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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Hubert, L. (2001). Modulation par l'interleukine-10 des hépatites expérimentales (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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FACULTE DE MEDECINE

MODULATION PAR L’INTERLEUKINE-10 DES HEPATITES EXPERIMENTALES

HUBERT LOUIS

LABORATOIRE DE GASTROENTEROLOGIE EXPERIMENTALE

ULB - Campus Erasme

Bibliothèque de Médecine - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)

B- 1070 Bruxelles Tél.; 02/555.61.70

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre académique de Docteur en Sciences Médicales

2001

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

FACULTE DE MEDECINE

MODULATION PAR L’INTERLEUKINE-10 DES HEPATITES EXPERIMENTALES

HUBERT LOUIS

LABORATOIRE DE GASTROENTEROLOGIE EXPERIMENTALE

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre académique de Docteur en Sciences Médicales

2001

Marc Parmentier, Président Jacques Devière, Secrétaire Marc Abramowicz

Jean Content Françoise Mascart Experts étrangers :

Gisa Tiegs (Erlangen)

Philippe Mathurin (Paris)

Résumé de la thèse annexe

Rôle de l’interleukine-S et des éosinophiles dans les hépatites aiguës

Des polynucléaires éosinophiles sont observés sur des coupes histologiques de foie

dans de nombreuses maladies hépatiques, mais leur contribution dans la physiopathologie des

lésions hépatiques reste peu étudiée. Dans le modèle expérimental d’hépatite induite par

l’injection de concanavaline A (Con A), nous avons observé une infiltration du parenchyme

hépatique par des polynucléaires éosinophiles. Cette constatation nous a conduit à étudier

dans ce modèle le rôle de l’interleukine-5 (IL-5), une cytokine critique pour la maturation et

l’activation des éosinophiles. Les souris déficientes en IL-5 développent une hépatite

nettement moins sévère que leurs congénères sauvages après injection de Con A. On observe

par ailleurs une protection similaire chez des souris prétraitées par un anticorps neutralisant

riL-5 ou des souris déplétées en éosinophiles Nous avons par la suite montré que les voies

Fas/FasL et EL-5/éosinophiles sont deux voies majeures d’hépatotoxicité dans ce modèle,

l’hépatite étant pratiquement abolie après neutralisation de l’IL-5 chez des souris Fas

déficientes. Enfin, les lymphocytes T naturellement tueurs (cellules NKT) sont une source

critique d’IL-5 dans ce modèle, comme le suggèrent des expériences de transfert cellulaire

chez des souris dépourvues de cellules NKT Ces observations soulignant le rôle pathologique

de l’IL-5 et des éosinophiles dans ce modèle expérimental nous amènent à étudier cette voie

de la cascade inflammatoire dans les phénomènes d’hépatotoxicité aiguë chez l’homme. Cette

question sera approchée en étudiant d’une part les dosages sériques et l’expression hépatique

de l’EL-5 et de l’éotaxine, une chimiokine également impliquée dans le recrutement tissulaire

et l’activation des éosinophiles, sur des biopsies hépatiques de patients souffrant d’hépatites

aiguës de causes diverses, et d’autre part, la mise en évidence des polynucléaires éosinophiles

et de leurs produits de dégranulation par des techniques immunohistochimiques. La

neutralisation de l’IL-5 et de l’activation des éosinophiles pourrait ainsi trouver une

application clinique potentielle dans certains phénomènes d’hépatotoxicité aiguë comme le

rejet aigu d’allogreffe hépatique ou les hépatites médicamenteuses.

Rôle de rinterleukine-5 et des éosinophiles dans les hépatites aiguës

Remerciements

Ce travail résulte de la collaboration de toute une équipe composée d'un entourage qui m’a été précieux durant ces années de recherche.

Mes remerciements iront tout d'abord à Jacques Devière et à Olivier Le Moine, pour leur enthousiasme, leur disponibilité sans limite et leur nombreux conseils.

La réussite de ces travaux n'aurait pas été possible sans l'aide précieuse d'Eric Quertinmont, toujours prêt à réaliser quelque dosage de cytokines.

Pour des raisons diverses, je tiens aussi à remercier Michel Goldman, pour m’avoir acceuilli dans le Laboratoire d’immunologie Expérimentale au début de mes recherches, ainsi que Jean-Luc Van Laethem, Myriam Delhaye, Paul Galand, Marie-Odile Peny et Albert Geerts pour leurs conseils et le temps qu’ils ont consacré à des discussions fructueuses. Je tiens aussi à exprimer ma gratitude à Marie-Line Vanderhaeghen, Zoulikka Amraoui et Chantal Degraef pour leur aide technique et pour m’avoir initié aux techniques de laboratoire.

Fi.nalement, les bourses de la Fondation Erasme et de la Fondation Horlait-Daepsens m'ont permis de réaliser ces travaux en m'écartant temporairement de l'activité clinique.

Ce qui complique tout, c'est que ce qui n'existe pas s'acharne à faire croire le contraire

Michel Tournier

en

TABLE DES MATIERES Page

Liste des abréviations 7

Résumé du travail 9

I. Introduction 10

1. Généralités 10

2. Mécanismes de mort cellulaire 12

2.1 Nécrose et apoptose 12

2.2 Le facteur de nécrose tumorale (TNF) 13

2.3 La voie Fas/FasL 16

. Les cellules impliquées dans les phénomènes d'hépatotoxicité 17

3.1 Introduction 17

3.2 Les cellules de Kupffer 17

3.2.1 Fonction 17

3.2.2 L'endotoxine 19

3.2.3 Le chlorure de Gadolinium 21

3.3 Les cellules étoilées 22

3.4 Les cellules sinusoïdales endothéliales 22

3.5 Les polynucléaires neutrophiles 24

3.6 Les lymphocytes T 24

3.6.1 Introduction 24

3.6.2 Activation des lymphocytes 25

3.6.3 Les lymphocytes cytotoxiques 26

3.7 Les plaquettes 27

4. Les cytokines 27

4.1 Introduction 27

4.2 Le concept Th 1/Th2 29

4.3 Cytokines pro-inflammatoires 29

4.3.1 TNF-a 29

4.3.2 IFN- y 30

4.3.3 IL-1 31

4.3.4 IL-2 31

5

4.3.5 IL -6 31

4.3.6 IL-12 32

4.3.7 IL-15 32

4.3.8 IL-18 32

4.4 Cytokines anti-inflammatoires 33

4.4.1 IL-4 33

4.4.2 IL-10 33

4.4.2.1 Production, source cellulaire et structure 33

4.4.2.2 Propriétés anti-inflammatoires 35

4.4.2.3 Propriétés pro-inflammatoires 39

4.4.3 IL-11 39

4.4.4 IL-13 39

4.4.5 Le transforming growth factor-P 40

4.4.5.1 Production, source cellulaire et stmcture 40

4.4.5.2 Actions 40

4.5 Les chimiokines 42

4.6 L'oxyde nitrique (NO) 42

5. Réparation cellulaire 44

5.1 Activation de facteurs de transcription 44

5.2 Rôle du TNF-a et de l'IL -6 dans la régénération hépatique 46

5.3 Fibrose 47

6 . Modèles expérimentaux d'hépatotoxicité 48

6 .1 Hépatite induite par injection de galactosamine/lipopolysaccharide 48

6.2 Hépatite induite par la concanavaline A 50

6.3 Hépatite induite par le tétrachlorure de carbone 52

II. Buts du travail 54

III. Résultats 55

I. Rôle hépatoprotecteur de l'IL-10 dans le modèle 56 d'hépatite induite par injection de galactosamine/lipopolysaccharide

chez la souris

Production et rôle de l'IL-10 dans le modèle d'hépatite induite par la concanavaline A chez la souris

2 . 65

3. L'IL-10 contrôle la réponse inflammatoire, la prolifération 75 cellulaire et la fibrose hépatique dans le modèle d'hépatotoxicité

induite par le tétrachlorure de carbone (CCI 4 ) chez la souris

IV. Discussion et perspectives 87

1. Le TNF comme médiateur central de l’hépatotoxicité: 87 la cible majeure de l'IL-10?

2. Le chlorure de gadolinium et la source cellulaire d'lL-10 89 3. L'IL-10 limite la réponse proliférative des hépatocytes 91

