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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Schindel, K. P. (s.d.). Contribution à l'étude des acides nucléiques: L'affinité des acides nucléiques pour certains colorants basiques (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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L ' a f f i n i t é dee aeidee nuolftlquea pour c e r t a i n s colorante b a s i q u e s ,
K.P.Sohindel.
Théae annexe:
Lea procèdes ehiniquea aetuellesient u t i l i e f t a pour doaev l e P-mèthyl-3-phytyl-l,4-nephthochlnone ne s'appliquent pas
«pè-cifiqueiBent â c e t t e aubatance dans l e s l i q u i d é e
TJSm DES MATIERES.
I . IMÎROXiUCïIOM.
A. Qhakac&lit'ee eur 1«B a c i d e s n u c l é i q u e s . l^age 1
a) C o n s t i t u t i o n chimique. "b) Proprifetée p h y s i q u e s . c j L o c & l i c a t i o n dans l a c e l l u l e . d) Eôle b i o l o g i q u e des a c i d e s n u c l é i q u e s . Comportouent des a c i d e s n u c l é i q u e s T i s - à - T i s du mélange de Unna. 5 C* P l a n du t r a v a i l . 7 I I . RESULTAIS EXPERIHEUÏAUX. A. C o l o r a t i o n de f r o t t i s de l e v u r e e t de n u c l é o h i s t o n e p a r l e v e r t de m é t h y l e e t par l e p y r o n i n e à d i f f é r e n t s pH. 9 a) Technique. 9 t ) C o l o r a t i o n des f r o t t i s de l e v u r e . 9 0) C o l o r a t i o n des f r o t t i s de n u c l é o h i s t o n e . 10 B . La p r é c i p i t a t i o n i n v i t r o des a c i d e s n u c l é i q u e s p a r des c o l o r a n t s b a s i q u e s . 11 R é s u l t a t s : 12
1) La lj»i de Beer Lambert. 12
2 j pH de p r é c i p i t a t i o n des a c i d e s n u c l é i q u e s en l * a b e e n c e de c o l o r a n t . 13
3) i - r é c i p i t a t i o n de l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e p a r l a p y r o n i n e et par l e v e r t de m è t h y l e . 14
4) P r é c i p i t a t i o n de l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l è i q u e par l a pyronine e t par l e v e r t de méthyle- 17
5) P r é c i p i t a t i o n des a c i d e s n u c l é i q u e s par l e mélange v e r t de mèthyle - p y r o n i n e . 19
- PYROifliJE. f a r K . ï ' . S c h i n d e l . I . I]iiTRO£iUCTI0.&î. Gfenferalltéa s u r l e e a c i d e s nuclfelquea. On s a i t q u ' i l e x i s t e deux t y p e s p r i n c i p a u x d ' a c i d e s n u c l é i q u e s » l ' a c i d e r i b o n u c l è i q u e e t l ' a c i d e desosQ^riloonucl&ique, d i f f é r e n t s l ' u n de l ' a u t r e au q u a d r u p l e p o i n t de vue de l a c o n s t i -t u -t i o n chimique» de l ' é -t a -t p h y s i q u e , de l e l o c a l i s a -t i o n dans l a c e l l u l e e t du r ô l e b i o l o g i q u e . 11 e s t n é c e s s a i r e , pour l a corupré-h e n s i o n de n o t r e t r a v a i l » de p a p p e l e r b r i è v e m e n t en quoi c o n s i s t e n t l e s p r i n c i p a l e s parmi ces d i f f é r e n c e s .
a) C o n s t i t u t i o n chimique: L ' h y d r o l y s e ménagée des a c i d e s n u c l é i q u e s
c o n d u i t à l a l i b é r a t i o n de mononuoléotides» c o n s t i t u é s par l ' a s s o -c i a t i o n d ' u n e b a s e a z o t é e ( p u r i q u e ou p y r i m i d i q u e ) » o ' u n p e n t o s e e t d ' a c i d e o r t h o p h o s p h o r i q u e .
