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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Rayet, B. (1998). Etude du pouvoir antitumoral du parvovirus H-1: Caractérisation de l'action cytocide du virus H-1 sur les cellules leucémiques U937 (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Biophysique et Radiobiologie

Etude du pouvoir antitumoral du parvovirus H-1:

Caractérisation de l’action cytocide du virus H-1 sur les cellules leucémiques U937

Par Béatrice Ray et

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Directeurs de thèse: Jean Rommelaere Claude Szpirer Janvier 1998

JLB - DBM

iBUOTHEQUE

Remerciements

remercier

Je tienKteut d'abord à'dire merci à Jean Rommelaere pour m'avoir dis que je-peu-vats veniF 1ææi^^«\au sein de son laboratoire.

acceptée sans hésiter^

Et surtout, d'avoir cru en l'apoptose.

Faire une thèse à l'étranger a beaucoup d'avantages, on est amené à rencontrer pendant plus de quatre ans des gens venus de tous les horizons, on peut jouer aux touristes sans quitter le pays, être un exilé quelque peu privilégié. Il y a cependant une chose terriblement insupportable, c'est de dire aurevoir à ceux qui s'en vont avant d'y passer soi-même le jour du grand départ.

Je voudrais donc remercier chacune des personnes qui m'ont apporté leur aide, leur amitié, leur humour, leur gaité ou que sais-je encore. La liste est longue ce qui me permet de n'oublier personne.

Merci à toutes les créatures d'Heidelberg qui ont peuplé mon univers pendant ces longues années:

Nathalie, toujours à l'écoute, qui s'emballe et a l'esprit qui s'échauffe, si l'anticorps avait fonctionné on aurait pu faire une super expérience, c'est too Bad; Laurent, je n'oublierai jamais la tortilla, ni les rollers dailleurs, encore moins le boeuf en Daube et les filets mignons

au curry, j'en salive encore, yehyehyehyehyeh; Romu, qu'un jour je battrai au jeux, n'importe lequel, il faut qu'il voye, NF k B et PKCÇ, le début d'un grand papier, il y aura-t-il jamais une fin?;

Jean-Marc, lecture, musique, cinéma, gourmet-ise, quatre points de repères, quatre points

partagés, c'est maintenant que je voudrais tester Erb-A!; Manos, le Piano et la Nocturne, j'ai fini par les choper, tiens, la nuit blanche de ma thèse, je t'ai pas vu arriver?; Patricia, le quarto de repères est le même, on pourrait faire un quintet avec nos tendances de social-gauchisantes;

Rémy, la levure allemande, c'est mon truc dans le pain et la bière, mais sous le microscope des eucaryotes supérieurs..., ta volonté de mordre la vie à pleine dents est une leçon d'humilité;

Herr Doktor Jurgen, solidaires dans notre combat anti-sergent-chef, nous voilà mieux armés pour affronter l'avenir?; Ursula, toujours si souriante entre les mutants et les Elisa, alors poulette ca boume?; The man knocking at the door, oye man you are cool, this is a joke, you get it, Tarig? Bouaah; Gaelle, alors le retour au pays? et les soirées au coin du feux? dans une maison normande, heu pardon bretonne; Marcel, échanges de cultures européennes, il fait caillante, Rrrotop, j'ai 30 ans et c'est mon lit; Marie-Laure, qui arrive quand je m'en vais; Jan, acceptant mon révisionisme historique: la Belge envahissant la paillasse hollandaise; Albin, dont la langue fourche parfois quand on s'emballe au UNO; Ginette, une cave d'enfer peuplée non de vins mais de cartons en tout genre; Laurence, un petit caf entre deux mattings?; François, encore plus mauvais perdant que moi au 1830, c'est dire!!; Ainsi que...Andréas B, Andréas H, Esther, Alexandra, Celina, Pol, Bernd, Leon, les Sabines, Jüerk, Valérie, Kurt, Steffen, Gu, Ran, Nathalia, Rita, Kristiane (avec un K), Vie, Birgit, Katja, Ellen, Eleni, Eli, Ebi, ïCris, Annabel, Aurora, Michèle, ...

Mais aussi, les labos de Jüerg Schleoffer, Jurgen Kleinschmitt, Alex Bürckle, Massimo

Tomassino.

Merci à Alex Bürckle qui m'a sortie du tunnel en me fournissant l'anticorps PARP.

Je voudrais aussi remercier Thierry Levade et Nathalie Andrieu pour m'avoir accueillie dans leur laboratoire toulousin et pour m'avoir appris l'ABC de la quantification des lipides, Stéphane du même laboratoire pour nos discussions sur la qualité du vin du Langued'oc et sur la misère du monde. Laurence et Denis qui m'ont offert le gîte et le cassoulet de Toulouse pendant ces deux semaines de stage.

Un grand merci aux membres du labo de Bruxelles (Anne, Perrine, Suzaime, Marcel, Annick fatima...) pour leurs discussions et leur soutien.

Merci aux créatures Bruxelloises qui ont suivi mon périple depuis la Capitale,

Sophie et Manu, Marie-Véro, Tilou, Erika, Nathalie; mes amies de toujours, Céline et Manu (on se voit une fois par an mais ça en vaut chaque fois la peine), Amal (on se voit

probablement encore moins, mais on se retrouvera toujours), Zoé (encore une exilée, de Barcelona aux Pays Basques)...

Et enfin, un merci tout particulier à tous les membres de ma famille, qui m'ont supportée pendant toutes ces années, Maggy, Pierre, Marc, Béran, Eisa, Didier, Anne, Gauthier, Dounia, Sehna, Lena et le petit dernier Virgil. Je ne pourrai jamais remercier comme je le voudrais ma maman toujours à l'écoute de mes colères, de mes angoisses et de mes joies, qui m'a aussi plus que soutenue financièrement.

Bref, une thèse est toujours une expérience avec ses bons et mauvais cotés, j'espère

conserver en mémoire les premiers et m'endurcir grâce aux seconds.

à ma famille

Les enfants commencent tous par la métaphysique, les adolescents continuent par la morale, et nous, les adultes,

nous finissons dans la logique et la comptabilité

Daniel Pennac, Messieurs les enfants.

Abréviations

MVMp Minute Virus of Mice souche prototype

AAV Adeno Associated Virus

NS (-1 ou -2) Non Structural protein 1 et 2

MOI Multiplicity of Infection

pfu plaque forming unit (particule infectieuse)

p.i. post infection

TPA 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate

PARP Poly(ADP-Ribose)Polymerase

TNF-a Tumor Necrosis Factor-a

TNFRI Tumor Necrosis Factor Receptor I

PCD Programmed Çell Death

ICE Interleukine-16 Çonverting Enzyme

AIF Apoptsis Inducing Factor

DFF DNA Fragmentation Factor

DED Death Effector Domain

FADD Fas Associated Death Domain

ROS Reactive Oxygen Species

NF k B Nuclear Factor kappa B

TRADD TNF-a Receptor I Associated Death Domain

RAIDD Rip-Associated Ich-l/CED-3 Death Domain

TRAF TNF-a Receptor Associated Factor

DAG Diacylglycérol

PA Phosphatidic Acid

PC phosphatidylçholine

SPM sphyngomyeline

SPMase sphyngomyelinase

1

I. Introduction

1. La famille des Parvoviridae... 1

1.1. Taxonomie...1

1.2. Le cycle de vie des parvovirus autonomes... 3

1.3. Relation parvovinis/cellules transformées... 7

1.4. Conclusions... 11

2. La mort cellulaire programmée ou apoptose... 12

2.1. Le cytoplasme, orchestre de la valse mortelle... 13

2.2. Superfamille du récepteur au TNF-a... 23

2.3. Virus et apoptose... 27

2.4. c-Myc, une protéine à l’intersection de la prolifération, de la différenciation et de la mort cellulaire... 28