4. L’IL-10, une cytokine antifibrotique 92

5. Perspectives concernant l'IL-lO en thérapeutique humaine: 96 quelles maladies hépatiques?

5.1 Hépatite fulminante 96

5.2 Hépatite alcoolique aiguë et cirrhose éthylique 98 5.3 Syndrome de réponse inflammatoire systémique 99

5.4 Hépatites virales chroniques 99

5.5 Effets secondaires potentiels 101

V. Références 103

Liste des abréviations

Ac : anticorps

a-MSH: alpha mélanocyte stimulating hormone cAMP ; adénosine mono-phosphate cyclique ARNm ; acide ribonucléique messager ATP : adénosine triphosphate

CCI4 : tétrachlorure de carbone CK: cellules de Kupffer

CSE: cellules sinusoïdales endothéliales Con A : concanavaline A

Gai : galactosamine

GdCls : chlorure de gadolinium GSH : glutathion réduit

HF : hépatite fulminante

HGF : hépatocyte growth factor HSP70 : beat shock protein de 70 kDa ICAM-1 : intercellular adhesion molécule-1 ICE: interleukin-1 f converting enzyme IFN : interféron

IL: interleukine JAK : Janus kinase

LBP: lipopolysaccharide binding protein LPS: lipopolysaccharide

MCP-1 : monocyte chemoattractant protein-1 MIP-2: macrophage inflammatory protein-2 NFAT : nuclear factor for activated T cells NO : oxyde nitrique (monoxyde d’azote)

PAC AP: pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide P AF: platelet activating factor

PCNA : proliferating cell nuclear antigen PDE IV : phosphodiestérase de type IV PGE2 : prostaglandine E2

PMN: polymorphonucléaires neutrophiles

TGF-P : transforming growth factor fi

VCAM-1: vascular cellular adhesion molecule-l

VIP: vasoactive intestinal peptide

9

RESUME DU TRAVAIL

L’inflammation observée au cours des hépatites se complique fréquemment de fibrose et de cirrhose dans sa phase finale. Le seul traitement efficace chez les malades en cirrhose terminale est la transplantation hépatique, mais la relative pénurie d’organes disponibles face à une demande toujours croissante rendent plus que Jamais indispensables un traitement précoce des hépatopathies et une prévention de la fibrose. La compréhension des mécanismes immunologiques sous-jacents passe par le développement et l’étude de modèles expérimentaux chez l’animal. L’interleukine-10 (IL-10) est une cytokine anti-inflammatoire puissante produite notamment au niveau du foie. Nous avons étudié d’une part le rôle biologique de l’IL-10 sécrétée de manière endogène dans trois modèles expérimentaux d’hépatite aiguë chez la souris, et d’autre part l’effet thérapeutique potentiel de l’IL-10 dans ces modèles. Tout d'abord, dans un modèle d'hépatite par activation mono-macrophagique induite par injection de galactosamine et de lipopolysaccharide, la neutralisation de l’lL-10 sécrétée de manière endogène aggrave les lésions de nécrose hépatique alors qu’une administration exogène d’lL-10, même après l’induction de l’hépatite, permet de limiter les lésions observées au niveau du foie. Le même effet protecteur de T IL-10 a été observé dans un modèle d'hépatite aiguë par activation lymphocytaire, après injection de concanavaline A.

Dans ces 2 modèles, T IL-10 limite la production de cytokines pro-inflammatoires. Enfin, dans

le modèle d’hépatite induite par le tétrachlorure de carbone, nous avons abordé le rôle de l’IL-

10 par le biais de souris déficientes en IL-10. Deux propriétés nouvelles de T IL-10 au niveau

du foie ont été suggérées, à savoir une modulation de la prolifération hépatocytaire et du

développement de la fibrose hépatique.

LINTRODUCTION

1. Généralités

Les maladies hépatiques peuvent être divisés en processus aigus ou chroniques. Les causes les plus fréquentes des hépatites aiguës dans nos pays sont représentées par les virus et les agents toxiques (dont les médicaments) pour lesquels il n'existe le plus souvent aucun traitement spécifique (Table 1) (1). L'expression la plus grave en est l'hépatite fulminante (HF), dont la mortalité reste très élevée (80-90%) si une transplantation hépatique n'est pas réalisée en urgence (2). Le pronostic de THF s'est amélioré au cours des 25 dernières armées par la qualité de la prise en charge en soins intensifs (3). Il est ainsi possible de traiter diverses complications telles que l'œdème cérébral, l'hypotension, l'insuffisance rénale aiguë, les troubles de la coagulation, l'hypoglycémie et les troubles ioniques. Néanmoins, d'autres traitements permettant d'attendre une transplantation ou de l'éviter sont toujours souhaitables. Si les hépatites aiguës moins graves liées aux causes toxiques régressent souvent spontanément après arrêt du toxique, il n'en va pas de même pour les hépatites virales liées aux virus de l’hépatite B (HBV) et C (HCV) et pour les hépatopathies auto-immunes, chez lesquelles un processus inflammatoire chronique, cliniquement souvent silencieux, va progressivement détruire le parenchyme hépatique qui sera remplacé par un tissu fibreux cicatriciel et finalement mener à la cirrhose. C'est alors seulement qu'apparaissent chez ces malades les symptômes de cachexie, d'ictère, d'ascite, de troubles de la coagulation, caractéristiques de la cirrhose. La cirrhose représente la 7®*^^ cause de mortalité par maladie et affecte des centaines de millions de personnes dans le monde (4). A ce stade, le seul traitement curatif consiste à remplacer l'organe malade en réalisant une transplantation hépatique. Cependant, vu le nombre limité d'organes disponibles face à une demande qui ne fera que croître dans les aimées à venir, notamment suite à l'augmentation de cirrhoses dues au virus HCV (5), il est indispensable de prévenir l'évolution de ces maladies vers la cirrhose. Ceci passe notamment par la prévention des hépatites virales (la vaccination par exemple) mais aussi par la recherche de nouveaux traitements pour les hépatites. Actuellement, le traitement par interféron-a des hépatites virales liées aux virus HBV et HCV, associé à des médicaments antiviraux, n'est bénéfique au maximum que chez la moitié des malades et l'effet à long terme est incoimu.

Les mécanismes immunologiques sous-jacents au développement des hépatites sont

aujourd'hui mieux connus. Des données convergentes montrent que la réponse immune de

l’individu joue un rôle crucial dans la pathogénie des maladies hépatiques, quelle qu’en soit leur

origine ( 6 ). Le rôle joué par des cytokines proinflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale

(TNF-a) et l'interféron-gainma (IFN-y) dans le développent de l'hépatotoxicité est actuellement établi dans des modèles animaux. Il est aussi suggéré chez l'homme où une production accrue de ces cytokines a été démontrée dans diverses maladies hépatiques. La réponse immune comprend une composante anti-inflammatoire, permettant d’éviter un emballement de la riposte pro-inflammatoire qui serait sinon délétère pour l’individu. Parmi ces médiateurs anti-inflammatoires, l'interleukine-10 est une cytokine qui est produite notamment au niveau du foie.

Dans ce travail, nous nous sommes attachés à étudier d'une part le rôle biologique de l'IL-10 sécrétée de manière endogène dans trois modèles expérimentaux d'hépatite aiguë chez la souris, faisant intervenir des mécanismes différents d'activation cellulaire, et d'autre part l'effet thérapeutique potentiel de l'IL-10 dans ces modèles.