On a longtemps pensé» à l a s u i t e s u r t o u t des t r a v a u x de Levene» que l e s a c i d e s n u c l é i q u e s s o n t des t é t r a n u c l é o t i c e s e t q u ' i l s s o n t donc formés p a r l ' u n i o n de 4 m o n o n u c l é o t i d e s d i s t i n c t s » mais p r é s e n t s en q u a n t i t é s é g a l e s . Les recherclnes r é c e n t e s de
Gul-land» de Chantrenne e t de Vandendrieeeche» b a s é s notamment s u r Xn l ' a n a l y s e des courbes ô ' ê l e c t r o t i t r a t i o n ont permis cepencant d ' e x -c l u r e de f a ç o n d é f i n i t i v e l a formule que Levene a v a i t p r o p o s é e .
i^lus récemment encore» C h a r g a f f e t V i s c h e r o n t é t u d i é l a composition d ' a c i d e s n u c l é i q u e s de d i v e r s e s orié^ines en p r o c é o e n t
à ûAe a n a l y s e s e r r é e des composés a z o t é s à l ' a i d e de l a d i r o m a t o g r a
-p h i e s u r -p a -p i e r s l e u r s r é s u l t a t s é t a b l i s s e n t de f a ç o n c l a i r e que l e s 4 b a s e s a z o t é s que f o u r n i t l ' h y d r o l y s e des a c i d e s n u c l é i q u e s ne s e r e t r o u v e n t pas en q u a n t i t é s é q u i m o l é c u l a i r e s e t q u ' i l ne p e u t donc s ' a g i r de t e t r a n u c l é o t i d e s • Ces c o n c l u s i o n s ont é t é c o n f i r m é e s r é -cemment» dans l e s l a b o r a t o i r e oû nous t r a v a i l l i o n s par Thomas.
On c r o i t que l a c o n s t i t u t i o n chimique p r é c i s e des a c i d e s n u c l é i q u e s e s t b i e n l o i n d ' ê t r e connue e t q u ' i l ne f a i t aucun c o û t e q u ' i l s ' a g i t de s u b s t a n c e s d ' u n e grande c o m p l e x i t é . I l n ' e n r e s t e p a s moins v r a i q u ' à c ô t é des d i f f é r e n c e s s u b t i l e s qui e x i s t e n t sans d o u t e e n t r e l e s d i v e r s a c i d e s n u c l é i q u e s » i l y a a u s s i des d i f f é r e n -c e s profondes» t r è s a p p a r e n t e s » e n t r e l e s 2 t y p e s p r i n -c i p a u x , iilllem p o r t e n t s u r t o u t s u r l a n a t u r e ces b a s e s a z o t é s e t des p e n t o s e s . En e f f e t » a l o r s que l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e , dont l e p r o t o t y p e e s t l ' a c i 4 e zymonucléique de l a levure» c o n t i e n t du d r i b o s e » l ' a c i d e d é s o x y r i -b o n u c l é i q u e (dont l e mieux connu e s t l ' a c i d e thymonucléique) r e n f e r m e
2 -p r o -p r i è t ê a c h i m i q u e s » n o t a m m e n t T i e - à ' T i s d e s a c i d e s » s o n t f o r t d i f f é r e n t e s : . X H-C-OH I H-C-OH H-C-OH I H-C-OH I H-C-OH H-C-OH I H-C-OH CH, d - ( - } - H i b o s « . d - ( - ) - 2 - D è s o x y r i b o s e ,
En ce qui concerne l e s b a s e s azotfees, l e s deux p u r i n e s ( l a guanine e t l ' a d è n i n e ) sont communss aux deux t y p e s d ' a c i d e s n u c l é -i q u e s -i -i l en Ta de même pour l ' u n e des p y r -i m -i d -i n e s , l a cytOB-in«. k a i s l e second d é r i v é p y r i m i d i n i q u e n ' e s t pas i d e n t i q u e dans l e s deux t y p e s d ' a c i d e s n u c l é i q u e s i a l o r s que l ' a c i d e r i b o n u c l è i q u e c o n t i e n t de l ' u r a c i l e , l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e c o n t i e n t un dé-r i dé-r e méthylé de c e t t e base» l a thymine.
