNB1 Catenin Beta 1 CTR1 Copper Transporter 1

DAPI 4',6'-DiAmidino-2-PhénylIndole Deptor DEP domain containing mTOR-interacting protein DFF40 DNA Fragmentation of 40 kDa

DISC Death Inducing Signaling Complex DMSO DiMethylSulfOxide eIF4E Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E ERK Extracellular signal-Regulated Kinase Elk-1 E26-transformation-specific-like transcription factor 1 ERO Espèces Réactives à l’Oxygène

ESO Epithélium de Surface Ovarien Ets E26-transformation-specific

FADD Fas-Associated protein with Death Domain FDA Food and Drug Administration

FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor

FIGO Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique FKBP12 12-kDa FK506-binding protein

cFLIP (FADD-Like IL-1 -converting enzyme)-Inhibitory Protein FoxO Forkhead Box Transcription factor

GAB GRB2 Associated Binding Protein 1

GAP GTPase-Activating Protein Grb2 Growth factor receptor-bound protein 2

Grb 10 Growth factor receptor-bound protein 10 GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3

GSI -Synthetase Inhibitor HER Human Epidermal Receptor HNF Hepatocyte Nuclear Factor

HR Homologous Recombination

HRD Homologous Recombination Deficiency Hrk/DP5 Harakiri

IAP Inhibitor of Apoptosis Proteins IL Interleukine INCa Institut National du Cancer InVS Institut de Veille Sanitaire

IRM Imagerie à Résonnance Magnétique IRS Insulin Receptor Substrate

JAK Janus Kinase

KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog MAP Microtubule Associated Protein

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase Mcl-1 Myeloid cell leukemia sequence 1 MDM2 Murine Double Minute 2

MEK MAPK kinase

MIM-1 Mcl-1 Inhibitor Molecule 1

miRNA micro RNA

mLST8 mammalian lethal with sec-13 protein 8 MME Membrane Mitochondriale Externe

MOMP Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization MRP Multidrug Resistance Protein

mSIN mammalian stress-activated map kinase-interacting protein mTOR mammalian Target Of Rapamycin

mTORC1 mTOR Complex 1 mTORC2 mTOR Complex2 MULE Mcl-1 Ubiquitine Ligase E3 NF B Nuclear Factor kappa B

Noxa NADPH Oxidase Activator OAS Oligonucléotides Anti-Sens p53 protein of 53 kDa

PAK p21-Activated Kinase PARP Poly (ADP-Ribose) Polymerase

PCI Index de Carcinose Péritonéale

PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor PDK1 3’-Phosphoinositide-Dependent Protein Kinase 1 PERK Protein kinase RNA-like Endoplasmic Reticulum Kinase PEST Proline (P), Acide glutamique (E), Sérine (S), Thréonine (T)

PHLPP1/2 Pleckstrin Homology domain Leucine-rich repeat Protein Phosphatases 1 and 2 PI3K PhosphoInositide-3-Kinase

PI PhosphoInositide

PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-3-kinase, catalytic subunit alpha PKC Protein Kinase C

PIKK Phosphatidylinositol 3-kinase related protein PLD Pegylated Liposomal Doxorubicin

PLK Polo-Like Kinase PP2A Protein Phosphatase 2A

PRAS40 Protein-Rich Akt Substrate of 40 kDa PTEN Phosphatase and TENsin homolog Puma p53 Upregulated Modulator of Apoptosis

Abréviations

Ras Rat sarcoma

Raptor Regulatory-associated protein of mTOR RBD Ras-binding domain RE Réticulum endoplasmique Rheb Ras homolog enriched in brain

Rictor Rapamycin-insensitive companion of mTOR RIP Receptor-Interacting Protein RISC RNA-induced silencing complex RNase RiboNucléase

ROCK-1 Rho-associated protein kinase 1 RSK p90 Ribosomal S6 Kinase S6K1/p70S6K S6 Kinase 1 protein SCF Stem Cell Factor

SET Solide, pseudoEndométrioïde et Transitionnel

SG Survie Globale

SGK1 Serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1 shRNA Small hairpin RNA

siRNA Small interfering RNA

SMAC Second Mitochondrial Activator of Caspases SPR Surface Plasmon Resonance SRF Serum Response Factor

SSP Survie Sans Progression STAT Signal Transducer and Activator of Transcription STIC Serous Tubal Intraepithelial Carcinoma

TM Transmembranaire TNF Tumor Necrosis Factor

TPA Tissue Plasminogen Activator

TRADD (Tumor necrosis factor Receptor 1)-Associated Death Domain TRAIL Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand TSC Tuberous Sclerosis Complex

UPR Unfolded Protein Response

USP9X Ubiquitin Specific Peptidase 9, X-linked UTR UnTranslated Region VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor XIAP X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein

Avec environ 4600 nouveaux cas et 3200 décès par an en France, le cancer de l’ovaire est la première cause de décès par cancer gynécologique. Le taux de survie à 5 ans est inférieur à 30%. Ce sombre pronostic s’explique en partie par le caractère asymptomatique de la maladie qui entraîne un diagnostic tardif, avec un stade de dissémination élevé. Même si une majorité de patientes répond à la première ligne de chimiothérapie (basée sur des dérivés du platine), 75% de ces patientes rechutent et cette récidive s’accompagne du développement d’une chimiorésistance. Dans ce contexte, il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge de ces patientes. Notre Unité a précédemment montré que l’inhibition de deux protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, Bcl-xL et Mcl-1, suffisait à induire l’apoptose dans différentes lignées de cancers ovariens, et que leur partenaire pro-apoptotique BH3-only Bim jouait un rôle important dans l’apoptose induite. Ces protéines constituent donc des cibles intéressantes pour le traitement des cancers de l’ovaire. L’ABT-737 (et son analogue oral, l’ABT-263), développé par le laboratoire AbbVie, est une molécule BH3-mimétique qui inhibe très efficacement l’activité de Bcl-xL. Toutefois, elle n’inhibe pas celle de Mcl-1 et cette protéine a été décrite comme impliquée dans la résistance à l’ABT-737, en particulier dans les cancers de l’ovaire. La recherche d’outils pharmacologiques permettant d’inhiber Mcl-1, ou d’induire ses partenaires BH3-only, représente donc un défi majeur.

C’est dans ce contexte que s’est inscrit mon projet de thèse au sein de l’Unité BioTICLA (Biologie et Thérapies Innovantes des Cancers Localement Agressifs). L’objectif de ce travail était d’identifier de nouveaux outils pharmacologiques capables d’inhiber Mcl-1 et/ou d’induire ses partenaires pro-apoptotiques BH3-only (Bim, Puma et Noxa) afin de sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés à l’utilisation d’inhibiteurs des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK, connues pour moduler l’expression des protéines de la famille Bcl-2. J’ai ainsi étudié les effets de plusieurs inhibiteurs de la voie PI3K/Akt/mTOR, le BEZ235 (Novartis, inhibiteur de PI3K et de mTOR), le MK-2206 (Merck, inhibiteur d’Akt) et l’AZD8055 (AstraZeneca, inhibiteur de mTOR) et l’inhibiteur de MEK trametinib (GlaxoSmithKline, Mekinist®), sur l’expression de Mcl-1 et de ses partenaires BH3-only et évalué leur capacité à sensibiliser à l’ABT-737.

Ce manuscrit de thèse aborde tout d’abord les cancers de l’ovaire et leur prise en charge thérapeutique actuelle et future, puis le rôle des protéines de la famille Bcl-2 dans le contrôle de l’apoptose, la régulation de Mcl-1 et de ses partenaires BH3-only par les voies de

Introduction générale

signalisation PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK et l’intérêt de l’inhibition de ces voies pour moduler l’expression de ces protéines et sensibiliser à l’ABT-737. Les résultats des travaux sont ensuite présentés suivant les trois articles qui ont été publiés au cours de ma thèse. Les deux premières publications présentent l’intérêt de l’inhibition des voies PI3K/Akt/mTOR et MAPK/ERK pour sensibiliser les cellules cancéreuses ovariennes à l’ABT-737 et la dernière présente un travail auquel j’ai pu participer sur l’évaluation d’un nouvel inhibiteur direct de Mcl-1, le Pyridoclax. L’ensemble de ces résultats est suivi d’une discussion et d’une conclusion générale. Les matériels et méthodes utilisés pour réaliser nos travaux ainsi que les références sont présentés à la fin de ce manuscrit.







P

REMIÈRE PARTIE

:



L

E CANCER DE L

’

OVAIRE ET SA PRISE EN

CHARGE

THÉRAPEUTIQUE



Chapitre

I:Lecancerdel’ovaire:généralités

I. Quelqueschiffres

En France, selon les données de l’Institut de veille sanitaire (InVS), plus de 4600 nouveaux cas sont diagnostiqués et plus de 3100 femmes décèdent des suites d’un cancer de l’ovaire chaque année. C’est la 5ème cause de mortalité par cancers chez la femme avec un taux de mortalité très élevé comparés à d’autres cancers ayant une incidence plus fréquente comme par exemple le cancer du sein (Figure 1). Le cancer de l’ovaire est responsable de près de la moitié des décès par cancers gynécologiques alors qu’il ne représente que 23% de ces cancers (Siegel et al., 2014). La survie globale à 5 ans est inférieure à 45% (Webb and Jordan, 2016) et n’a que très peu évolué depuis plusieurs décennies. Le sombre pronostic de ce cancer est dû notamment à son caractère asymptomatique qui a pour conséquence un diagnostic tardif, dans près de 75% des cas à un stade de dissémination avancé (stade III ou IV). L’âge médian du diagnostic est de 63 ans (seer.cancer.gov octobre 2016).