Tableau 1

Causes d'hépatites aiguës ou fulminantes chez l'homme

Causes Toxiques

Paracétamol

Tétrachlorure de carbone Amanite phalloïde Médicaments

Cuivre (maladie de Wilson) Immunes

Virus HAV, HBV, HCV, HEV, EBV, CMV, HZV Hépatite auto-immune

Sepsis sévère

Rejet aigu de greffe hépatique Diverses

Hypoxie Congestion

Syndrome de Budd-Chiari

HELPP syndrome

2. Mécanismes de mort cellulaire

2.1 Nécrose et apoptose

Les lésions cellulaires conduisent in fine à un processus irréversible de mort cellulaire par nécrose ou apoptose, deux processus morphologiquement distincts qui, s’ils intéressent une proportion importante des cellules hépatiques, vont entraîner une dysfonction de l’organe (7).

La nécrose cellulaire (du grec nekrôsis, l'engourdissement) est définie par un dommage causant une perte irréversible des fonctions métaboliques (par exemple, les gradients ioniques transmembranaires et la génération d'adénosine triphosphate [ATP]) et de l'intégrité de la membrane plasmatique (cytolyse). Morphologiquement, la nécrose se caractérise par l'apparition d'une chromatine pycnotique, un gonflement des organelles intra-cytoplasmiques, l'apparition de "phlyctènes" au niveau de la membrane cellulaire qui finalement se rompent, libérant le contenu de la cellule (par exemple les enzymes cytosoliques aspartate aminotransférase et lactate déshydrogénase, que l'on dose en clinique humaine pour détecter et juger l'amplitude de lésions hépatiques). Le largage de constituants cellulaires induit une réponse inflammatoire pouvant amplifier les lésions tissulaires.

L'apoptose, du grec apo, loin de et ptôsis, la chute) est définie morphologiquement par une condensation progressive de la chromatine, une contraction de la cellule et finalement une fragmentation du noyau et du cytoplasme résultant en la formation de fragments cellulaires contenant des organelles intacts et décrits sous le nom de corps apoptotiques. Ces corps apoptotiques sont retrouvés dans le cytoplasme de cellules intactes, indiquant qu'ils ont été phagocytés par des cellules voisines ou des phagocytes ( 8 ). Ces corps apoptotiques sont décrits depuis longtemps en histologie, sous le nom de corps de Councilman, par exemple dans les hépatites virales où des lymphocytes cytotoxiques tuent par apoptose des hépatocytes chargés de particules virales (9). Dans l'apoptose, la membrane plasmatique reste intacte et une image caractéristique d'hydrolyse de l'ADN apparaît (image d'échelle, ladder pattern).

Les signaux menant à l'apoptose peuvent être la conséquence d'agents pathogènes ou toxiques, d'un stress oxydatif ou de l'activation de récepteurs spécifiques par des ligands tels que le TNF-a ou le FasL (10).

Pour comparer de manière imagée les deux processus, on peut résumer que dans la

nécrose la cellule est la victime innocente de stimuli toxiques, eüors que dans l'apoptose, la

cellule participe activement à sa disparition en activant im programme spécifique

d'autodestruction (suicide). Suite à un apoptose hépatocytaire massive, on peut voir ime

13

augmentation massive des transaminases, ce qui indique que les processus de phagocytose sont dépassés (11). En réalité, nécrose et apoptose sont souvent présents tous les deux en pathologie. Il est effectivement établi, par des critères morphologiques, que dans de nombreux modèles expérimentaux, les agents induisant la mort cellulaire sont capables d'induire à la fois l'apoptose et la nécrose, dans le même tissu ou la même cellule, et que l'apoptose précède souvent la nécrose (7,12-14). Durant la mort cellulaire, on assiste à une dysfonction mitochondriale par transition de la perméabilité mitochondriale (MPT, mitochondrial permeability transition) et perméabilisation des membranes des mitochondries (15). La progression ultérieure vers l’apoptose ou la nécrose dépendrait de la présence ou de l'absence d'ATP dans le cytoplasme (7,16) et de la phase du cycle cellulaire dans lequel se trouve la cellule (17,18).

Chez l'homme, les mécanismes de mort cellulaire impliqués au niveau du foie sont aujourd'hui décrits dans diverses maladies (19-23).

2.2 Le facteur de nécrose tumorale (TNF)

Initialement caractérisé sur la base de ses propriétés antitumorales et également décrit sous le nom de cachectine, en référence à ses propriétés cachectisantes, cette cytokine est produite principalement par les mono/macrophages et dans une moindre mesure par d'autres types cellulaires tels que les lymphocytes et les fibroblastes. C'est un médiateur important impliqué dans la régulation physiologique de nombreux systèmes mais aussi dans des conditions physiopathologiques. Il provoque un large spectre de réponses cellulaires, parmi lesquelles la fièvre, le choc, des lésions tissulaires, la nécrose tumorale, l'anorexie, l'induction de la synthèse d'autres cytokines et médiateurs inflammatoires, la prolifération et la différentiation cellulaire et l'apoptose (24,25).

Le TNF fait partie d'une famille de molécules apparentées comportant entre autres les

lymphotoxines LTa et LTp et le Fas ligand (FasL). Le TNF existe sous une forme

transmembranaire de 26kDa (TNFm) et une forme soluble de 17 kDa (TNFs) qui rend compte

de la majorité des effets biologiques du TNF et qui est obtenue par clivage protéolytique de la

première par une enzyme transmembranaire appelée T ACE (TNF-a converting enzyme). Le

TNF existe sous la forme d'homotrimères. Son récepteur appartient à la superfamille des

récepteurs au TNYInerve growth factor et existe sous 2 formes, le TNFRl (p55) et le TNFR2

(p75). Le TNFs interagit préférentiellement avec le TNFRl alors que le TNFm se lie avec une

meilleure affinité au TNFR2. La plupart des activités biologiques du TNF-a sont transduites

par le TNFRl, bien que beaucoup d'entre elles puissent l'être par le TNFR2, mais celui-ci est un pauvre inducteur de l'apoptose. Des formes solubles de ces récepteurs (sTNFR) bloquent l'interaction du TNF-a avec ses récepteurs et agissent donc comme antagonistes du TNF-a ou comme réservoir prolongeant son activité.

La transmission du signal par le TNFRl au niveau d’ime cellule cible est schématisée à la figure 1 (10,26,27). La liaison du TNFs sur le TNFRl trimérisé induit le recrutement de différentes protéines adaptatrices sur les domaines cytoplasmiques du récepteur. La combinaison des protéines TRADD (TNF-R-associated death domain) et FADD (Fas- associated death domain) recrutées sur le death domain du TNFR permet de transmettre un signal conduisant à l'apoptose, par activation de la caspase 8 , la transition de la perméabilité mitochondriale et le largage du cytochrome c, résultant en l'activation de la caspase 3 et d'autres caspases (des cystéine protéases). Dans les stratégies thérapeutiques potentielles de THF, bloquer l’apoptose en neutralisant les caspases est une voie qui semble prometteuse (28). FADD peut également induire la mort cellulaire par nécrose (29). La transduction du signal de TNFRl à d'autres protéines adaptatrices, TRAF {TNF receptor-associatedfactor) ou RIP {receptor interacting protein) conduit par contre à l'activation de kinases et à l'activation des facteurs de transcription AP-1 et NF-kB, impliqués dans la réponse inflammatoire et qui induisent l'expression de gènes anti-apoptotiques (30,31).

Un des stimuli le plus puissant pour la sécrétion de TNF par les macrophages est le

lipopolysaccharide (LPS) de la paroi bactérierme. In vivo, de grandes quantités de TNF

peuvent être produits dans les infections à bacilles gram négatives. In vitro, les hépatocytes

isolés sont relativement insensibles au TNF-a. Le TNF-a peut induire l'apoptose des

hépatocytes in vitro et in vivo, après un arrêt de la transcription par des poisons cellulaires tels

que l'a-amanitine, l'actinomycine D ou la D-galactosamine (32-35). Ceci implique que le

TNF-a induit un facteur protecteur qui s’oppose à l’apoptose. Des tentatives pour utiliser le

TNF comme moyen anticancéreux chez l'homme ont échoué de par l'apparition d'effets

secondaires sérieux avant que les doses thérapeutiques ne puissent être atteintes. Un des effets

du traitement avec le TNF-a consistait en une élévation des transaminases et de la bilirubine,

ce qui indiquait un rôle cytotoxique direct du TNF-a sur les hépatocytes humains (36).