On t r o u v e r a c i - d e s s o u s » pour mémoire» l e s f o r m u l e s de ces d i f f é r e n t e s b a s e s a z o t é e s :
"ii>
û=<j} CH «C—ÏÏH, HN—in C y t o s i n e . H3jr— HK—CH U r a c i l e . Guanine. H|-— - C H j Hlf—CHr
Thymine, La c o n s t i t u t i o n des mononucléotldee e s t a s s e z b i e n connue e t nous donnons c i d e s s o u s » à t i t r e d ' i n d i c a t i o n » l a f o r -mule de c o n s t i t u t i o n : i l s ' a g i t de l ' a c i d e a d é n y l i q u e de l a l e v u r e ,qui s ' o b t i e n t aisfanent par h y d r o l y s e a l c a l i n e ménagée de l ' a c i d e symonucléique:
HC C—IL
CHgOH
d ë s o x y r l ho n u c l é i q u e r é s i s t e à une é h u l l l t l o n p r o l o n g é e en p r é -sence de ItaÛH M» On s a i t a u s s i que l e s n u c l é o t i d e s p y r i m i d i q u e s s o n t moins a i s é m e n t a t t a q u a b l e s en m i l i e u a c i d e que l e s n u c l é o -t i d e s p u r i q u e s ; l ' a c i d e d é s o j ^ r l h o n u o l é i q u e e s -t d ' a i l l e u r s p l u s • t a b l e en m i l i e u a c i d e que l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e .
Cn T o i t donc que s i l e s deux t y p e s d ' a c i d e s n u c l é -i q u e s s o n t c e r t a -i n e m e n t b â t -i s s u r un m ^ e schéma g é n é r a l , des d i f f é r e n c e s i m p o r t a n t e s l e s s é p a r e n t d é j à s u r l e p l a n c h i m i q u e .
"b) . t r o p r l é t é s p h y s i q u e s : Les deux t y p e s d ' a c i d e s n u c l é i q u e s •«
d i s t i n g u e n t e n c o r e f o r t e m e n t l ' u n de l ' a u t r e l o r s q u ' o n é t u d i e l e u r p o i d s m o l é c u l a i r e e t l a forme de l e u r s m o l é c u l e s . En e f f e t , l ' a c i d e d ê s o x y r i b o n u c l é i q u e se p r é s e n t e sous une foime hautement p o l y m é r i s é e e t son p o i d s m o l é c u l a i r e a t t e i n t des v a l e u r s p r o c h e s de 1 m i l l i o n l o r s q u ' o n l ' i s o l e des c e l l u l e s en p r e n a n t c e r t a i n e s p r é c a u t i o n s ( e x t r a c t i o n p a r des s o l u t i o n s s a l i n e s c o n c e n t r é e s â b a s s e t e m p é r a t u r e , p r é c i p i t a t i o n à f r o i d p a r l ' a l c o o l ) . Ces
ma-oromolécules d ' a c i d e d ê s o x y r i b o n u c l é i q u e s o n t de forme extrême-ment a l l o n g é e ; au m i c r o s c o p e é l e c t r o n i q u e , e l l e s a p p a r a i s s e n t p r e s q u e f i l i f o r m e s . D ' a i l l e u r s , l e s s o l u t i o n s de c e t a c i d e d ê s o x y r i b o n u c l é i q u e ' « n a t i f " ( c ' e s t à d i r e f o r t e m e n t polymferisé) p r é -s e n t e n t t o u t e -s l e -s p a r t i c u l l a r i t é -s de-s -s o l u t i o n -s de m o l é c u l e -s f i b r e u s e s ( b i r é f r i n g e n c e d ' é c o u l e m e n t , anomalies de l a v i s c o s i t é , t e n d a n c e & l a f o r m a t i o n de g e l s r i g i d e s , e t c . ) . 11 s u f f i t de dé-p o l y m é r l s e r c e t a c i d e d ê s o x y r i b o n u c l é i q u e n a t i f dé-p a r des a l c a l i s a chaud ou p a r v o l e enzymatlque ( a c t i o n de l a d é s o x y r i b o n u c l é a e e ) pour v o i r d i s p a r a î t r e t o u s ces c a r a c t è r e s . Jùx c o n t r a i r e , l ' a c i d e r l b o n u c l é l q u e n ' a J a m a i s pu> •