Figure 1 : Estimation du nombre de cas de cancer (A) et de décès (B) en France, en fonction de la localisation chez la femme entre 1980 et 2012 (d’après www.e-cancer.fr). L-CO-P : lèvre – cavité orale – pharynx ; SNC : système nerveux

central

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

II. Descriptiond’unemaladiecomplexe

II.1 Principaux

facteursderisque

Plusieurs facteurs de risques de développer un cancer de l’ovaire, présentés dans le Tableau 1, ont été identifiés.

Risque augmenté Risque diminué

Age Utilisation de contraception orale Histoire familiale de cancer Oophorectomie

Obésité Hystérectomie

Nulliparité Ligature des trompes Thérapie de remplacement hormonal Allaitement

Nombre élevé de cycles ovulatoire au cours de la vie Salpingectomie

Salpingo-oophorectomie bilatérale

Tableau 1 : Facteurs de risqué des cancers de l’ovaire (Alvarez et al., 2016).

Un certain nombre des facteurs de risque peuvent être influencés par des changements de style de vie, un traitement hormonal ou une intervention chirurgicale. Cependant, certains facteurs ne peuvent être modifiés (âge, ascendance). La notion à retenir est que plus le nombre d’ovulation est élevé, plus il y a de risque de développer un cancer de l’ovaire. Les facteurs de risque peuvent également varier en fonction du sous-type histologique. Ainsi, un facteur donné peut augmenter le risque pour un sous-type et le diminuer pour un autre. L’inconvénient majeur est que pratiquement tous les facteurs de risque identifiés sont associés majoritairement aux sous-types de cancer de l’ovaire les moins communs et les moins létaux (Alvarez et al., 2016).

II.2 Classification

descancersdel’ovaire

Le cancer de l’ovaire est une maladie qui peut se présenter sous différentes formes avec un ensemble de tumeurs elles-mêmes hétérogènes sur le plan histologique et moléculaire. Il se présente sous forme d’une tumeur primaire fréquemment associées à des métastases péritonéales (nodules de carcinose) et à un liquide inflammatoire parfois abondant, le liquide d’ascite, dans lequel se trouvent le plus souvent des grappes de cellules tumorales et des cellules inflammatoires. La classification de la Fédération Internationale de Gynécologie et Obstétrique (FIGO) créée en 1998 et actualisée en 2014 (Prat, 2015) est actuellement utilisée pour définir le stade de dissémination des tumeurs et participer à la décision de prise en charge des patientes (Tableau 2). Le stade tumoral est en effet un facteur pronostique majeur dans les cancers ovariens, ainsi que la taille de la masse tumorale résiduelle après exérèse.

Stade Classification TNM Description Stade I T1N0M0 Tumeur limitée aux ovaires et aux trompes de Fallope

IA T1aN0M0 Tumeur limitée à un seul ovaire avec capsule intacte et ou une trompe de Fallope. Pas de tumeur à la surface de l’ovaire ou de la trompe de Fallope, pas de cellules tumorales dans le liquide d’ascite ou de lavage péritonéal

IB T1bN0M0 Tumeur limitée aux deux ovaires avec capsule intacte et aux deux trompes de Fallope avec capsule intacte ou une trompe de Fallope. Pas de tumeur à la surface de l’ovaire ou de la trompe de Fallope, pas de cellules tumorales dans le liquide d’ascite ou de lavage péritonéal

IC T1cN0M0 Tumeur limitée à un ou deux ovaires ou trompes de Fallope avec un des évènements suivants

IC1 T1c1N0M0 Rupture chirurgicale

IC2 T1c2N0M0 Rupture capsulaire avant la chirurgie ou tumeur à la surface des ovaires ou de la trompe de Fallope

Stade II T2N0M0 Cellules tumorales dans le liquide d’ascite ou de lavage péritonéal

IIA T2aN0M0 Extension et/ou implants à l’utérus et/ou aux trompes de Fallope et/ou aux ovaires

IIB T2bN0M0 Extension aux autres tissus pelviens intrapéritonéaux

Stade III T1/2N1M0 Tumeurs impliquant un ou deux ovaires ou trompes de Fallope ou tumeur primaire du péritoine, avec preuve cytologique ou histologique d’extension péritonéale au-delà du pelvis et/ou adénopathies métastatiques

IIIA1 Adénopathies rétropéritonéale uniquement (prouvées cytologiquement ou histologiquement) IIIA(i) Métastase 10 mm

IIIA(ii) Métastase 10 mm

IIIA2 T3a2N0/N1M0 Métastase péritonéale extrapelvienne microscopique avec ou sans adénopathies rétropéritonéales