15

ROS

Peroxydation lipidique

\

Activation de caspases

MORT CELLULAIRE

Figure 1 : voies de signalisation du TNF

2.3 La voie Fas/FasL

Le récepteur Fas (encore appelé CD95 ou APO-1) est constitué de 3 domaines extracellulaires riches en cystéine et un domaine intracellulaire appelé death domain. La liaison de FasL avec son récepteur entraîne la trimérisation de celui-ci et la liaison du death domain avec une protéine de liaison, FADD (pour Fas associated death domain), qui lie la caspase 8 , recrute la cascade des protéases et induit in fine l'apoptose ( 10 ) ou la nécrose (13).

La voie Fas/FasL est le mécanisme majeur de cytotoxicité des lymphocytes CD 8 , CD4 Thl et NK, qui lorsqu'ils sont activés, expriment à leur surface le FasL. Cette voie de mort cellulaire joue un rôle physiologique dans l'homéostasie et la régulation du système immunitaire (par exemple dans la délétion périphérique des cellules autoréactives ou des cellules après activation polyclonale (AICD, activation-induced cell death). Le FasL peut être clivé de la membrane cellulaire par une métalloprotéinase et exister sous forme soluble. Il peut donc agir comme une molécule cytotoxique effectrice et agir à distance de la cellule productrice

Les hépatocytes expriment de manière constitutive le récepteur Fas, qui lorsqu'il est activé par son ligand (FasL) ou par cross-linking avec un anticorps anti-Fas, induit l'apoptose.

L'injection d'un anticorps anti-Fas chez la souris induit en 2 heures une apoptose massive des hépatocytes et une hépatite fulminante mortelle (11). Une expression accrue de Fas a été décrite dans de nombreuses maladies hépatiques comme l'hépatite fulminante, les hépatites virales liées aux virus HBV et HCV, la maladie de Wilson, la cirrhose biliaire primitive et l'hépatite alcoolique (22,37-41). De même, une expression de FasL est retrouvée sur les lymphocytes infiltrant le foie. Dans l’hépatite alcoolique, affection où l’apoptose hépatocytaire semble être un des mécanismes de destmction des hépatocytes, une expression accrue de FasL est observée sur les hépatocytes eux-mêmes (41-43). Le FasL agirait ici de manière autocrine (suicide cellulaire) ou paracrine (cytotoxicité fratricide envers les hépatocytes voisins).

Enfin, outre le TNF-a et FasL, l'IFN-y , le TGF-pl et le système TRAIL {TNF-related apoptosis-inducing ligand) ont des propriété cytotoxiques directes en induisant l'apoptose.

L'IFN-y active directement des gènes impliqués dans la mort cellulaire (44) et il entraîne in

vitro l'apoptose des hépatocytes de souris (45). L'IFN-y accroît par ailleurs l'expression de Fas

au niveau des hépatocytes, entraînant une sensibilité accrue de ceux-ci à l’apoptose.

17

3. Les cellules impliquées dans les phénomènes d'hépatotoxicité

3.1 Introduction

Dans la plupart des maladies hépatiques, des infiltrats inflammatoires peuvent être mis en évidence sur des coupes histologiques de foie. Ces cellules inflammatoires contribuent au développement des lésions hépatiques soit comme élément déclenchant (par exemple dans l'hépatite auto-immune), soit comme réponse secondaire à un autre processus (comme dans l'hépatite virale). Ces cellules résident le plus souvent dans les sinusoïdes hépatiques, au contact des cellules bordant ces sinusoïdes : les cellules endothéliales et les travées d’hépatocytes (figure 2). Lors d’une réponse inflammatoire locale, d’autres cellules inflammatoires telles que des lymphocytes ou des polynucléaires peuvent être recrutées et infiltrer le parenchyme hépatique. On peut aussi distinguer les cellules du système immunitaire adaptatif qui reconnaissent des déterminants antigéniques, les lymphocytes, et les actions non spécifiques des cellules du système immunitaire inné, par exemple celles des macrophages. La compréhension des mécanismes par lesquels ces cellules contribuent aux dommages hépatiques est importante pour développer des interventions thérapeutiques permettant de moduler le processus inflammatoire.

3.2 Les cellules de Kupffer

3.2.1 Fonction

Les cellules de Kupffer (CK) sont les macrophages résidents du foie. Ils résident au

niveau des sinusoïdes hépatiques, au contact des cellules endothéliales et possèdent des

extensions cytoplasmiques dans l'espace de Disse en contact direct avec les cellules étoilées et

les hépatocytes. Ils représentent environ 30% des cellules sinusoïdales et constituent environ

80-90% des macrophages résidents chez l’homme (46). Ils possèdent une coloration

caractéristique de leur réticulum endoplasmique pour la peroxydase endogène. Comme les

autres macrophages, les CK ont trois propriétés principales: l'endocytose (avec destruction du

matériel ingéré), la présentation d'antigènes et la sécrétion de produits biologiquement actifs

(47-50). Parmi ceux-ci, citons diverses protéases, des dérivés de l'acide arachidonique

(prostaglandines et leucotriènes), des radicaux libres oxygénés, l'oxyde nitrique (NO) et

diverses cytokines. Les CK possèdent des récepteurs pour Fc et C3 et expriment des

molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (46).

Figure 2 : cellules du sinusoïde hépatique

1

19

Comme pour les autres leucocytes, la fonction primaire des CK est donc de défendre l'hôte contre l'invasion par des organismes étrangers. Cependant, leur activation peut également entraîner des lésion tissulaires au niveau du foie. Il a été décrit il y a plus de 50 ans que l'absorption de bactéries intestinales a une influence négative sur le développement de la nécrose hépatique. Ainsi, la désinfection du tube digestif par des sulfamides non résorbés a permis ainsi de réduire la sévérité de la nécrose hépatique après administration de CCI4 (51,52). Par la suite, le rôle délétère de l'activation des CK a été démontré dans diverses situations expérimentales. Ainsi, leur inhibition permet de réduire les lésions de nécrose hépatique liées à l'administration de tétrachlorure de carbone (53,54), de paracétamol (46), d'alcool (55), de LPS après présensibilisation au Propionibacterium acnés (56), ainsi que celles observées au cours de l'endotoxinémie (57,58), de l’ischémie-reperfiision hépatique (59-62) ou après transplantation hépatique (63).

Enfin, les CK peuvent orienter la réponse immune au niveau du foie soit vers une réponse de type Thl soit vers une réponse de type Th2. Les CK peuvent sécréter de l'IL-4 et de riL-13 et participer au développement d'une réaction de type Th2 en réponse à des parasites (64). Elles produisent par contre de l'IL-12 et de l'IL-18 en réponse au LPS après sensibilisation au Propionibacterium acnés et orientent alors vers une réponse de type Thl (65).

3.2.2 L'endotoxine

Un des principaux activateurs des CK est l'endotoxine, encore appelée lipopolysaccharide (LPS). Le LPS est le composant lipopolysaccharidique de la paroi externe des bactéries gram négatives. En cas de production excessive, le LPS entraîne des dommages cellulaires, le sepsis et la mort de l'individu. Chez les mammifères, le foie est le principal organe de métabolisme du LPS, qui peut être capté par les CK ou les hépatocytes ( 66 ). In vivo, les CK constituent le premier site d’élimination du LPS et d'autres toxines bactériennes en provenance du système porte, et de ce fait empêchent leur invasion systémique. Le LPS est constitué de polysaccharide, d'une partie centrale oligosaccharidique et d'une partie hautement conservée, le lipide A. Il est capable de déclencher une réaction inflammatoire avec sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et autre facteurs solubles. Chez l'animal, le LPS joue un rôle pathogène déterminant dans de nombreux modèles expérimentaux (voir plus loin le modèle Gal/LPS).

Les voies de signalisation intracellulaire en réponse au LPS sont schématisées à la fîgure 3.

i i

NF-kB AP-1

Promoteur du gène cible Transcription

Figure 3 Les voies de signalisation du LPS.