Il Objectifs 1. Objectifs du travail... 36

2. Présentation du système cellulaire étudié... 37

III. Résultats 1. Sélection et caractérisation de clones U937 résistant à la cytotoxicité du parvovirus H-1... 38

1.1. Introduction... 38

1.2. Résumé... 38

1.3. Article 1:... 39

1.4. Résultats annexes liés à l’article 1...51

1.5. Discussion... 53

2. Cytotoxicité du parvovirus H-1: Induction d’une mort cellulaire par apoptose... 55

2.1. Introduction... 55

2.2. Sensibilité de la lignée U937 au parvovirus H-1... 55

2.3. Mort cellulaire par Apoptose...55

2.4. Les protéines non structurales: médiatrices de l’apoptose...57

2.5. Accumulation des protéines de la Famille Bcl-2...58

2.6. Les parvovirus autonomes induisent le clivage internucléosomique de l’ADN dans des fîbroblastes 58 2.7. Interconnexion possible entre les voies de signalisation intracellulaire du virus H-1 et du TNF-o69 2.8. Conclusions... 60

3. Résultats complémentaires... 61

3.1. Clivage de la Phosphatidylcholine (PC) et de la Sphingomyéline (SPM) après infection par le virus H-1...61

3.2. Implication possible du facteur NF

B dans la résistance des clones RU au TNF-a...62

3.3. Mise en évidence d’un complexe ADN-NF

B spécifique aux clones RU... 63

rv. Discussion 1. Les parvovirus H-1 et MVMp induisent une mort cellulaire apoptotique dans différentes lignées cellulaire 64 2. Lyse cellulaire et apoptose... 65

3. La mort cellulaire apoptotique: le point de vue viral... 65

4. Comparaison avec d’autres virus... 66

5. Mécanisme(s) et voie(s) de signalisation possible(s) de la mort apoptotique induite par les parvovirus... 67

5.1. Les protéines NS induisent l’apoptose... 67

5.2. Parallélisme possible avec l’action du TNF-a... 69

5.3. Activation possible du facteur NF

B dans les clones RU... 71

6. Modèle hypothétique d’action du virus H-1 dans les cellules U937... 72

V. Perspectives 1. Activation cytoplasmique de la mort cellulaire... 74

1.1. Implication de la protéine NS-1...74

1.2. Implication de la protéine NS-2...74

1.3. Implication des Caspases... 74

2. Etude du mécanisme de résistance des clones RU au TNF-a et au virus H-1... 75

2.1. Implication possible d’un complexe NF

B... 75

2.2. Isolement de gènes de résistance au TNF-a... 75

VI. Annexe 1. Matériel...76

1.1. Lignées cellulaires... 76

1.2. Virus...76

1.3. Tampons... 76

Il

1.4. Anticorps...77

2. Méthodes...78

2.1. Infection des cellules... 78

2.2. Extraction de TARN total...78

2.3. Extraction de l’ADN de petit poids moléculaire par la méthode d’extraction de Hirt...78

2.4. Transfert de Northern et Southern...79

2.5. Extraction des protéines et „Western Blotting“...79

2.6. Marquage de l’ADN cellulaire par le colorant Hoechst... 79

2.7. Transfection des cellules par la méthode du DEAE-Dextran...79

2.8. Mesure quantitative de la phosphatidylcholine et de la sphingomyéline par marquage des cellules

à la choline tritiée... 80

VU. Références

I. Introduction

1

1. La famille des Parvoviridae

L’intérêt fondamental et clinique suscité par les parvovirus repose sur la subordination de leur cycle lytique à des fonctions cellulaires dont l’expression dépend de l’état de prolifération et de différenciation de la cellule hôte. Cette dépendance complète aux fonctions cellulaires de l’hôte fait que les parvovirus autonomes ont généralement un spectre limité de cellules cibles et d’actions pathogéniques, du moins chez l’animal adulte. La transformation néoplasique de diverses cellules de mammifères, en particulier humaines, s’accompagne fréquemment d’une modification de leur sensibilité à l’attaque par certains parvovirus. Ces parvovirus, en particulier MVMp (Minute Virus of Mice, „le petit virus de la souris, souche prototype") et H-1 (Hamster osteolytic virus 1), montrent une activité remarquable d’oncosuppression in vivo et d’oncolyse in vitro. L’étude des mécanismes sous-jacents aux effets oncol 5 diques des virus MVMp et H-1 constitue la thématique majeure de notre laboratoire.

1.1. Taxonomie

Les Parvoviridae sont de petits virus non enveloppés de structure icosaédrique possédant un ADN simple-brin. La famille des Parvoviridae est divisée en deux sous-familles définies sur la base de l’hôte naturel des différents membres, à savoir, les Densovirinae et les Parvovirinae qui infectent respectivement invertébrés et vertébrés. Chaque sous-famille est elle-même divisée en différents genres possédant des caractéristiques propres telles que la dépendance ou non de virus coinfectants, la polarité du brin d’ADN préférentiellement encapsidé et la nature des séquences palindromiques (Pringle, 1993).

A. Densovirinae

Les parvovirus des invertébrés ont à l’origine été nommés densovirus (densonucleosis virus) pour les distinguer des parvovirus de vertébrés. Les hôtes arthropodes de ces virus comprennent des représentants de la classe des Insecta (Lepidoptera [Papillons], Diptera [mouches et moustiques], Orthoptera [criquets], Dictyoptera [blattes] et des Odonata [libellules] ainsi que de la classe des Crustacea (Decapoda [crevette, langoustine, crabe]

(Tijssen and Bergoin, 1995). Bien que les Densovirinae partagent certaines caractéristiques

physico-chimiques et des homologies de séquence avec les Parvovirinae, la biologie cellulaire

des vertébrés et des invertébrés a généré une évolution séparée de la stratégie d’expression de

ces virus, ce qui justifie la classification en sous-familles. Par ailleurs, la plupart des

Densovirinae se propagent dans pratiquement tous les tissus de l’hôte infecté

indépendamment de leur état de prolifération (Tijssen et al., 1990).

2

B. Parvovirinae

La sous-famille des Parvovirinae est divisée en trois genres: les Dependovirus, les Erythrovirus et les Parvovirus Autonomes.

Le genre Dependovirus ou AAV (Adeno Associated Virus, nomination provenant de leur isolation initiale comme contaminants des préparations d’adénovirus) regroupe les parvovirus qui dépendent de la présence d’un „virus aidant“ pour pouvoir accomplir leur cycle viral, généralement un adénovirus ou un virus Herpès (Carter, 1990). Cette dépendance vis à vis d’un virus aidant n’est cependant pas absolue puisque le traitement des cellules par certains carcinogènes, par l’irradiation aux UV ou autre stress génotoxique, peut induire un cycle viral complet (Bantel Schaal, 1993; Walz et al., 1992; Yakinoglu et al., 1988). En l’absence de tout activateur du cycle viral, l’ADN parvoviral s’intégre en un site spécifique du génome cellulaire (Kotin et al., 1990; Linden et al., 1996). Une caractéristique fondamentale des AAV est leur absence complète de pathogénicité pour l’homme. Au contraire, il semble qu’ils puissent exercer une activité anti-tumorale (Bantel Schaal, 1995; Hermanns et al., 1997;

Hermonat, 1991), essentiellement sur des cellules transformées suite à leur infection par les adénovirus ou les virus herpès, deux auxiliaires des AAV (Ostrove et al., 1981).

Le genre Erythrovirus ne comprend à l’heure actuelle qu’un membre reconnu, le virus B19, seul parvovirus pathogène pour l’homme. Un parvovirus simien (SPV) récemment découvert est fortement similaire au B19 et est sans doute à inclure dans ce genre (Brown et al., 1995;

O'Sullivan et al., 1994). Le cycle viral de B19 est conditionné par l’état de prolifération et de différenciation des cellules hôtes, constituées principalement par les cellules précurseurs de la lignée érythroïde. Le virus B19 est l’agent causal de la 5ème maladie infantile (erythema infectiosum) (Kerr, 1996; Young, 1996), d’un syndrome rhumatismal chez l’adulte (Anderson and Torok, 1989) et peut causer des anémies sévères chez des patients immunodéficients tels que les personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine ou atteints d’anémie hémolytique (Anderson, 1990). L’infection par le virus B19 est également associée à des avortements spontanés (Rogers et al., 1993). Le récepteur au virus B19 a été identifié (Brown et al., 1993). Il s’agit de l’antigène P de l’érythrocyte (glycolipide neutre globoside).