IIIB T3bN0/N1M0 Métastases péritonéales macroscopiques au-delà du pelvis 2 cm avec ou sans adénopathies rétropéritonéales

IIIC T3bN0/N1M0 Métastases péritonéales macroscopiques au-delà du pelvis 2 cm avec ou sans adénopathies rétropéritonéales (inclus l’extension de la tumeur aux capsules hépathique et splénique sans atteinte parenchymateuse de ces organes)

Stade IV TNM1 Métastases à distance (autres que les métastases péritonéales) IVA Epanchement pleural avec cytologie positive

IVB Métastases parenchymateuses et métastases extra-abdominales (y compris adénopathies inguinales et adénopathies en dehors de la cavité abdominale)

Tableau 2 : Classification FIGO des stades des cancers de l’ovaire, des trompes de Fallope et du péritoine (Prat, 2015). Par ailleurs, la définition du grade des cancers de l’ovaire permet de définir son agressivité et se fait grâce à l’analyse microscopique des cellules lors d’une biopsie ou de la chirurgie et a un impact sur le choix du traitement. Le bas grade caractérise des tumeurs dont les cellules cancéreuses ressemblent aux cellules normales, à l’inverse le haut grade caractérise des tumeurs dont les cellules qui sont très différentes des cellules normales et qui se multiplient très rapidement.

Plus de 90% des tumeurs ovariennes sont d’origine épithéliale. Une plus faible proportion de ces tumeurs peut être d’origine germinale ou müllerienne. Les caractéristiques

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

histopathologiques, immunohistochimiques et les analyses génétiques moléculaires permettent de distinguer cinq sous-types histologiques : les séreux de haut grade (70%), endométrioïdes (10%), à cellules claires (10%), mucineux (3%) et les séreux de bas grade (< 5%) (Prat, 2015).

Un nouveau modèle de classification des tumeurs établi en 2004 (Shih and Kurman, 2004) a permis de distinguer deux grandes catégories de cancers épithéliaux de l’ovaire : type I et type II. Ce modèle a été actualisé très récemment par les mêmes auteurs (Kurman and Shih, 2016).

x TumeursdetypeI:

Au sein du type I sont retrouvés les cancers de l’ovaire séreux de bas grade, endométrioïdes, les carcinomes mucineux, à cellules claires et les tumeurs de Brenner (carcinomes à cellules transitionnelles composées de cellules matures semblables aux cellules urothéliales).

A l’exception des carcinomes à cellules claires considérés comme de haut grade, les tumeurs de type I sont de bas grade. Ce sont des cancers indolents, souvent diagnostiqués à un stade précoce (la plupart du temps confiné au niveau de l’ovaire et de bon pronostic) avec une progression lente. Ils représentent seulement 10% des morts par cancers de l’ovaire (Kurman and Shih, 2016).

x TumeursdetypeII:

Les tumeurs de type II sont exclusivement de haut grade et sont diagnostiquées à des stades avancés dans plus de 75% des cas. Ce type de tumeurs inclut les séreux de haut grade, les carcinosarcomes et les carcinomes indifférenciés. Ce sont des cancers qui se développent rapidement et qui sont très agressifs. Le volume de la tumeur au niveau des ovaires est moins important que dans les tumeurs de type I, en revanche, au niveau extra-ovarien, la tumeur est beaucoup plus importante avec souvent un développement de carcinose au niveau de l’épiplon et du mésentère. Contrairement aux types I, les cancers de type II sont fréquemment accompagnés d’ascite (Tableau 3). Malgré le traitement de référence, basé sur l’exérèse la plus complète que possible de la tumeur et l’utilisation d’un dérivé du platine associé aux taxanes, qui permet d’améliorer la survie sans progression et modestement la survie globale, la majorité des patientes succombent à leur maladie. Ce type de tumeurs est responsable d’environ 90% des décès par cancers de l’ovaire (Kurman and Shih, 2016).

Caractéristiques Type I Type II

Stade au moment du diagnostic Généralement à un stade précoce Pratiquement toujours à un stade avancé Grade de la tumeur Bas grade Haut grade

Activité proliférative Généralement faible Toujours élevée

Ascites Rare Fréquent

Réponse à la chimiothérapie Faible Bonne (mais rechutes fréquentes)

Détection précoce Possible Difficile Progression Lente et indolente Rapide et agressive

Tableau 3 : Caractéristiques clinico-pathologiques des carcinomes ovariens de Type I et Type II (Kurman and Shih, 2016).