Des récepteurs multiples pour le LPS ont été identifiés depuis 10 ans, dont le plus

important est la protéine CD 14. Le CD 14 a été identifié comme un récepteur au LPS sur les

macrophages (67). Ce récepteur lie le LPS et sa protéine de liaison, la LPS binding protein

(LBP) avec une haute affinité. La LBP est synthétisée par le foie et est présente dams le sérum

de manière constitutive et lors de la réponse de phase aiguë. La capacité des macrophages à

produire du TNF-a après stimulation au LPS est fortement renforcée par la LBP, du moins à

faible concentration de LBP, alors que des concentrations élevées jouent un rôle protecteur en

inhibant la synthèse de TNF-a (68,69). L'intégrine CD 11 c/CD 18 a été identifiée comme autre

21

récepteur transmembranaire au LPS, en l'absence de CD14 (70). Les voies responsables de la transduction du signal induit par le LPS ne sont pas encore entièrement élucidées.

Le complexe LPS/CD 14 interagirait avec un récepteur transmembreinaire, encore non identifié. Récemment, parmi des membres de la famille de récepteurs Toll (TLRs), TLR2 et TLR4 on été identifiés comme candidats potentiels responsables de la transduction du signal (71-73). Bien que les CK de souris et de rat expriment également le CD 14 à leur surface (74), leur activation par le LPS se fait, contrairement aux autres macrophages de l'organisme, de manière indépendante au CD14 (75,76) et à de très faibles concentrations de LPS. Chez l'homme, la cellule de Kupffer n'exprime le CD 14 que lorsqu'elle est activée (77).

L'exposition des CK au LPS résulte en la production de TNF-a et d'IL -6 (ARNm et protéine) (78,79) via l'activation de NF- k B. Le LPS capté par les CK est transféré aux hépatocytes où il est détoxifié. En cas de production ou d'absorption massive de LPS ou de dysfonction des CK, le LPS est retrouvé dans la circulation systémique, comme c'est le cas durant le choc septique. Plusieurs études ont montré que la production de TNF-a par les CK lors de la captation de grandes quantités de LPS est responsable du choc mortel dû au sepsis. En effet, 1) une immunisation passive contre le TNF-a protège les animaux de l'injection mortelle de LPS (80,81), 2) le transfert de macrophages répondant au LPS chez des souris C3H/HeJ résistantes au LPS confère une sensibilité au LPS (82-84), 3) un bolus de LPS donné par voie intraveineuse à des volontaires humains entraîne une augmentation des taux de TNF-a au niveau des veines sus-hépatiques (85).

3.2.3 Le chlorure de gadolinium

Dans la plupart des études expérimentales chez l’animal, le rôle joué par les CK a été

mis en évidence en (pré-)traitant les animaux par le chlorure de Gadolinium (GdCl 3 ), un

métal rare de la série des lanthanides, utilisé depuis de nombreuses années comme inhibiteur

des CK. La première description de son utilisation remonte à 1973 ( 86 ). Le GdCl 3 bloque la

phagocytose de particules colloïdales par les CK et élimine la plupart de ces cellules du foie,

surtout dans la zone périportale (87,88). Le GdCl 3 est soluble à pH bas, mais forme

probablement des précipités et des agrégats à pH physiologique, ce qui expliquerait sa

phagocytose rapide par les CK dans le foie. Une fois phagocyté, le pH acide des

phagolysozomes entraînerait à nouveau la dissolution de GdCla qui serait incorporé dans les

membranes et y provoquerait des lésions. Le GdCb est un puissant inhibiteur des canaux

calciques vo/tûfge-dependants (89,90), et il bloque la synthèse de PGE2 Ca-dépendante des

CK (90). Il entraîne également in vitro la mort de macrophages par apoptose (91). Chez le rat, le prétraitement in vivo par le GdCl 3 augmente l'expression hépatique de l’ARNm du TNF-a (92) et la production de TNF-a par les CK in vitro, en diminuant leur synthèse de PGE 2 (90).

Chez le rat également, le GdCls possède un profil thérapeutique étroit et son administration entraîne une augmentation modérée des transaminases (93).

3.3 Les cellules étoilées

Ces cellules, anciennement appelées cellules de Ito, lipocytes ou myofibroblastes lorsqu'elles sont activées, sont surtout localisées dans l’espace périsinusoïdal de Disse (figure 2), leur périkaryon possédant des extensions cytoplasmiques embrassant la couche de CSE.

Elles constituent le site majeur de stockage de l’acide rétinoïque (vitamine A) (94) et sont impliquées dans son métabolisme. Les cellules étoilées expriment des marqueurs de cellules mésenchymateuses, dont la nestine, la vimentine, Va-smooth muscle actin et la nestine, un marqueur des crêtes neurales (95). Elles jouent un rôle important dans la physiopathologie des maladies hépatiques : 1 ) dans les processus de cicatrisation et de fibrose et 2 ) dans la régulation du flux sanguin sinusoïdal en raison de leurs propriétés contractiles. Lors de leur activation et leur transformation en myofibroblastes en réponse à divers stimuli, elles synthétisent des protéines de la matrice extracellulaire (voir aussi les chapitres consacrés au TGF-P et à la fibrose). Les cellules étoilées produisent des chimiokines CC et CXC lors des phénomènes de fibrose ; MCP-1 et IL- 8 /GRO-a/CINC et peuvent donc réguler le recrutement des leucocytes lors de l’inflammation hépatique. Ces chimiokines jouent un rôle important dans le développement de la fibrose hépatique (96).

3.4 Les cellules sinusoïdales endothéliales

Les cellules sinusoïdales endothéliales (CSE) représentent environ 50 % des cellules

sinusoïdales du foie. Ces cellules forment une gaine continue, mais fenêtrée, dans le sinusoïde

hépatique (celui-ci a un diamètre de 5-7 pm). Ces fenêtres, d'un diamètre de 150-200 nm,

permettent le passage de solutés et de particules entre la lumière du sinusoïde et l'espace de

Disse. La plupart des protéines, de même que les cellules inflammatoires "passagères" dans le

sinusoïde n'entrent toutefois pas en contact direct avec les hépatocytes, les CSE formant donc

une barrière efficace. Ces fenêtres permettent cependant des contacts entre les hépatocytes et

les CK et les lymphocytes résidents du foie. Les CSE ont une haute capacité d'endocytose et

sont surnommées les « éboueurs » {scavengers) du foie, filtrant le sang de différentes

23

macromolécules via des récepteurs spécifiques (49). Elles sont ainsi impliquées dans le catabolisme des glycoprotéines, de la lactoferrine, de l'albumine, des lipoprotéines, de l'acide hialuronique. Les CSE produisent aussi des prostanoïdes, au départ de l’acide arachidonique via la cyclooxygénase.

Ces cellules participent activement à la réponse inflammatoire au niveau du foie par les mécanismes suivants. Tout d'abord, les leucocytes adhèrent à l'endothélium vasculaire via des molécules d'adhérence, permettant ensuite leur extravasation. Contrairement aux autres organes, l'adhérence des leucocytes dans le foie ne nécessite pas l'expression de sélectines pour induire le "roulement" (rolling) des leucocytes mais bien l'expression endothéliale de vascular adhesion protein-1 (97) et l'interaction entre ICAM-1 (CD54) et VCAM-1 (CD 106) et ses ligands sur les leucocytes (98,99). Ces derniers sont représentés par les p2 intégrines CDlla/CD18 (LFA-1), CDllb/CD18 (MAC-1) et VLA-4. Un gradient en chimiokines produites par les hépatocytes, ou encore des cellules en apoptose ( 100 ) sont des signaux activateurs de la migration intraparenchymateuse des neutrophiles. Le «roulement » augmente le contact entre ceux-ci et les cellules endothéliales, de qui permet ensuite leur diapédèse entre les cellules endothéliales. Parce que ICAM-1 et VCAM-1 sont exprimés de manière constitutive sur les CSE, l'adhérence des leucocytes aux CSE peut se faire dans des conditions physiologiques. Lorsqu’elles sont exposées de manière répétée à des petites doses de LPS (comme c’est le cas dans les conditions physiologiques), les CSE sont dans un état réfractaire, l’expression supplémentaire de molécules d’adhérence n’étant pas activée. Cette dernière peut par contre l’être avec de hautes doses de LPS (101). Il semble également que les cellules endothéliales expriment de manière constitutive FasL, ce qui permet une cytotoxicité envers les leucocytes exprimant l’antigène Fas. Le TNF-a réduit cette expression de FasL, ce qui permet l'extravasation des leucocytes dans les processus inflammatoires (102). Les CSE synthétisent des cytokines (IL-1, IL- 6 ) et ont aussi un rôle de cellules présentatrices d'antigène. Elles expriment de manière constitutive les molécules costimulatrices suivantes:

CD80 (B7-1), CD 86 (B7-2), CD40 et les molécules HLA de classe II (101,103). Il est connu depuis longtemps que le foie est capable d'induire de la tolérance vis-à-vis d'antigènes injectés par la veine porte. Une explication a été fournie récemment par le caractère particulier des CSE: la présentation par les CSE d'antigènes solubles entrant dans le système porte aux lymphocytes CD 8 ^ entraîne une tolérance antigénique (104).