Le genre Autonomes (parvovirus), qui inclut la majorité des parvovirus décrits à ce jour, est

ainsi nommé parce que les virus de ce genre ne requièrent pas de coinfection par un virus

aidant. Cependant, leur cycle de vie est entièrement dépendant de facteurs cellulaires qui sont

exprimés en fonction de l’état de prolifération et de différenciation de la cellule hôte, ce qui

restreint la population de cellules pouvant servir de cibles à ces virus. De nombreuses cellules

sont réfractaires à l’infection parvovirale, essentiellement par inadéquation du milieu

intracellulaire à la poursuite du cycle viral. Ces limitations confèrent une grande spécificité à

la pathogénie parvovirale. Les parvovirus autonomes sont la cause d’un certain nombre de

maladies intervenant essentiellement durant le développement embryonnaire et chez les jeunes

animaux, alors que l’adulte est rarement affecté par une infection parvovirale (Jacoby and

Ball-Goodrich, 1995). La destruction des tissus foetaux et néonatals en prolifération rapide est

une caractéristique de l’infection parvovirale, et l’apparition dans les embryons de souris de

cellules résistantes à MVM indique que des contraintes à la multiplication virale apparaissent

probablement en fonction de l’état de différenciation (Mohanty and Bachmann, 1974). Au

cours du développement vers l’état adulte et de l’acquisition de tissus hautement différenciés,

il y a passage d’un état de sensibilité à un état de résistance aux parvovirus. D’autre part, ces

virus infectent une variété d’espèces de mammifères (souris, rat, chien, chat, vison, porc...).

3

Les parvovirus de souris comprennent le virus MVM (Crawford, 1966) qui comporte deux souches, la souche prototype infectant essentiellement les fibroblastes (MVMp) et un variant allotropique (MVMi) infectant spécifiquement les lymphocytes et exhibant des activités immunosuppressives in vivo (Maxwell et al., 1995; Segovia et al., 1991); un parvovirus murin sérologiquement différent de MVM et nommé MPVl and 2 (Mouse Parvovirus strain 1 and 2), qui partage avec MVMi une prédilection pour les tissus lymphoïdes (Jacoby and Ball- Goodrich, 1995). Les virus de rat regroupent le Rat virus ou Kilham rat virus (Tennant and Hand, 1970), le virus H-1 (Greene and Karasaki, 1965) et le RPV-1 (Rat Parvovirus 1, [Ueno et al., 1997]). Bien que reconnu comme étant originaire du rat, une séropositivité pour le virus H-1 a également été trouvée dans la population humaine (Toolan et al., 1965). Les génomes des virus de rat présentent une forte homologie avec ceux de souris, essentiellement dans la partie codant pour les protéines non structurales.

1.2. Le cycle de vie des parvovirus autonomes

A. Du récepteur au noyau

L’infection productive d’un parvovirus est initiée par l’adsorption du virion sur un récepteur cellulaire de surface spécifique. La nature exacte de ces récepteurs est à l’heure actuelle inconnue. La capside parvovirale a un diamètre d’environ 20 nm et est formée par trois protéines de structure, qui sont, pour le virus H-1, VP-1 (86 kDa), VP-2 (68 kDa) et VP-3 (65 kDa). VP-1 et VP-2 sont produites à partir d’un épissage alternatif d’un ARN messager commun, alors que VP-3 est formée par un clivage post-traductionnel d’une séquence N- terminale de la protéine VP-2 (Kongsvik and Toolan, 1972; Paradiso et al., 1984). Les proportions de chaque protéine de capside participant au virion mature varient d’un parvovirus à l’autre, bien que VP-2 soit généralement la protéine dominante. L’internalisation du virus semble être médiée par la formation de „coated pits“ (Linser et al., 1979), mais les mécanismes exacts par lesquels le virus pénètre au sein de la cellule et dans le noyau sont actuellement inconnus. L’ADN simple brin étant absent du cytoplasme, la décapsidation doit probablement avoir lieu dans le noyau, mais aucune étude à l’heure actuelle ne propose un modèle du mécanisme utilisé. Ces premières étapes du cycle viral ne dépendent pas d’une phase particulière du cycle cellulaire (Linser et al., 1979), tandis que l’efficacité de la réplication de l’ADN et de l’expression génique est dépendante d’une ou plusieurs fonctions cellulaires exprimées de manière transitoire durant la phase S du cycle (Tattersall, 1972). Il est probable que l’un des tout premiers événements qui ont lieu en début de phase S soit la synthèse du brin d’ADN complémentaire créant ainsi un modèle duplex pour la transcription virale.

B. Organisation du génome

Les membres de la famille des Parvoviridae sont uniques par l’originalité de leur génome constitué d’un ADN linéaire simple brin. Le génome des particules parvovirales infectieuses contient une région codante simple brin d’environ 4 à 6 kb, terminée à chaque extrémité par une séquence palindromique (de 121 à 421 bp) qui est capable de se replier en structure dite

„en épingle à cheveux" („hairpin“, [Astell, 1990; Cotmore and Tattersall, 1987]) (Fig. 1). En

3’, cette structure contient une „bulle“ créée par un non-appariement entre les nucléotides 25 à

50

AO, ^/

'Q 40 30

^^Gr^^GTCALkcGTCACTrtcGT^ACATlBGTTGGTCAGVTCTAAAAATa’

20 10

60 \Jr

AGTGTGCAGTGAACGCA ' T /A^G

80 90 ^

TGTACCAACCAGTCAAGAI I I I IACTATTCGCCA5’

I I I

100 110 120

Figure 1: Structure en épingle à cheveux de l'extrémité 3' du génome du virus H-1.

4

26 et 88 à 91, caractéristique retrouvée chez les parvovirus des rongeurs. Certains parvovirus encapsident indifféremment des brins positifs ou négatifs (sens défini par rapport à la transcription) alors que d’autres, dont MVM et H-1, n’encapsident sélectivement que des brins négatifs. L’organisation génomique des virus MVM et H-1 est très similaire et les protéines non structurales NS-1 des virus H-1 et MVM sont à 91.4% identiques. Les

„hairpins“ contiennent la plupart des informations en cis pour la réplication et l’encapsidation.

Bien qu’ayant un rôle central dans le processus de réplication, la complexité et la diversité de ces „télomères“ suggèrent qu’ils servent aussi à d’autres fonctions dans le cycle parvoviral, en particulier la modulation du promoteur précoce P4 (Cotmore and Tattersall, 1987).

C. Modèle de réplication jolling hairpin“ de l’ADN parvoviral

Le processus réplicatif de l’ADN simple brin parvoviral est un mécanisme de réplication ressemblant à celui du „rolling circle“ décrit pour les procaryotes (Cotmore and Tattersall, 1987; 1995). L’amplification du génome parvoviral passe par une forme multimérique qui sera ultérieurement résolue en monomères. Les extrémités palindromiques jouent un rôle essentiel dans ce modèle puisque leur structure en „épingle à cheveux" sert d’amorce à la synthèse unidirectionnelle de l’ADN (Fig. 2). Après décapsidation de l’ADN parvoviral, l’extrémité palindromique 3’ fournit une amorce pour la synthèse du brin complémentaire (1).