L’actualisation de la classification par l’Organisation Mondiale de la Santé en 2014 a permis d’ajouter les tumeurs séromucineuses aux tumeurs de type I dont une désignation plus appropriée, reflétant les caractéristiques morphologiques, immunohistochimiques et moléculaires, a été proposée : les tumeurs mülleriennes mixtes, comprenant cystadénomes, tumeurs (borderline) prolifératives atypiques et carcinomes. Globalement, les tumeurs séreuses sont les plus fréquemment retrouvées et sont divisées en deux groupes : les tumeurs séreuses de bas grade ( 25%) et les tumeurs séreuses de haut grade ( 75%) (Kurman and Shih, 2016).

II.3 Origines

envisagéesducancerdel’ovaire

Deux modèles sur l’origine des cancers de l’ovaire sont proposés.

La théorie la plus répandue est que le cancer de l’ovaire dériverait des cellules de l’épithélium de surface ovarien (ESO). Le processus d’ovulation cyclique qui induit la rupture puis la réparation répétées de l’ESO contribuerait à l’accumulation de mutations somatiques, telles que des mutations de TP53, et éventuellement à la transformation maligne des cellules de l’OSE. Le processus implique la formation de kystes d’inclusion au sein du cortex ovarien faits de cellules de l’ESO. Ces cellules, qui sont à ce stade localisées dans des sites ectopiques, seraient exposées au microenvironnement du stroma ovarien qui, conjointement avec l’inflammation entraînée par les cycles d’ovulation, pourrait promouvoir la transformation maligne (Figure 2) (Cardenas et al., 2016).

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

Figure 2 : Modèle de transformation de l’épithélium de surface ovarien avec inclusion des kystes (Levanon et al., 2008).

Cependant, de nombreuses études menées sur l’origine du cancer de l’ovaire ont prouvé qu’il pouvait être initié à partir de cellules issues de divers sites en dehors des ovaires. Cette hypothèse a été confirmée par l’observation de lésions pré-néoplasiques nommées STIC (carcinome séreux intraépithélial tubaire) contenant une signature p53 au niveau de la fimbria (frange) des trompes de Fallope chez des patientes présentant des mutations BRCA1 et

BRCA2, avec une histologie normale de l’ovaire. La signature p53 est principalement

localisée à l’extrémité des fimbriae des trompes de Fallope, site préférentiel des carcinomes tubaires BRCA mutés (Cardenas et al., 2016). La majorité des tumeurs de type II semblent plutôt émerger de cellules de STIC se propageant à l’ovaire (Kurman and Shih, 2010).

Un autre mécanisme possible dans le développement de cancer de l’« ovaire » serait l’implantation de cellules de l’épithélium tubaire normal au niveau des sites de rupture au moment de l’ovulation. Les tumeurs séreuses pourraient donc se développer à partir de kystes d’inclusion, comme envisagé depuis longtemps, mais par un processus d’implantation de tissu issu des trompes plutôt que par un processus de métaplasie à partir de l’ESO (Figure 3) (Kurman and Shih, 2010).

Figure 3 : Transfert de l’épithélium de la trompe de Fallope vers l’ovaire (Kurman and Shih, 2010). Proximité

anatomique de la trompe de Fallope avec l’ovaire (A). L’ovulation avec rupture de la surface de l’épithélium ovarien, expulsion et transfert de l’ovocyte vers le pavillon de la trompe de Fallope (B). Transmission de cellules épithéliales tubaires vers l’ovaire au niveau du site dénudé après ovalution (C). Transfert de cellules tumorales épithéliales tubaires vers l’ovaire (D).

Actuellement, les cellules de l’ESO et les cellules épithéliales tapissant l’extrémité des frimbrae des trompes de Fallope sont considérées comme étant à l’origine des cancers de l’ovaire de haut et de bas grade. Par ailleurs, les sous-types endométrioïdes et à cellules claires semblent dériver de l’endomètre issu de menstruations rétrogrades et l’origine du sous-type mucineux est incertaine (Figure 4) (Cardenas et al., 2016).

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

Figure 4 : Origines cellulaires potentielles des different sous-types de carcinomes ovariens (Ovarian Cancers: Evolving Paradigms in Research and Care, 2016).

III.

Altérationsmoléculairesdescancersdel’ovaire

La principale caractéristique génétique moléculaire qui sépare le type I du type II est la stabilité génétique relative (comme reflété par les modifications du nombre de copies d’ADN) des tumeurs de type I en comparaison avec l’instabilité chromosomique marquée des tumeurs de type II. Des mutations somatiques de gènes tels que PTEN, KRAS ou BRAF, sont fréquemment détectées dans les tumeurs de type I (Koshiyama, 2014). Dans les tumeurs de type II, des mutations de TP53 sont très fréquemment observées (96% des carcinomes ovariens séreux de haut grade) (Bell, 2011) alors qu’elles ne le sont pas dans les tumeurs de type I.