Enfin, il a été montré que les CSE peuvent être la cible de mécanismes cytotoxiques,

comme dans l'hépatite à la Con A ou lors des phénomènes d'ischémie/reperfusion du greffon

hépatique(105,106).

3.5 Les polynucléaires neutrophiles

Des polynucléaires neutrophiles sont communément retrouvés dans l'hépatite alcoolique ou dans les lésions d'ischémie/reperfusion (59,107). Dans cette dernière situation, leur déplétion par un anticorps monoclonal réduit la nécrose hépatique chez l’animal (108,109). Les neutrophiles sont recrutés vers les tissus par le biais de cytokines (TNF-a, IL- 1, IL- 8 ), de chimiokines, de leucotriènes, du PAF et de radicaux libres, qui vont induire à leur surface et à la surface des cellules endothéliales l'expression de molécules d'adhérence ( 110 - 117). Une fois la migration trans-endothéliale réalisée, les neutrophiles peuvent adhérer aux hépatocytes, via leurs P2 intégrines et ICAM-1 exprimé par les hépatocytes. La cytotoxicité peut alors s'opérer par le largage de protéases telles que l'élastase, et des radicaux libres tels que H 2 O 2 et l'acide hypochlorique, produits par la myéloperoxydase durant "l’emballement respiratoire" {respiratory bursf) (118,119). L'acide hypochlorique et d'autres oxydants agissent en inhibant des inhibiteurs des protéases, permettant l'action des protéases et la lyse cellulaire (120). Seuls les neutrophiles adhérant aux cellules parenchymateuses participent aux processus lésionnels, contrairement aux neutrophiles séquestrés dans les sinusoïdes. Il faut également signaler que les molécules d'adhérence peuvent exister sous forme soluble, après clivage membranaire. Le rôle exact de ces formes solubles est inconnu, mais en se liant aux leucocytes circulants, elles pourraient empêcher leur migration vers les tissus inflammatoires. Enfin, les polynucléaires neutrophiles sont eux-mêmes une source de cytokines (121). Le rôle délétère des neutrophiles au niveau du foie est démontré chez des rats surexprimant une chimiokine C-X-C. Ceci entraîne un recrutement et une séquestration de neutrophiles dans le foie et une hépatite sévère (114).

3.6 Les lymphocytes T

3.6.1 Introduction

Des lymphocytes activés infiltrant les espaces portes sont retrouvés dans les hépatites

virales et auto-immunes (122). Dans l’infection causée par le virus HBV, la mort cellulaire

des hépatocytes est médiée par des lymphocytes cytotoxiques CDS"^ qui reconnaissent des

peptides viraux présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I exprimé à la

surface des hépatocytes infectés (123). En général, les lymphocytes suivent un mécanisme

similaire à celui décrit pour les polynucléaires neutrophiles pour le roulement, l'adhérence à

l'endothélium vasculaire et la transmigration tissulaire, en exprimant à leur surface des

25

molécules d'adhérence telles que LFA-1 et VLA-4 (124). Ces molécules d'adhérence interviennent également dans les interactions costimulatrices entre lymphocytes T et cellules présentatrices d'antigène et entre lymphocytes T cytotoxiques et leurs cibles.

D'un point de vue immunologique, le foie de souris possède des lymphocytes T conventionnels (NKl.l" CD3''’), des cellules NK (NKl.!"^ CD3") et des lymphocytes particuliers appelés cellules NKT exprimant à la fois NKl.l et CD3, ces dernières étant surtout CD4'*' ou CD4'CD8‘. Comparativement aux autres organes tels que la rate et les ganglions, le foie contient un grand nombre de cellules NK et NKT, chez l'animal ou chez l'homme (125-128).

3.6.2 Activation des lymphocytes

Les lymphocytes T reconnaissent les antigènes sous forme de peptides associés aux molécules HLA de classe II à la surface des cellules présentatrices d'antigène, via un récepteur spécifique (TCR) formé de 2 chaînes polypeptidiques (la plupart des lymphocytes T périphériques ont des chaînes a et p) (129). D'autres interactions entre molécules costimulatrices à la surface de la cellule présentatrice et du lymphocyte T (par exemple B7-1 et B7-2 avec CD28 et CTLA-4, ICAM-1 et ICAM-2 avec LFA-1, VCAM-1 avec VLA-4) sont requises pour une activation optimale du lymphocyte T. Le complexe CD3 situé à proximité du TCR est responsable de la transduction des signaux d'activation suite à la recormaissance de l'ensemble peptide antigénique/molécule HLA avec le TCR.

Schématiquement, ces signaux d'activation font intervenir des phosphorylations et des déphosphorylations de tyrosine (via des protéine tyrosine kinases, PTKs), l'activation de la protéine p21 ras qui secondairement active la cascade des mitogen activated kinase (MARK kinase) et l'hydrolyse du phosphatidylinositol membranaire (par la phospholipase C-yl) ce qui permet in fine une mobilisation du calcium des mitochondries et du réticulum endoplasmique.

Ces événements font apparaître dans le noyau des facteurs de transcription qui vont induire

l'activation de différents gènes. Le facteur de transcription NF k B est présent à l'état non activé

dans le cytoplasme où il est lié à une protéine inhibitrice I k B. La phosphorylation de I k B

autorise la dissociation du complexe I k B-NF k B et la migration de NF k B vers le noyau où il

va se fixer sur les séquences régulatrices k B. Par ailleurs, la déphosphorylation de NFAT dans

le cytoplasme par la calcineurine va permettre sa translocation dans le noyau où il va se fixer

sur des séquences régulatrices stimulant la synthèse d'IL-2. Cette dernière, facteur central de

prolifération lymphocytaire, nécessite la fixation coordonnée de plusieurs facteurs de

transcription (NFAT, AP-1, NF k B) sur des éléments régulateurs en amont du gène de l'IL-2.

Certaines molécules sont capables d'activer des lymphocytes en l'absence d'ime reconnaissance antigénique. Les lectines sont des protéines liant des résidus hydrates de carbone et qui agglutinent les cellules ou provoquent des glucoconjugués. La concanavaline A (Con A) est une lectine mitogénique qui active les lymphocytes T de manière polyclonale en se liant au CD3 et en provoquant un crosslinking du complexe CD3-TCR (130). La présence de cellules mono-macrophagiques est requise pour que la Con A entraîne une activation et une prolifération des lymphocytes T (131). Les superantigènes, quant à eux, sont capables d'activer certains lymphocytes T après formation d'un pont moléculaire entre la partie Vp de la chaîne P du TCR et le complexe HLA de classe II sur les cellules présentatrices d'antigène.

Par exemple, l’entérotoxine B du staphylocoque active les cellules YpS"^ (132). Enfin, les cellules T peuvent être activées de manière polyclonale par un anticorps monoclonal de souris spécifique pour le CD3 humain (Ac OKT3). Cet anticorps active les cellules T mais in vivo, il agit comme anticorps lytique (133).