L’extrémité 3’ est liée de manière covalente à la terminaison 5’ formant alors une molécule d’ADN double brin continue (2). La forme intermédiaire de réplication ainsi créée permet l’expression des gènes viraux, notamment de la protéine NS-1 requise pour les étapes ultérieures de la réplication, et des gènes de capside. NS-1, de part son activité endonucléase, coupe l’ADN parvoviral en amont du site de ligation, donnant une extrémité 5’ associée à NS-1 de manière covalente et une extrémité 3’ possédant une terminaison OH libre servant d’amorce à l’ADN polymérase (3). NS-1 serait responsable de la formation d’une fourche réplicative unidirectionnelle initiée au site de clivage, permettant la duplication du palindrome 5’ (4 et 5) et générant une forme réplicative monomérique (mRF). Les structures palindromiques peuvent alors se réassocier formant une structure dite en „oreilles de lapin"

apte à réamorcer un nouveau cycle de réplication (6 et 7), ce qui génère une forme dimérique

dans laquelle le palindrome 3’ se trouve en position médiane (le „pont dimère") et le

palindrome 5’ se retrouve aux deux extrémités (8 et 9). La résolution des formes

multimériques intermédiaires en formes monomériques à partir desquelles l’ADN parvoviral

simple brin sera synthétisé, est une étape dépendante de l’activité endonucléase de la protéine

NS-1. Deux formes monomériques sont formées (14a et 14b). L’une peut se réinsérer dans le

cycle à l’étape 5-6 (14c), ce qui permet une amplification des produits réplicatifs, l’autre sert à

la synthèse d’ADN simple brin de la descendance virale qui est encapsidé quasi

simultanément (15). La protéine NS-1 est associée à l’extrémité 5’ du brin encapsidé (16). En

plus de la protéine NS-1, la réplication de l’ADN parvoviral requiert la présence de facteurs

cellulaires tels qu’une ADN polymérase, probablement la forme delta (Christensen et al.,

1997; Cossons et al., 1996), bien qu’une participation des polymérases alpha et gamma ait été

proposée (Kollek et al., 1982), la topoisomérase I (Gu and Rhode, 1991), ainsi qu’un facteur

nouvellement identifié nommé pif pour „parvovirus initiator factor" qui interviendrait lors de

la coupure par NS-1 au niveau des ponts dimères (9) (Christensen et al., 1997). L’implication

d’autres facteurs cellulaires est actuellement en cours d’étude.

Figure 2: Modèle de réplication "rolling circle" du génome du parvovirus autonome MVM.

D'après Cotmore et Tattersall, 1987, 1995. AB-bleu (palindrome 3'); EFG-rouge (palindrome 5');

N (NS-1); V (brin viral parental); c (brin viral complémentaire); les flèches représentent le sens

de l'élongation.

5

D. Transcription et activité du promoteur P4

Le génome parvoviral, porteur d’une information génétique restreinte, est très compact et le mécanisme d’épissage alternatif est utilisé par les Parvovirus afin d’augmenter leur capacité codante grâce à des phases de lecture chevauchantes (Pintel et al., 1995). Les régions codantes de MVMp et H-1 sont situées sur le brin complémentaire au brin encapsidé, ce dernier étant appelé par convention le brin négatif (Cotmore and Tattersall, 1987). Deux promoteurs ont été identifiés au sein du génome des parvovirus autonomes, le P4 et le P38 (Fig. 3). Le promoteur précoce P4 situé à l’extrémité gauche du génome viral, régule la production des transcrits RI et R2 qui codent pour les protéines NS. Le promoteur tardif P38 contrôle la formation des transcrits R3 codant pour les protéines de capside VP (Cotmore and Tattersall, 1987). Les promoteurs P4 et P38 sont définis d’après leur position en unités géniques (1 u.g.: 1% de la longueur du génome) (Rhode and Iversen, 1990). Le niveau d’activité du promoteur P4 dépend de l’état de permissivité de la cellule hôte (Cornelis et al., 1990; Spegelaere et al., 1991), alors que le promoteur P38 dépend fortement de l’activité transactivatrice de la protéine NS-1 (Christensen et al., 1995; Lorson et al., 1996). Le cycle de vie des parvovirus dépend de facteurs cellulaires exprimés en phase S du cycle cellulaire. Cependant, les parvovirus sont incapables de faire entrer en phase S des cellules quiescentes. La multiplication de ces virus est donc retardée jusqu’à ce que la cellule hôte initie elle-même la réplication de son génome. Etant donné que le génome parvoviral transféré dans les cellules cibles est un simple brin linéaire, la synthèse du brin complémentaire est supposée précéder l’expression des gènes parvoviraux (Tullis et al., 1994). Le promoteur P4 est activé lors de la transition Gl/S, essentiellement via le site de liaison du facteur E2F qui occupe une position proximale dans le promoteur P4 (Deleu et al., 1998). Le promoteur P4 est également régulé par une variété de facteurs nucléaires incluant les facteurs de transcription USF et NF-Y (Gu et al., 1995), Ets (Fuks et al., 1996), ATF/CREB (impliqués dans l’activation du P4 par l’oncogène Ha-ras [Perros et al., 1995]) et Spl/3 (Ahn et al., 1989; Fuks et al., 1996; Pitluk and Ward, 1991) (Fig. 4). Le promoteur P38 a une activité constitutive très faible, essentiellement médiée par les boîtes GC et TATA, et est fortement induit par la protéine NS-1 qui se fixe sur une séquence en cis appelée tar (transactivation responsive élément, [Ahn et al., 1992; Christensen et al., 1995; Lorson et al., 1996]).

E. Protéine NS1

La protéine NS-1 est codée par un seul exon et est retrouvée sous deux formes (84 et 88 kDa,

la forme 88 kDa étant phosphorylée), après migration électrophorétique dans un gel

d’acrylamide (Iversen and Rhode, 1990). La protéine NS-1 est essentiellement nucléaire

(Cotmore and Tattersall, 1986; Nuesch and Tattersall, 1993; Rhode and Paradiso, 1989) et

possède de multiples activités biochimiques nécessaires aux différentes étapes du cycle

parvoviral (Fig. 5): fixation et hydrolyse de l’ATP, liaison covalente et non-covalente à

l’ADN (Nuesch et al., 1995), activité hélicase (permettant la formation et la maintenance de la

fourche réplicative), activité endonucléase sur l’ADN viral (Cotmore et al., 1995; Nuesch et

al., 1995) et cellulaire (Op De Beeck and Caillet Fauquet, 1997). La protéine NS-1 possède

dans sa région C-terminale, un domaine d’activation de la transcription (Krady and Ward,

1995; Legendre and Rommelaere, 1994) et régule positivement et négativement les deux

promoteurs viraux P4 et P38 (Lorson et al., 1996). La protéine NS-1 peut former des

oligomères (Nuesch and Tattersall, 1993; Pujol et al., 1997), ce qui semble être primordial

pour ses différentes fonctions (Pujol et al., 1997), et elle peut interagir avec d’autres protéines

P38 r*^

T 1

P4 (—'---r—

0 25

map units

RI R2 R3

50 75 100

Ns-1 r ■ ■ ~n

NS-2 m]

VP-1 D

D

VP-2

Figure 3: Organisation génomique des parvovirus autonomes de rongeurs.

Les trois cadres ouverts de lecture sont représentés par des couleurs différentes.

ï I i

a) Eléments de régulation

Figure 4: Eléments de régulation du promoteur précoce P4 du virus MVM.

Régulation de la réplication

Figure 5: Activités biochimiques de la protéine multifonctionelle NS-1 impliquées

dans la régulation de la transcription et de la réplication, et supposées prendre

part à la cytotoxicité. D'après Vanacker et Rommelaere, 1995.

6

telles que le facteur de transcription SPl (Krady and Ward, 1995). Plusieurs sites de liaison de NS-1 à l’ADN [(ACCA)l-3] ont été identifiés dans le génome parvoviral, en particulier dans les origines de réplication et les promoteurs (Cotmore et al., 1995). NS-1 est en effet requise pour la réplication de l’ADN viral et la régulation de l’initiation de la transcription (Vanacker and Rommelaere, 1995). La protéine NS-1 est considérée comme médiatrice de la cytotoxicité des parvovirus mais les mécanismes sont peu connus (voir point I.3.C.). La protéine NS-1 reste associée à l’extrémité 5’ du génome lors de l’encapsidation et se retrouve à l’extérieur du virion mature, ancrée par une courte région de la séquence „hairpin“, nommée „l’attache“

(Cotmore and Tattersall, 1989). Celle-ci est éliminée lors de l’entrée du virion dans la cellule.