Dans les tumeurs épithéliales séreuses de haut grade (type II), des altérations moléculaires de gènes impliqués dans la réparation par recombinaison homologue en particulier BRCA1/2 (altérations de l’expression des gènes BRCA par mutations du gène ou méthylation du promoteur) sont également retrouvées. Il est estimé qu’environ 50% des carcinomes séreux de haut grade présentent des altérations de ce type de gènes entraînant un défaut de réparation des cassures double brins (Alkema et al., 2016; Bixel and Hays, 2015; Koshiyama et al.,

2014). Cette dernière caractéristique est importante puisqu’elle est associée à la réponse aux inhibiteurs de PARP (Olaparib etc.) selon le principe de la létalité synthétique détaillé plus loin. Les différentes caractéristiques clinico-pathologiques et les anomalies moléculaires de ces deux types de tumeurs sont récapitulées dans le Tableau 4.

L’amélioration de la compréhension de la maladie n’a malheureusement pas encore eu de réel impact sur son pronostic. L’évolution des traitements des cancers tend vers l’utilisation de thérapies ciblées et une prise en charge individualisée. Cependant, les cancers de l’ovaire font partie des cancers qui en bénéficient le moins aujourd’hui et la prise en charge standard n’a que très peu évolué depuis longtemps.

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

Tableau 4 : Synthèse des caractéristiques clinico-pathologiques et des altérations moléculaires de deux types de cancers de l’ovaire (Koshiyama et al., 2014).

Type I Type II

Comportement Indolent Agressif

Etendue de la dissémination au moment du diagnostic

Stades précoces Stades avancés

Survie à 5 ans Environ 55% Environ 30%

Type histologique / Précurseurs Carcinome endométrioïde Endométriose Carcinome séreux de haut grade Probablement de novo débutant au niveau de l’épithélium de surface tubo-ovarien : SCOUT signature P53 STIL/TILT STIC ou cellules souches du hile de l’ovaire Carcinome à cellules claires Endométriose

Carcinome mucineux Cystadénome mucineux, Endométriose Tératome, Tumeur de Brenner, Tumeur mucineuse borderline Carcinome indifférencié ?

Carcinome séreux de bas grade Cystadénome séreux, Adénofibrome Tumeurs séreuses

borderline Kyste épithélial Müllerien

Carcinosarcome ?

Carcinome à cellules transitionnelles

Tumeur de Brenner

Profil d’expression génique

Instabilité génétique Relativement stable Très instable

Mutation PTEN 15-20% Faible

Surexpression HNF-1 beta 90% Faible

Mutation ARID1A 40-50% Non détectée

Mutation CTNNB1 30% Faible

PIK3CA 20% Faible

Instabilité microsatellitaire 50% 8-28%

Mutation KRAS 30-65% Faible

Mutation BRAF 30-65% Faible

Mutation TP53 Faible 50-80%

Surexpression HER2/neu Faible 20-67%

Surexpression Akt Faible 12-30%

Inactivation p16 Faible 15%

Surexpression HL1-G Faible 61%

Surexpression APO E 12% 66%

Mutation BRCA1/2 Faible Elevée

Chapitre

 II: Prise en charge thérapeutique des cancers de

l’ovaire



I. Diagnostic

Le cancer de l’ovaire est ce qu’on appelle un « tueur silencieux » puisqu’aucun symptôme distinct n’est associé à ce cancer. Le caractère aspécifique des symptômes des cancers de l’ovaire permet d’expliquer leur diagnostic tardif bien que des recherches récentes aient montré que la plupart des femmes atteintes d’un cancer de l’ovaire souffraient de symptômes tels qu’un ballonnement, une douleur pelvienne ou abdominale ou des symptômes urinaires et que beaucoup de femmes se souviennent avoir eu ces symptômes pendant une période prolongée avant le diagnostic (Alvarez et al., 2016). Un cancer de l’ovaire peut donc être recherché ou découvert de manière fortuite chez des patientes allant consulter pour une gêne abdominale (douleur, gonflement…) ou un état de fatigue anormal, avec la mise en évidence d’une masse annexielle par un examen gynécologique et/ou une échographie. A l’issue de ces premiers examens, les patientes atteintes de tumeurs dont le caractère malin est indéterminé subissent une IRM (Imagerie par Résonnance Magnétique) afin de préciser la malignité de la tumeur. Les patientes présentant des tumeurs suspectées de malignité passent alors un scanner puis subissent une coelioscopie permettant au chirurgien d’évaluer l’étendue de la maladie (stadification) et sa résécabilité (possibilité d’aboutir à une résection complète de la masse tumorale) et au pathologiste de déterminer l’histologie de la tumeur.

Il existe également un marqueur tumoral mesurable par une simple prise de sang : le CA 125 (Cancer Antigen 125). Le taux de ce marqueur est élevé chez les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire. Cependant, le CA 125 n’est pas un marqueur spécifique des cancers de l’ovaire puisque son augmentation est également observée dans d’autres cancers et dans des pathologiques inflammatoires. Il ne peut donc pas être utilisé comme outil diagnostique spécifique mais est utile dans l’évaluation de la réponse au traitement ou la détection d’une récidive (Bast, Jr. and Spriggs, 2011; Su et al., 2013).