3.6.3 Les lymphocytes cytotoxiques

Les lymphocytes T CD4'^ et CD 8 ”'' et les cellules naturellement tueuses ou natural killer (NK) peuvent acquérir des propriétés cytotoxiques et détruire la cellule cible par apoptose. Les 2 voies majeures de cytotoxicité sont la voie perforine/granzyme et la voie Fas/FasL, décrite plus haut (10,134). La première voie nécessite la formation de pores membranaires par la perforine et la pénétration simultanée de granzymes A et/ou B dans la cellule cible, après reconnaissance du CMH d'une cellule cible et dégranulation du lymphocyte. Les granzymes A ou B activent des cystéine protéases (caspases). Les lymphocytes CD 8 ^ utilisent essentiellement la voie perforine/granzyme. Dans la seconde voie, l'activation du lymphocyte par son récepteur T entraîne la transcription du gêne codant pour le FasL en 4 à 5 heures. Lorsque le récepteur T est à nouveau engagé, le lymphocyte dégranule ses lysosomes, ce qui permet au FasL d'être intégré dans la membrane cytoplasmique en même temps que les molécules de perforine et de granzyme sont libérées.

Les lymphocytes T CD4-I- utilisent préférentiellement la voie de cytotoxicité Fas/FasL (135).

Les lymphocytes T cytotoxiques jouent un rôle important dans les défenses antivirales et

antitumorales. Ils sont responsables de l'élimination virale en tuant les cellules infectées ou en

sécrétant des cytokines antivirales qui inactivent le cycle viral sans tuer la cellule hôte,

comme c'est le cas pour le virus HBV (136).

27

3.7 Les plaquettes

Les plaquettes sont une source importante de cytokines et de facteurs de croissance comme le TGF-p, le PDGF-P (platelet derived growth factor) et l'EGF (epidermal growth factor). Elles sont impliquées dans le développement des lésions hépatiques dans l'hépatite

expérimentale induite par l'injection de galactosamine/lipopolysaccharide (137).

4. Les cytokines

4.1 Introduction

Les interleukines forment une sous-classe de cytokines, de facteurs de croissance et de différentiation jouant un rôle dans de multiples processus biologiques. Il s’agit de protéines qui se lient à des récepteurs spécifiques. Elles ressemblent aux hormones en étant produites par certaines cellules et en agissant sur d'autres, de manière endocrine et paracrine et sur elles- mêmes, de manière autocrine. Les cytokines sont pléiotropes: une cytokine peut avoir des propriétés identiques à d'autres cytokines. L'IL-1 par exemple a des propriétés similaires au TNF, aux lymphotoxines, au fibroblast growth factor, au platelet derived growth factor ou à riL -6 bien qu'il n'y a pas d'homologie de structure ou de séquence entre ces cytokines. Il y a donc aussi redondance : différentes cytokines pouvant médier des effets identiques. La source la mieux étudiée des cytokines est sans nul doute les leucocytes : les monomacrophages, les lymphocytes T et B, les cellules NK et NKT, les polynucléaires neutrophiles ou éosinophiles, ce qui explique leur description fréquente comme médiateurs de la réponse inflammatoire.

Elles sont cependant aussi produites par d'autres types cellulaires comme dans le foie, par les hépatocytes eux-mêmes, les cellules endothéliales, les CK et les cellules étoilées. Les cytokines contribuent au développement de pathologies hépatiques, comme les hépatites infectieuses, toxiques, auto-immunes, alcoolique et ischémique, la fibrogenèse ou encore le rejet de greffe. Elles peuvent être classifiées de diverses manières, selon qu'elles soient pro­

inflammatoires, anti-inflammatoires (bien qu'une cytokine puisse posséder les deux

propriétés) ou encore selon le concept Thl/Th2 . Nous les classifierons de manière grossière

en cytokines pro-inflammatoires et en cytokines anti-inflammatoires.

Figure 4 : induction d’une réponse de type Thl ou Th2

MO : macrophage ; DC : cellules dendritique ; ThP : CD4"^ naïf

IFN- y , IL-2, TNF

IL-4, IL-5, IL-13

29

4.2 Le concept Thl/Th2

Deux types de clones lymphocytaires CD4'*' on été identifiés chez la souris: les clones THl produisant de riL-2, de riFN-y et du TNF-a/p, et les clones TH2 produisant de l'IL-4, IL-5, IL- 6 , lL-9, IL-10 et IL-13 (138,139). La nature de l'antigène et le type de cytokines produites au début d'une réaction immune vont influencer la polarisation vers une réponse de type Thl ou Th2. Ainsi, les virus, les bactéries, l'IL-12 produite par les cellules présentatrices d'antigène vont induire le développement d'une réponse de type Thl, associée à l’activation de du facteur de transcription STAT4. Les parasites extracellulaires, les allergènes et l'IL-4 vont induire le développement d'une réponse de type Th2 en activant STAT 6 . Ces sous- populations lymphocytaires produisent des cytokines différentes et vont induire des fonctions effectrices différentes: une immunité cellulaire pour combattre les microbes intracellulaires pour les cellules Thl et une réponse faisant intervenir les éosinophiles, les mastocytes et la production d'IgE pour les cellules de type Th2. Par ailleurs, l'IL-4 inhibe la prolifération des cellules Thl et l'IFN-y inhibe la prolifération des cellules Th2. (figure 4).

4.3 Les cytokines pro-inflammatoires

4.3.1 TNF-a

Cette cytokine a été décrite plus haut (chapitre ) dans le chapitre consacrée aux

mécanismes de mort cellulaire. C'est un médiateur majeur de la réponse inflammatoire, mais

le TNF-a possède aussi des propriétés anti-inflammatoires, par exemple dans un modèle

d'encéphalite auto-immune (140). En physiopathologie, le TNF joue un rôle important

notamment dans le choc septique, la polyarthrite rhumatoïde et la maladie de Crohn. Son rôle

critique dans le développement des hépatopathies a également été suggéré tant dans des

modèles expérimentaux que chez l'homme (voir plus loin).

4.3.2 IFN-y

Identifié pour ses capacités à interférer avec la réplication virale dans des cellules en culture, l'interféron-y (IFN-y ) joue un rôle dans la défense contre les infections virales, bactériennes et influence le type de réponse inflammatoire antigène-spécifique en réponse aux micro-organismes, aux allergènes et aux auto-antigènes (141,142).

Dans sa forme bioactive, l'IFN-y est un homodimère de 34 kD stabilisé par des forces non covalentes. L'IFN-y est principalement produit par les cellules NK et les lymphocytes T, en réponse au TNF, à l'IL-12 et l'IL-18 ainsi qu'à des signaux costimulateurs, par exemple l'interaction CD40/CD40 ligand. En réponse au LPS, l'IFN-y est produit aussi bien par les cellules NK que les lymphocytes T CD4''' et CDS'*’, suite à la production d'IL-12 par les monocytes (143). Une surproduction d'IFN-y dans le choc septique expérimental chez la souris est en partie responsable de la mortalité observée (144), et les souris déficientes pour le récepteur de l'IFN-y sont résistantes au choc septique (145). Les activités de l'IFN-y comportent l'activation et la maturation des mono-macrophages, la génération de radicaux libres et de NO, l'augmentation de l'adhérence des leucocytes à l'endothélium par le biais de l'expression de molécules d'adhérence (ICAM-1), l'induction de chimiokines, l'induction d'une réponse de type Thl et la synergie avec d'autres cytokines (comme le TNF), l'activation des neutrophiles et la stimulation de l'activité cytolytique des cellules NK. Il augmente l'expression de molécules MHC de classe I et II sur de nombreuses cellules, de molécules B7 sur les cellules présentatrices d'antigène et de FcyR sur les mono/macrophages. In vivo, l'IFN- y peut avoir des propriétés pro-inflammatoires (par exemple dans des modèles de maladies inflammatoires de l’intestin) (146) ou anti-inflammatoire (par exemple dans un modèle d'uvéite auto-immune) (147).