L’élimination de la protéine NS-1 in vitro avant l’infection des cellules n’affecte en rien l’infectivité du virus, ce qui suggère un rôle pour NS-1 dans l’encapsidation et/ou l’exportation du virion mais pas dans l’infectivité du virion néosynthétisé (Cotmore and Tattersall, 1989).

F. Protéines NS-2

La protéine NS-2 des virus de rongeurs est codée par deux exons, l’exon 1 codant pour le domaine N-terminal de NS-1 et l’exon 2 localisé à l’extrémité C-terminale du gène NS-1, mais traduit dans une autre phase de lecture (Jongeneel et al., 1986). Les polypeptides NS-2 possèdent une V

vie courte, ont un poids moléculaire apparent de 25 à 28 kDa, sont essentiellement cytoplasmiques et synthétisés en grand nombre de copies précocement après l’infection (Cotmore and Tattersall, 1990). Ces protéines ont une séquence N-terminale commune avec NS-1 et possèdent trois isoformes, majeure, mineure et rare suivant leur taux de détection, pour MVM (Cotmore and Tattersall, 1990), ou deux isoformes pour H-1 (Iversen and Rhode, 1990). Il n’est pas connu si ces isoformes ont des fonctions différentes ou redondantes. Les protéines NS-2 ne sont requises pour une infection productive que dans des cellules de l’hôte naturel du virus considéré (cellules de rat pour H-1 [Li and Rhode, 1991], cellules de souris pour MVMp [Cotmore et al., 1997; Naeger et al., 1990; Naeger et al., 1993;

Cater and Pintel, 1992]), ce in vitro aussi bien qu’in vivo (Li and Rhode, 1991). Toutefois, la protéine NS-2 est nécessaire pour assurer une efficacité d’infection maximale et une cytolyse complète lors de l’infection d’autres types de lignées cellulaires (Legrand et al., 1993; Li and Rhode, 1991). La protéine NS-2 du virus MVMp (isoformes majeure et mineure) peut s’associer, dans toutes les cellules hôtes testées, à des membres de la famille des protéines cellulaires ubiquitaires 14.3.3 (Brockhaus et al., 1996). Etant donné l’association de ces protéines à d’autres polypeptides impliqués dans la transduction des signaux (par exemple certaines isoformes de la PKC) et/ou la régulation du cycle cellulaire, la protéine NS-2 pourrait connecter le cycle viral à ces voies intracellulaires via leur interaction avec les protéines 14.3.3. Cependant, le rôle exact de cette interaction est encore matière à spéculation.

L’implication des protéines 14.3.3 dans la régulation du phénomène d’apoptose, via son

interaction avec la protéine Bad, pourrait également être une source de contrôle par la protéine

NS-2 (voir point 2.1 .C.c.).

7

G. Protéines de capside et encapsidation

Les protéines structurales VP sont non seulement les constituants de la capside virale, mais elles dirigent également le processus d’encapsidation qui se déroule simultanément à la synthèse des molécules d’ADN simple brin au sein du noyau (Tullis et al., 1993). La restriction d’hôte d’un parvovirus est due à la présence d’un déterminant allotropique situé dans la séquence de la protéine de capside VP-2 (Maxwell et al., 1995). Les protéines structurales sont phosphorylées (Santaren et al., 1993). Cette modification post-traductionelle intervient probablement dans la maturation des virions néosynthétisés. La libération des particules virales néosynthétisées se fait essentiellement par lyse des cellules, mais des mécanismes d’exportation en absence de destruction cellulaire, peuvent avoir lieu (Koering et al., 1996; Salomé et al., 1989; Telerman et al., 1993). Il semble donc que la production de particules infectieuses puisse être dissociée de la mort cellulaire.

1.3. Relation parvovirus/cellules transformées

L’association fréquente des parvovirus et des néoplasmes a conduit initialement à envisager la possibilité d’une activité oncogène de ces agents. Cependant il semble que la localisation préférentielle des parvovirus dans les lésions néoplasiques (oncotropisme) reflète plutôt une relation opportuniste que causale, suggérant que ces virus possèdent un potentiel antitumoral résultant de leur interférence avec l’induction de la transformation maligne aussi bien qu’avec la survie ou la prolifération des cellules néoplasiques. Le terme d’oncosuppression est utilisé pour caractériser l’activité antitumorale in vivo des parvovirus, alors que la notion d’oncolyse s’applique à la lyse préférentielle, au sein de cultures in vitro, des cellules transformées (Rommelaere, 1990; Rommelaere and Comelis, 1991).

A. Oncosuppression

Certains parvovirus possèdent la remarquable capacité de prévenir la formation de tumeurs spontanées (Toolan, 1967) ou induites par une fonction virale (Bergs, 1969; Toolan and Ledinko, 1968) ou un agent chimique (Toolan et al., 1982) chez des animaux de laboratoire.

Des tumeurs, transplantées à des animaux receveurs, sont les cibles de l’activité

antinéoplasique des parvovirus, la croissance des cellules cancéreuses étant inhibée par ces

agents (Dupressoir et al., 1989; Guetta et al., 1986). Ainsi, la formation de tumeurs chez des

souris adultes nues („nude/nude“) soumises à l’implantation de cellules transformées

humaines provenant de l’épithélium mammaire, est fortement inhibée, soit après coinjection

des cellules tumorales et du virus, soit après injection du virus dans le site d’implantation

avant l’apparition des tumeurs (Dupressoir et al., 1989) (Fig. 6A). L’infection des animaux

après l’apparition des tumeurs mène également à une régression de leur progression, voire à

une réversion complète des tumeurs dans certains cas (Fig. 6B). Ces observations montrent

que le virus H-1 peut exercer une action anticancéreuse préventive et partiellement curative

contre des transplants de cellules tumorales chez des souris nues. Certaines observations

expérimentales supportent l’idée que les parvovirus interagissent directement avec au moins

une fraction des cellules transformées. Bien que les mécanismes de l’oncossupression in vivo

soient peu connus à ce jour, il est intéressant de constater que des empreintes de la réplication

du virus ainsi que des protéines virales sont détectées dans certaines tumeurs en régression

A.

Pas de tumeur

Tumeur Régression

de la tumeur

Figure 6: Activité d'oncosuppression du virus H-1 dans des souris Nues (voir texte).

D'après Dupressoir et collalxyrateurs, 1989; Rommelaere, 1990.

8

(Dupressoir et al., 1989). Il semble d’autre part que les parvovirus soient inefficaces comme inducteurs des interférons, du TNF-a (Tumor Necrosis Factor a; [Schlehofer et al., 1992;

Wiedbrauk et al., 1986a, 1986b]) ou comme activateurs des cellules NK (Natural fâller;

[Rommelaere and Cornelis, 1991]). Il est donc fort probable que la capacité des parvovirus à interagir directement avec les cellules néoplasiques contribue à l’inhibition de l’oncogénèse, bien qu’il soit difficile de déterminer quelle est la part des autres mécanismes possibles. Il est en effet probable que l’oncosuppression parvovirale fasse intervenir le système immunitaire, par suite de la présence d’antigènes viraux sur une fraction des cellules tumorales (Guetta et al., 1986). Cependant les études faites avec des souris nues montrent que le virus peut induire une régression tumorale dans des conditions où le système immunitaire n’est pas fonctionnel.