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

II. Traitementstandard

II.1 La

chirurgie

La chirurgie est un élément majeur dans la prise en charge des cancers ovariens. Son objectif est d’obtenir une résection la plus complète possible puisqu’une corrélation entre la taille du résidu tumoral après chirurgie et la survie globale (SG) ainsi que la survie sans progression (SSP) a été établie (Figure 5). Elle peut être initiale, ou intermédiaire (en général après les trois premières cures de chimiothérapie de première ligne) lorsque la résection complète n’est pas possible d’emblée. Elle permet d’évaluer l’hétérogénéité et l’extension de la tumeur et donc de définir précisément le stade de dissémination de la maladie. Une chirurgie conservatrice peut être envisagée chez les patientes en stade précoce (IA Grade I) souhaitant préserver leur fertilité, avec l’ablation de l’ovaire atteint uniquement (du et al., 2009).

Figure 5 : Impact du résidu post-résection chirurgicale des tumeurs ovariennes sur la survie globale (du et al., 2009). La résecabilité de la tumeur est évaluée en amont de la chirurgie de résection lors d’une cœlioscopie exploratrice grâce au score de Fagotti ou à l’index de Sugarbaker (Peritoneal Cancer Index ou PCI) (Figure 6). Comme décrit précédemment, cette cœlioscopie permet donc au chirurgien de déterminer si cette chirurgie initiale est envisageable. En effet, chez des patientes en stades avancés, une résection complète de la tumeur peut s’avérer impossible. Dans ce cas, une chimiothérapie néo-adjuvante est appliquée afin de réduire la charge

tumorale et augmenter les chances de résection complète lors de l’intervention chirurgicale (Alvarez et al., 2016).

Figure 6 : Index de carcinose péritonéal (PCI) de Sugarbaker (Yonemura et al., 2012).

II.2 Lachimiothérapiedepremièreligne

Malgré la grande hétérogénéité des cancers de l’ovaire, le traitement chimiothérapeutique est le même pour tous les sous-types. Seules les patientes de stage IA/IB de grade 1 et 2 ne se voient pas proposer ce traitement. Cette chimiothérapie conventionnelle associe le carboplatine au paclitaxel administrés par voie intraveineuse toutes les trois semaines pendant six cycles au total. Pour les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire de stade avancé avec une résection optimale lors de la chirurgie, l’intérêt de la chimiothérapie en intrapéritonéal (IP) reste discutée (Alvarez et al., 2016). Plusieurs essais cliniques de phase III ont permis de montrer l’importance de l’intervalle entre la chirurgie et le premier cycle de chimiothérapie. En effet, un retard du premier cycle de chimiothérapie est corrélé à un plus grand nombre de rechutes précoces, mais ceci est uniquement vrai chez les patientes ayant eu une chirurgie optimale (Mahner et al., 2013). Par ailleurs, des essais cliniques évaluant l’intérêt de la chimiothérapie hyperthermique intra-péritonéale sont actuellement en cours, cependant les effets secondaires sembleraient importants.

Le carboplatine est un dérivé du platine qui a été choisi après plusieurs essais cliniques prouvant sa moindre toxicité comparé au cisplatine (Marchetti et al., 2010). La structure de ces deux molécules sont présentées sur la Figure 7. C’est une prodrogue activée après hydrolyse en milieu biologique. Le produit de cette hydrolyse forme des ponts intra-brins et des ponts inter-brins, nommés adduits, en se liant de façon covalente aux bases puriques de

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

l’ADN. Ces adduits induisent des dommages de l’ADN empêchant sa réplication. Ces lésions, conduisent à l’arrêt du cycle cellulaire et lorsqu’elles ne sont pas réparées, mènent soit à la sénescence, soit à l’induction de la mort cellulaire par apoptose (Figure 8).

Figure 7 : Structures chimiques du paclitaxel, du cisplatine et du carboplatine.

Figure 8 : Mécanisme d’action du cisplatine (Galluzzi et al., 2014).

Paclitaxel



(Taxol®)

Cisplatine

Le paclitaxel (Taxol®) est un alcaloïde issu de l’écorce d’ifs faisant partie de la famille des taxanes, qui sont définis comme des poisons du fuseau mitotique. Sa structure est présentée dans la Figure 7 . Il stabilise les microtubules et empêche leur dépolarisation induisant donc un échec de la ségrégation des chromosomes (Blagosklonny and Fojo, 1999). L’arrêt du processus mitotique provoque un certain nombre d’évènements qui conduisent à la mort cellulaire par apoptose. Parmi ces évènements, il faut noter la phosphorylation inactivatrice de Bcl-2 et l’activation des protéines pro-apoptotiques Bax, Bad et Bim (Bhalla, 2003).