Expérimentalement, l'IFN-y joue un rôle critique dans un modèle d'hépatite fulminante chez des souris transgéniques exprimant l'antigène HBS (123) ou chez des souris après préactivation par le Propionibacterium acnés et injection de LPS (148). Par ailleurs, des souris transgéniques exprimant de manière constitutive l'IFN-y développent après quelques semaines des lésions d'hépatite chronique (149). Chez l'homme, une expression ou une production accrue d'IFN-y est retrouvée dans les hépatites auto-immune (150) et virale (151-

154) ainsi que dans le rejet d'allogreffe hépatique (155).

31

4.3.3 IL-1

De manière semblable au TNF, la source principale d'IL-1 est constituée par les cellules mono-macrophagiques, en réponse au LPS et à d'autres cytokines telles que le TNF. Il existe 2 formes d'IL-1, l'IL-la et l'IL-ip qui ont moins de 30% d'homologie mais qui se fixent sur le même récepteur et médient les mêmes effets biologiques, eux aussi semblables à ceux du TNF. Le précurseur de 33 kD de l'IL-ip est clivée par une protéase, appelée ICE {IL-lfi converting enzyme) pour libérer la forme active de 17 kD. L'IL-1 est un médiateur de la réponse inflammatoire aux infections et stimuli inflammatoires. Contrairement au TNF, l'IL-1 ne peut induire l'apoptose cellulaire. Les cellules mono-macrophagiques produisent un inhibiteur naturel de l'IL-1, se fixant sur le même récepteur mais biologiquement inactif, l'IL- IRA {IL-1 receptor antagonist) (156). Ses effets, souvent en synergie avec le TNF-a et l'IL- 6 , comprennent la synthèse de molécules d'adhérence et de chimiokines par les cellules endothéliales, la stimulation de la synthèse de protéines de phase aiguë par les hépatocytes et la fièvre.

4.3.4 IL-2

Cette cytokine est produite par les lymphocytes T CD4'^ et dans une moindre mesure par les CDS"^, en réponse à leur activation par des antigènes et des signaux costimulateurs. Il s'agit d'une protéine de 14 à 17 kD. Elle est responsable de la prolifération des lymphocytes T et de leur production de cytokines (IL-4 et IFN-y), de la prolifération des lymphocytes B et de leur production d'anticorps, de la prolifération et de l'activité cytotoxique des cellules NK.

Elle est aussi requise pour l'induction de l'apoptose des cellules T suite à une activation antigénique et est donc une cytokine importante pour la régulations des réponses immunes faisant intervenir les cellules T.

4.3.5 IL-6

Il s'agit d'une des cytokines les plus pléiotropes, produite par les macrophages, les

lymphocytes T, les cellules endothéliales, les fibroblastes, en réponse aux microbes et à des

cytokines telles que le TNF-a ou l'IL-1. L'IL -6 stimule la production de protéines de phase

aiguë par les hépatocytes. C'est un facteur de croissance et de différentiation pour les

lymphocytes B. Si l'IL -6 ne joue pas de rôle majeur dans la réponse inflammatoire systémique

après injection de LPS, elle est indispensable à l'élaboration d'une réponse inflammatoire

localisée (157).

L’IL -6 et les protéines de phase aiguë peuvent aussi jouer un rôle anti-inflammatoire, immunosuppresseur et anti-apoptotique (158). Enfin, l’IL -6 est aussi impliquée dans les processus de régénération et de prolifération des hépatocytes (voir plus loin, le chapitre consacré à la réparation cellulaire)

4.3.6 IL-12

Il s’agit d’un hétérodimère de 70 kDa (p70) formé de 2 chaînes d’environ 40 (p40) et 35 (p35) kDa liées par des liens covalents (159). Elle est produite surtout par les mono­

macrophages. Il s’agit d’une cytokine jouant un rôle important dans la régulation des défenses innées et adaptatives, elle est un facteur de croissance pour les cellules NK et T, et elle induit leur production de cytokines dont l’IFN-y. Sa sécrétion de manière précoce dans une réaction immune va permettre l’expansion de lymphocytes CD4'*' de type Thl. L’IL-12 entraîne aussi une augmentation de l’activité cytotoxique des cellules NK et la génération de lymphocytes T cytotoxiques. L’injection de LPS chez la souris active les CK à produire de l’IL-12 qui active les cellules NK à produire de l’IFN-y et les lymphocytes NKT à acquérir une cytotoxicité antitumorale (160). L’homodimère p40 a une fonction anti-inflammatoire dans l’endotoxinémie expérimentale chez la souris en étant un antagoniste de l’IL-12 (64).

L’injection d’IL-12 chez la souris entraîne une hépatite par infiltration du foie par des macrophages activés (161).

4.3.7 IL-15

Cette cytokine est synthétisée par les mono-macrophages. Elle ressemble à l'IL-2 quant à ses activités biologiques. Elle stimule la prolifération et l'activation des cellules T, NK et B (162,163).

4.4 IL-18

Cette cytokine non glycosylée de 24 kDa, qui possède une structure proche de celle de

riL-1, est synthétisée sous forme inactive par les macrophages en réponse au LPS et autres

produits bactériens. L’IL-18 doit subir un clivage protéolytique par une caspase ICE pour

devenir active sous forme d’une molécule de 18 kDa (164,165). L’IL-18 est un puissant

inducteur de la production d’IFN-ypar les cellules T et NK, en synergie avec l’IL-12. Elle

induit aussi l’expression de Fas ligand sur les lymphocytes T CD4"^ Thl et NK. Son rôle dans

le choc septique a été démontré notamment par l’usage de souris IL-18-déficientes (166,167).

33

Chez l’homme, une expression accrue d’IL-18 est retrouvée dans le foie de patients souffrant d’hépatite chronique C (168) et des taux sériques augmentés d’IL-18 sont détectés dans l’hépatite fulminante (169).

4.5 Les cytokines anti-inflammatoires

4.4.1 IL-4

Sa source principale est constituée par les lymphocytes T CD4+ Th2, les mastocytes et les basophiles. C'est le stimulus majeur de la synthèse des IgE et du développement des cellules Th2 à partir des cellules CD4"^ naïves. L'IL-4 antagonise aussi l'effet activateur de riFN-y sur les macrophages. Par ailleurs, l'IL-4 provoque l'apoptose d'hépatocytes de souris in vitro, indépendamment de la présence de cellules inflammatoires, par un mécanisme faisant en partie intervenir la voie Fas/FasL (170). La production d'IL-4 de manière autocrine par les cellules NKT lors de leur activation sert aussi à induire l'expression de FasL à leur surface, un mécanisme cytotoxique effecteur dans l'hépatite à la Con A chez la souris (171,172). Enfin, l'IL-4 est impliqué dans le développement de la fibrose hépatique (voir le chapitre consacré à la fibrose).

4.4.2 IL-10

4.4.2.1 Production, source cellulaire et structure

Cette cytokine est produite par de nombreuses cellules dans une grande variété de

tissus (173). L'IL-10 a été initialement décrite comme un facteur Th2 inhibant la production

de cytokines des clones Thl (174). Chez l'homme, l'IL-lO peut être détectée dans de

nombreuses situations, dont les cancers (175,176), le choc septique (177,178), les infections à

méningocoque (179,180), lors de la chirurgie cardiaque (181) ou encore en transplantation,

après reperfusion du greffon hépatique (182). Durant l'endotoxinémie expérimentale ou les

infections bactériennes, les poumons et surtout le foie sont une source importante d'IL-10

(ARNm et protéine) (183-185). Au niveau du foie, les CK (186,187), les cellules étoilées

(188), les CSE (101) ou les hépatocytes (189) produisent l'IL-10. Les CK expriment l'IL-10 en

réponse à des concentrations physiologiques de LPS (186), cette expression survenant dans

les 2h suivant l'exposition (187), alors que l'expression d'IL-10 au niveau des monocytes est

surtout observée après 24h (190). Après injection de LPS chez la souris, le TNF-a endogène

inhibe la production précoce d'IL-10 alors qu'il stimule sa production tardive (185).