B. Oncolyse

Une variété de lignées cellulaires phénotypiquement normales et résistantes à l’infection parvovirale, deviennent sensibles à la cytotoxicité du virus après leur transformation par différents carcinogènes de nature physique, chimique ou virale (Chen et al., 1989; Cornelis et al., 1988; Legrand et al., 1992; Mousset et al., 1986; Mousset and Rommelaere, 1982; Salomé et al., 1989). Ceci suggère que la transformation néoplasique peut induire ou activer des facteurs cellulaires impliqués dans le cycle parvoviral. H a été observé que la sensibilisation des cellules FR3T3 et NHI3T3 dépend de l’oncogène transformant (Salomé et al., 1990). En effet, bien que la transformation par les oncogènes v-myc, v-src ou le virus SV40 mène à un accroissement important de la sensibilité des cellules à l’effet lytique du virus MVMp, la transformation par le virus du papillome bovin de typel ne modifie pas la résistance originelle des cellules. De plus, la transformation incomplète et réversible induite par le TP A (12-0- tetradecanoyl2horbol-13-acetate) dans des cellules fibroblastiques n’est pas suffisante pour accroître significativement la permissivité des cellules au virus MVMp (Mousset and Rommelaere, 1988). De même, si la transformation des lignées FR3T3 et NIH3T3 par l’oncogène Ha-ras les sensibilise à l’effet lytique du virus MVMp, ce n’est pas le cas pour des lignées de kératinocytes humaines HaCat et des cellules rénales de rat NRK (Chen et al., 1989; Van Mille et al., 1989). H semble donc qu’il n’y ait pas de corrélation absolue entre la transformation néoplasique et la sensibilité aux parvovirus, et que l’amplitude de la mort cellulaire induite par les parvovirus varie suivant l’agent transformant utilisé et l’hôte cellulaire considéré. L’activité oncostatique et/ou oncolytique des parvovirus ne se limite pas aux lignées transformées in vitro, mais ces effets peuvent également être observés sur des cultures non établies et fraîchement extraites de tumeurs humaines (Van Pachterbeke et al.,

1993).

C. Les protéines NS, effectrices majoritaires de ia cytotoxicité parvovirale

Plusieurs expériences réalisées in vitro sur des cultures cellulaires indiquent que les

parvovims inhibent l’induction et/ou la maintenance d’un phénot 5 q)e transformé dans des

conditions où seules des interactions directes entre virus et cellules transformées (ou leur

précurseurs) sont possibles. Les mécanismes par lesquels les protéines NS exercent leur effet

cytopathique sont probablement associés, du moins en partie, aux perturbations de différents

processus cellulaires causées par ces protéines (Becquart et al., 1993). L’expression de la

protéine NS-1 dans des fibroblastes transformés de rat en prolifération, perturbe le cycle

9

cellulaire et mène à une accumulation des cellules en phase G2 (Op De Beeck et al., 1995), ce qui montre qu’en plus d’une activité cytotoxique, la protéine NS-1 peut exercer un effet cytostatique et perturber le cycle cellulaire (Oleksiewicz and Alexandersen, 1997; Op De Beeck et al., 1995; Van Pachterbeke et al., 1993). Les protéines NS inhibent la transformation cellulaire stable par de l’ADN exogène (Brandenburger et al., 1990; Legendre and Rommelaere, 1992; Rhode, 1987) ainsi que l’amplification de séquences d’ADN hétérologue (Tenenbaum et al., 1993). Dans des expériences de cotransfection, l’expression de NS-1 cause la suppression de la transcription dirigée par différents promoteurs hétérologues (Brandenburger et al., 1990; Faisst et al., 1993; Legendre and Rommelaere, 1992; Vanacker and Rommelaere, 1995). Une étude génétique de mutants de la protéine NS-1 a montré que la capacité à réprimer des promoteurs coségrège avec la cytotoxicité de la protéine, ce qui plaide en faveur d’une participation de cette activité aux perturbations cellulaires occasionnées par l’infection parvovirale (Legendre and Rommelaere, 1992). La protéine NS-1 peut aussi activer la transcription, sa cible principale étant le promoteur tardif P38 du virus lui-même. La partie C-terminale de la protéine est requise pour cette stimulation (Legendre and Rommelaere, 1994). A ce jour, un seul promoteur cellulaire a été identifié comme étant activé par la protéine NS-1 dans des expériences de cotransfection (Vanacker et al., 1996; Vanacker et al., 1993). Ce promoteur dirige la transcription du gène c-erbAl codant pour le récepteur a de l’hormone thyroïdienne (THRa, Thyroïde Hormone Receptor a). L’expression du gène c- erbAl endogène est activée lors de l’infection des cellules FREJ4 (cellules FR3T3 transformées par un oncogène Ha-ras activé), sensibles à MVMp, alors que les cellules FR3T3 ne montrent pas cette induction de la THRa. Ces observations ont conduit à suggérer que la protéine NS-1 pourrait activer des gènes cellulaires dont les produits contribuent à sa cytotoxicité. En effet, la mort des cellules transformées FREJ4 semble dépendre de la présence de l’hormone thyroïdienne. Dans certains systèmes cellulaires, l’hormone thyroïdienne T3 exerce une activité antiproliférative et/ou différentiative (Schroeder et al., 1992), et le produit du gène c-erbAl peut induire l’apoptose (Gandrillon et al., 1994). La manière dont NS-1 module l’expression des promoteurs homologues ou hétérologues est actuellement peu définie. La protéine possède dans sa partie N-terminale un domaine d’activation de la transcription (Legendre and Rommelaere, 1994) et il a été montré qu’elle doit directement se lier à la séquence tar du promoteur p38 pour y exercer son activité transcriptionelle (Christensen et al., 1995; Lorson et al., 1996). L’effet négatif que NS-1 exerce sur une majorité de promoteurs hétérologues semble être médié par un mécanisme indirect (Gu et al., 1992), tel que la séquestration de facteur(s) essentiel(s) pour l’activité du promoteur, une hypothèse étayée par la capacité de NS-1 à interagir avec des facteurs de transcription tels que SPl (Krady and Ward, 1995).

De façon générale, un parallélisme peut être établi entre la sensibilité aux parvovirus et

l’accroissement de la capacité cellulaire à soutenir certaines étapes du cycle parvoviral (Chen

et al., 1986; Comelis et al., 1988; Comelis et al., 1990; Legrand et al., 1992). Le niveau de

production des protéines NS est augmenté dans certaines cellules transformées sans que la

capacité de ces dernières à amplifier l’ADN viral soit modifiée de façon significative

(Comelis et al., 1990; Dupressoir et al., 1989). C’est le cas des cellules de rat FRET, dont la

sensibilisation à MVMp s’accompagne d’un accroissement de l’activité du promoteur P4

dirigeant l’expression de l’unité de transcription NS (Comelis et al., 1988; Spegelaere et al.,

1991). Une conséquence directe de cette activité supérieure du promoteur P4 est

l’accumulation de grandes quantités de protéine NS-1. De plus, une corrélation a pu être

établie entre les quantités de protéine NS-1 produites par les différents clones FREJ et leur

degré de sensibilité à la mort cellulaire induite par le parvovims, ce qui suggère que la

concentration intracellulaire en NS-1 pourrait constituer un des facteurs limitants de la

cytopathogénicité. Dans leur ensemble, ces observations suggèrent que la transformation

10

oncogénique rend les cellules aptes à produire des quantités suffisantes de polypeptides NS pour que la mort cellulaire puisse avoir lieu (Van Hille et al., 1989).

Toutefois, les quantités relatives en protéines NS-1 ne peuvent pas toujours expliquer la sensibilité préférentielle des cellules transformées à l’action toxique des parvovirus, et un effet additionnel de la transformation doit être considéré, tel que la sensibilisation des cellules cibles à l’effet toxique d’un niveau donné de protéines NS. En effet, la transformation accroît l’activité toxique des protéines NS (Mousset et al., 1994). Cette observation a été montrée au moyen d’un système d’expression inductible des protéines NS ou de la protéine NS-1 seule, permettant de produire les polypeptides indépendamment de l’état de transformation (Fig. 7).

Dans ce système, les dérivés transformés sont détruits par les protéines NS (ou NS-1 seule) à des quantités inoffensives pour les cellules normales correspondantes. En effet, l’accumulation intracellulaire des produits NS n’est pas suffisante pour tuer des fibroblastes de rat de la lignée cellulaire FR3T3. Par contre, si ces cellules subissent une transformation par l’introduction stable d’un oncogène activé, la même quantité de protéines NS mène à la mort cellulaire. Ces observations montrent que la protéine NS-1 n’est pas létale tant que des facteurs cellulaires dépendant de l’expression oncogénique n’enclenchent pas sa cytotoxicité.