Cette chimiothérapie a pour intérêt de diminuer les risques de récidives et de réduire la taille de la tumeur et de ses extensions lorsqu’elle est administrée avant la chirurgie. Cependant, de nombreuses toxicités y sont associées et l’émergence d’une résistance, discutée plus loin, est observée dans la majorité des cas.

II.3 Thérapie

ciblée:intérêtdesantiǦangiogéniques

L’angiogenèse est un processus essentiel à la néovascularisation des tumeurs et est donc indispensable à leur développement. Dans les cancers, et notamment dans les cancers de l’ovaire, le VEGF (vascular epidermal growth factor) et son récepteur, le VEGFR (VEGF receptor) sont surexprimés. Le bevacizumab (Avastin®, Roche) est un anticorps monoclonal anti-VEGF, empêchant sa liaison à son récepteur et bloquant ainsi l’angiogenèse tumorale. Deux essais cliniques de phase III, GOG-0218 et ICON7, ont évalué l’intérêt de l’utilisation du bevacizumab en première ligne de traitement des cancers de l’ovaire en association avec la chimiothérapie conventionnelle (carboplatine/paclitaxel).

Dans l’étude GOG-0128, les patientes diagnostiquées à des stades III/IV ont été divisées en trois bras : carboplatine/paclitaxel avec un placebo, carboplatine/paclitaxel/bevacizumab et carboplatine/paclitaxel/bevacizumab suivi du bevacizumab en maintenance. Une amélioration de la SSP (survie sans progression) a été observée chez les patientes du bras traité avec la triple association suivi du bevacizumab en maintenance par rapport au bras traité seulement avec la chimiothérapie (14,1 versus 10,3 mois) (Aravantinos and Pectasides, 2014).

L’étude ICON7 a comparé le traitement carboplatine/paclitaxel avec cette même chimiothérapie associée au bevacizumab suivi du bevacizumab en monothérapie. Elle a montré que chez les patientes à haut risque de progression, le bénéfice de l’ajout du bevacizumab à la chimiothérapie était le plus remarquable (18,1 avec le bevacizumab versus 14,5 mois sans) (Perren et al., 2011).

Ces deux essais cliniques de phase III ont donc démontré un bénéfice significatif de la survie sans progression (SSP) des cancers de l’ovaire avancés, mais même si ce bénéfice reste

Le cancer de l’ovaire et sa prise en charge thérapeutique

modeste. Ils ont suggéré un bénéfice plus prononcé dans un sous-groupe de patientes défini par un stade avancé et une résection complète après chirurgie. Le bevacizumab a été approuvé en Europe pour son utilisation en association avec la combinaison carboplatine/paclitaxel en première ligne de traitement des cancers de l’ovaire de stade IIIB-IV. L’augmentation de la SSP est importante puisqu’elle permet une meilleure qualité de vie des patientes. Ceci passe par (i) le retard des manifestations de symptômes associés à la progression de la maladie, (ii) le retard de l’administration de thérapies de secondes ligne qui entrainent de nouvelles toxicités, (iii) le retard du stress psychologique engendré par la progression de la maladie et enfin, (iv) l’augmentation du temps entre le dernier traitement au platine et la rechute (Colombo et al., 2016).

Le bevacizumab est actuellement la seule molécule admise pour le traitement d’entretien des cancers ovariens. La limite de cet agent est sociale puisque le coût du traitement est très élevé.

III. Récidives,chimiorésistanceettraitementsassociés

III.1 Récidives

Malgré un taux de réponse initial élevé (75% des cas) après la prise en charge standard (chirurgie + chimiothérapie), la fréquence des récidives est très élevée et constitue un obstacle majeur dans le traitement des cancers de l’ovaire. La majorité des patientes rechutent dans les deux premières années après le diagnostic, même après une chirurgie de résection primaire optimale accompagnée de la chimiothérapie adjuvante (2002).

Une classification des patientes en rechute a été définie en fonction de la durée écoulée entre le dernier cycle de dérivé du platine et la récidive de la maladie.

Les patientes réfractaires observent une progression pendant leur chimiothérapie ou dans le mois qui suit l’arrêt du traitement au platine. Les patientes résistantes ont une maladie qui progresse entre le premier et le sixième mois après la dernière perfusion. Les patientes

partiellement sensibles rechutent entre le sixième et le douzième mois. Les patientes sensibles rechutent plus de douze mois après le dernier traitement.

III.2 Chimiorésistance



La chimiorésistance constitue un obstacle majeur dans le traitement des cancers de l’ovaire. En effet, même si une majorité des tumeurs ovariennes sont sensibles à la chimiothérapie, elles évoluent le plus souvent vers un état résistant à la chimiothérapie, avec la mise en place