D reste à déterminer comment agissent les modulateurs intracellulaires de la cytotoxicité de NS-1. Ceux-ci peuvent agir à différents niveaux, par exemple induire des modifications de la protéine NS-1, constituer des cibles de l’activité de NS-1 ou encore être des (co)facteurs de la mort cellulaire induite par la protéine virale. La sensibilité des cellules à la cytotoxicité du virus semble donc être déterminée non seulement par la capacité des cellules à produire les protéines non structurales NS-1 et NS-2, mais aussi par leur réponse intrinsèque à un taux donné de ces protéines.

D. Limites de i’oncosuppression

Des tumeurs peuvent apparaître en dépit de la présence de parvovirus. Une cause possible de

cette évasion de la surveillance parvovirale peut provenir d’une incompatibilité entre la

tumeur et le tropisme viral. L’importance de la réponse antitumorale peut également être

limitée par la quantité initiale de virus présent sur le site de la lésion néoplasique, par une

production locale inefficace de nouvelles particules ou par la réponse du système immunitaire

de l’hôte contre l’infection virale. Ces restrictions expliquent pourquoi les premiers essais

cliniques utilisant le virus H-1 sauvage n’ont pas abouti à une réversion de la tumeur ciblée,

un ostéosarcome avancé, disséminé et résistant aux thérapies conventionnelles. Son

développement était probablement beaucoup trop avancé par rapport à la quantité de virus

inoculée aux patients (Toolan et al., 1965). Le potentiel thérapeutique des parvovirus comme

agents anticancéreux nécessite que les facteurs cellulaires, modulant la multiplication

parvovirale, soient définis et que le mode cytotoxique de ces virus soit établi. Certains

parvovirus semblant être complètement inoffensifs pour l’homme, l’utilisation de parvovirus

autonomes recombinants constitue une nouvelle approche de la thérapie génique du cancer

(Dinsart et al., 1996). En effet, l’oncotropisme de ces parvovirus et leur absence de

pathogénicité apparente pour l’homme, combinés à l’expression de gènes thérapeutiques

hétérologues, pourraient constituer un outil puissant pour le traitement du cancer.

Cellule normale

Survie

T r ansfectant-N S1 transformé

T Mort cellulaire

Figure 7: La mort cellulaire induite par NS-1 dépend de la transformation. D'après

Mousset et collaborateurs, 1994; Vanacker et Rommelaere, 1995. DEX

NS-1

11

1.4. Conclusions

Les connaissances des modes d’action de la protéine NS-1 est requise pour la compréhension

de la relation particulière que les parvovirus autonomes H-1 et MVMp entretiennent avec les

cellules hôtes transformées. Notre travail nous a mené à aborder ce vaste terrain d’étude par

l’analyse de variants cellulaires issus d’une lignée tumorale et résistants à l’effet oncolytique

du virus H-1. L’une des questions encore non résolues était le rôle de la mort cellulaire

programmée lors de l’infection des cellules néoplasiques par les parvovirus autonomes. Des

études déjà anciennes décrivent des modifications cellulaires de nature apoptotique après

infection par le virus H-1, mais à une époque où la notion d’apoptose n’était pas encore

connue (Leary and Storz, 1980; Singer and Rhode, 1978). A ce jour, une mort apoptotique n’a

été rapportée que pour le virus B19 du genre érythroïde (Morey et al., 1993). Etant donné

l’importance de ce phénomène de mort cellulaire dans la physiologie d’un organisme et dans

diverses infections virales, une partie de notre travail a consisté à évaluer le potentiel

apoptotique du virus H-1 sur les cellules tumorales prémonocytaires U937.

12

2. La mort cellulaire programmée ou apoptose

Définition

La mort cellulaire programmée (Programmée! Çell Death, PCD) est une mort génétiquement contrôlée, active et nécessitant de l’énergie (Schwartzman and Cidlowski, 1993). Les termes de PCD et d’apoptose sont généralement utilisés de manière interchangeable, bien que le premier ait une connotation de prédestination génétique et que le deuxième soit lié à des modifications morphologiques bien déterminées et décrites pour la première fois par Wyllie et collaborateurs en 1980 (Wyllie et al., 1980). Les termes d’apoptose et de PCD seront cependant utilisés indifféremment dans ce manuscrit pour dénommer une mort cellulaire génétiquement contrôlée.

Fonction

La PCD est une mort physiologique, intervenant dans beaucoup de situations où la mort cellulaire est bénéfique au bon fonctionnement de l’organisme. L’apoptose joue un rôle important dans la morphogenèse (ex: élimination des branchies et des membranes interdigitales lors de l’embryogenèse des mammifères, élimination des neurones excédentaires lors de la formation du cerveau, [Jacobson et al., 1997]), dans le remodèlement des tissus (ex:

alternance [„turnover“] des cellules, maintien de l’équilibre homéostatique des cellules du système hématopoïétique) et dans l’établissement d’une tolérance immune du soi (Golstein et al., 1991). L’apoptose peut aussi être induite par les cellules T cytotoxiques, l’irradiation y ou UV, une infection virale, une absence de facteurs de croissance, des cytokines (TNF-a, ligand Pas soluble) et une variété d’agents pharmaceutiques (White, 1996). Une mort apoptotique inappropriée conduit à des maladies dégénératives telles que les maladies de Parkinson et d’Alzheimer (Carson and Ribeiro, 1993) alors que la résistance à l’apoptose peut contribuer à l’établissement d’infections virales persistantes (induites, par exemple, par les virus Epstein- Barr et adénovirus) et à la transformation néoplasique (lymphomes de cellules B manifestant une surexpression de l’oncogène bcl-2 [Fisher, 1994; Williams, 1991]).

Phénotype

Morphologiquement, l’apoptose se détecte par la condensation et la fragmentation de la chromatine, la rupture du réseau des lamines, la destruction du cytosquelette, le rétrécissement de la cellule, le bourgeonnement (blebbing) des membranes plasmique et nucléaire, l’externalisation des phosphatidylsérines et, finalement, par la fragmentation de la cellule en corps apoptotiques qui seront phagocytés par les cellules environnantes et/ou des macrophages s’infiltrant dans les tissus (Fig. 8). Ce processus de nettoyage des cellules en voie de disparition et la capacité de ces dernières à conserver leur intégrité membranaire jusqu’à la phagocytose, évitent la dispersion de leur contenu. Une réponse inflammatoire qui serait délétère pour l’organisme dans certaines conditions telles que la morphogenèse ou le développement du système immunitaire, est ainsi prévenue.

Les acteurs

Les acteurs génétiques responsables de la mort cellulaire programmée sont hautement

conservés au cours de l’évolution des organismes. Des gènes homologues et/ou analogues

sont retrouvés aussi bien chez Caenorabditis elegans ou chez la drosophile, que dans divers

virus. La régulation moléculaire de l’apoptose est généralement divisée en trois étapes: i) la

phase initiale d’accusation où la cellule reçoit un signal externe de mort cellulaire; ii) la phase

intermédiaire du jugement où intervient la régulation interne par les membres de la famille des

Apoptose

Figure 8: Comparaison apoptose/nécrose. Lors de la mort cellulaire apoptotique,

le noyau et le cytoplasme se condensent pour former des corps apoptotiques,

à la différence du processus de nécrose durant lequel la cellule perd le contrôle

de l'intégrité membranaire, se dilate et finit par éclater.

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protéines Bcl-2 et d’autres facteurs tels que les lAPs (Inhibitory Apoptosis Protein^, c-Myc, p53, Rb... Très peu d’informations sont disponibles concernant ces deux premières phases; il n’y a pas de modifications morphologiques marquantes et leur durée est très variable; iii) la phase terminale d’exécution (généralement considéré comme le point de non retour), médiée par une série de protéases c)^oplasmiques et probablement par des facteurs de la mitochondrie, pendant laquelle les caractéristiques morphologiques et biochimiques typiques de la mort cellulaire programmée apparaissent. La phase dite d’exécution est très rapide (de l’ordre de la V

heure) (Eamshaw, 1995). Ces différents niveaux de contrôle rendent l’étude de l’apoptose relativement difficile, mais ces dernières années, un nombre important et croissant de travaux ont permis de mieux comprendre le phénomène. Si une large variété de stimuli peut induire la mort cellulaire programmée, il semblerait que les voies de signalisation parallèles rejoignent un tronc commun.

Comparaison nécrose/apoptose

A la différence de l’apoptose, la nécrose se caractérise par un gonflement des mitochondries, la perte de l’intégrité de la membrane plasmique et une absence apparente de dommages aux noyaux. La nécrose est considérée comme un phénomène de dégénérescence passive, induite par une agression physique ou chimique directe et généralement accidentelle. Dans certaines situations physiologiques et lors de la réception de certains signaux de mort cellulaire, l’absence d’un stock énergétique au sein de la cellule (sous forme d’ATP) pourrait mener celle-ci sur la voie de la nécrose plutôt que de l’apoptose (Eguchi et al., 1997).

2.1. Le cytoplasme, orchestre de la valse mortelle.

Plusieurs travaux montrent que l’apoptose peut être déclenchée dans des cellules anucléées ou cytoblastes (Jacobson et al., 1994; Schulze Osthoff et al., 1994; Nakajima et al., 1995). Il est maintenant bien établi qu’une voie cytoplasmique peut fonctionner indépendamment du contrôle nucléaire. Il est même proposé que ce soit le cytoplasme lui-même qui orchestre la désintégration du noyau (Enari et al., 1995; Lazebnik et al., 1993; Martin et al., 1995;

Newmeyer et al., 1994) (Fig. 9). Ces observations tendent à montrer que tous les facteurs nécessaires au programme de mort cellulaire sont présents au sein du cytoplasme et que leur activité est bloquée jusqu’à la réception d’un signal activateur. Différents composants cytoplasmiques entrent en ligne de compte tels que la mitochondrie, les protéases de la famille des Caspases et les membres régulateurs appartenant aux familles des protéines Bcl-2 et lAPs.

A. Les Caspases

L’apoptose étant un processus de mort cellulaire, l’engagement apoptotique mène à une

dégradation contrôlée et complète de la cellule et de ses constituants. Les protéases y jouent

un rôle central puisqu’elles sont responsables de la quasi totalité de la dégradation ciblée des

protéines essentielles à la vie cellulaire. Un groupe majeur de protéases à été identifié chez les

vertébrés sur la base de leur homologie au gène ced-3 (çell death defective) de C. elegans, un

des gènes responsables de la mort cellulaire chez ce nématode. Ces protéases ont récemment

été renommées „Caspases“ (Alnemri et al., 1996) (Tableau 1).

■>

Pro-caspase ΠClivage

L cytochrome c

O

4P

Caspase active Apoptosis

Inducing Factor

Pro-caspase | ^

Clivage

Caspases amont"

TT—n

U

Caspase active

Caspases "en aval"

Nucléaires

PARP DNA-PKc Lamines Ul-70kDa RF-C

Cytosquelettiques Fodrine

Actine Gas-2 Gelsoline

Facteurs de signalisation intracellulaire PKC-5

PKC-

SREBPs D4-GDI MEKK-1

PITSLRE Kinases

Produits de

gènes antiapoptotiques

Huntingtin Rb

Figure 9: Voies d'activation des caspases dépendant, ou non, d'un contrôle mitochondrial.

AlF (Apoptosis Inducing Factor), c (cytochrome c)

Famille des protéases de type Caspase

Sous-famille Ced-3

Caspase-7 (Mch3, ICE-LAP3, CMH-1) Caspase-3 (CPP32, Yama, Apopain) Caspase-6 (Mch2)

Caspase-8 (MACH, FLICE, Mch5) Caspase-10 (Mch4)

Sous-famille Nedd-2 Caspase-2 (ICH-1)

Caspase-9 (ICE-LAP6, Mch6) Sous-famille ICE

Caspase-5 (ICErel-III, TY)

Caspase-4 (XX, ICH-2, ICErel-II) Caspase-1 (ICE)

Tableau 1: Caspases identifiées à ce jour.

D'après Alnemri et collaborateurs, 1996;

Chinnaiyan et Dixit, 1996.

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a. Nomenclature et description

Les enzymes appartenant à la famille des „ICE (Interleukine-16 Çonverting Enzymes)-like cystein proteases" sont maintenant regroupées sous le nom générique de Caspases (Alnemri et al., 1996) pour cystein aspartate specific-proteases. les deux caractéristiques fondamentales de ces protéases étant la présence d’une cystéine au sein du site catalytique (séquence d’acides aminés QAÇRG) et celle d’un acide aspartique adjacent au site de clivage. Une glycine ou un autre acide aminé de petite taille et hydrophobe est généralement trouvé à la suite de l’acide aspartique (Munday et al., 1995; Nicholson et al., 1995; Xue and Horvitz, 1995). Une dizaine de Caspases ont été isolées à ce Jour; elles ont été numérotées suivant l’ordre chronologique de leur description (Tableau 1). Il semble que ces protéases jouent un rôle central dans le processus d’apoptose puisque leur surexpression par transfection dans des cellules de mammifères induit la mort cellulaire. Le 1er membre de la famille à avoir été décrit est l’ICE ou Caspase-1, isolé par Thomberry et collaborateurs en 1992 pour son activité protéolytique sur la pro-Interleukine-l-B (Thomberry et al., 1992). La Caspase-1 est la mieux connue des enzymes de la famille: sa structure tridimensionnelle ainsi que le fonctionnement de son site catalytique sont aujourd’hui établis (Wilson et al., 1994). Le gène homologue du C. elegans est le gène ced-3 capable d’induire l’apoptose dans des cellules de mammifères, ce qui montre la forte conservation des voies de transduction de la mort cellulaire au cours de l’évolution (Miura et al., 1993).

b. Spécificité et activité des Caspases

La surexpression de chacune des Caspases dans des cellules de mammifères peut initier la mort cellulaire par apoptose (Miura et al., 1993). Bien qu’elles soient indicatives de la fonction de ces protéases, ces études doivent être interprétées avec circonspection. En effet, l’activité protéolytique des Caspases exogènes pourrait infliger à la cellule un dommage qui enclencherait alors une réponse apoptotique exécutée seulement par des enzymes endogènes.

Deux approches permettent d’étudier plus finement le rôle de chacune des Caspases dans le processus apoptotique: l’utilisation d’inhibiteurs et la construction de souris „knockout“. En effet, si la famille des Caspases remplit un rôle essentiel dans l’exécution de la mort cellulaire programmée (Enari et al., 1995; Los et al., 1995), il semblerait que chaque Caspase prise individuellement ne soit pas essentielle et qu’une forte redondance existe entre elles. En effet, des études récentes montrent que des cellules dérivées de souris ,4cnockout“ pour la caspase-1 (Kuida et al., 1995; Li et al., 1995) et la caspase-3 (Kuida et al., 1996) se comportent normalement en ce qui concerne l’induction de la mort cellulaire par de nombreux agents.

Bien qu’un rôle central ait été attribué à la Caspase-1 dans la voie d’apoptose activée par le récepteur Fas/APOl, cette enzyme ne semble pas essentielle à d’autres morts programmées (Kuida et al., 1995). Ainsi, des cellules dérivées de souris „knockout“ pour la caspase-1 restent sensibles à tous les inducteurs d’apoptose testés excepté l’antigène Fas/Apol.

Cependant, il est important de signaler que ces souris ne présentent pas le phénotype Ipr (qui

résulte de l’absence de sélection négative médiée par Fas/Apol lors, du développement du

système immunitaire), ce qui voudrait dire qu’m vivo, une autre Caspase entrerait en jeu lors

de l’activation du récepteur. L’étude des souris „knockout“ pour la caspase-3 montre

l’importance fondamentale de cette protéase pour la mort cellulaire programmée ayant lieu

durant le développement morphogénique du cerveau (Kuida et al., 1996): un excès de cellules

neurales est observé, les cellules surnuméraires étant dans une phase post-mitotique et

normalement différenciées; cette caractéristique est partagée par les souris „knockout“ pour la