ê t r e o b t e n u soue forme f o r t e m e n t p o l y m é r i s é e , à l a s e u l e except i o n d ' u n e p r é p a r a except i o n I s o l é e par Cohen e except S except a n l e y â p a r except i r du v i -r u s de l a mosaïque de t a b a c ; e n c o -r e f a u t - i l a j o u t e -r que c e t a c i d e r l b o n u c l è i q u e , qui a v a i t un p o i d s m o l é c u l a i r e s u p é r i e u r à 100.000 e t des m o l é c u l e s de forme a l l o n g é e , se d é p o l y m é r l s a i t spontanément en q u e l q u e s m i n u t e s . En g é n é r a l , l ' i s o l e m e n t de l ' a c i d e r i b o n u « l é -I q u e p a r des méthodes douces donne des p r o d u i t s dont l e p o i d s
mo-l é c u mo-l a i r e moyen v a r i e e n t r e 10.000 e t 15.000 e t dont mo-l e s m o mo-l é c u mo-l e s s o n t de forme s e n s i b l e m e n t g l o b u l e u x . c) L o c a l i s a t i o n dans l a c e l l u l e ; L l f f é r e n t e s méthodes o n t é t é p r o -p o s e e s ~ ' -p ô û r ~ T ê ~ d ¥ t e c n c ^ ^ des a c i d e s n u c l é i q u e s dans l a c e l l u l e , b a s é e s s u r l e s p r o p r i é t é s c a r a c t é r i s t i q u e s de ces sub-s t a n c e sub-s t c ' e sub-s t a i n sub-s i que l ' a c i d e désub-soxyribonuclfeique f o u r n i t , a p r è sub-s u n e hydrolirse a c i d e ménagée qui l u i e n l è v e s e s b a s e s p u r i q u e s , un
La p r é s e n c e à ' a c i d e s n u c l é i q u e s dans l a c e l l u l e peut • n e o r s ê t r e é t a b l i e en mesurant l e s p e c t r e d ' a b s o r p t i o n dans l ' U . V . des d i v e r s c o n s t i t u a n t s c e l l u l a i r e s t l e s b a s e s p u r i q u e s e t p y r i m i d i q u e s p o s s è d e n t en e f f e t un maximum c o n s i d é r a b l e d*' a b s o r p t i o n aux e n v i r o n s de 2.650 A e t Caspersson a pu t i r e r p a r -t i u -t i l e m e n -t de c e -t -t e p a r -t i c u l i a r i -t é pour c é c e l e r l e s a c i d e s n u c l é i q u e s e t même l e s doser a p p r o x i m a t i v a a e n t dans des éléments c e l l u l a i r e s de t r è s p e t i t e t a i l l e . L ' o u t i l l a g e pour l a s p e c t r o -p h o t o m é t r i e u l t r a v i o l e t t e e t malheureusement coûteux e t d é l i c a t , ce qui r é d u i t l e s p o s s i b i l i t é s d ' a p p l i c a t i o n de l a méthode.
Une t e c h n i q u e beaucoup p l u e simple a é t é imaginée p a r B r a c h e t e t e l l e e s t devenue d ' u n emploi courants e l l e s e base
s u r l e f a i t que l e s a c i d e s n u c l é i q u e s » en r a i s o n de l e u r c a r a c -t è r e a v i d e p r é c i s é m e n -t » se combinen-t f a c i l e m e n -t aux c o l o r a n -t s b a s i q u e s , line p r é p a r a t i o n microscopique» t r a i t é e par un c o l o r a n t b a s i q u e comme l e b l e u de t o l u l c i n e » f i x e r a énergiquement l e co-l o r e n t p a r t o u t où i co-l se t r o u v e de co-l ' a c i d e n u c co-l é i q u e . Comme co-l a c e l l u l e c o n t i e n t souvent d ' a u t r e s s u b s t a n c e s a c i d e s que l e s a c i -d e s n u c l é i q u e s » i l importe -de -donner à l a métho-de l a s p é c i f i c i t é qui r i s q u e de l u i manquer; on y p a r v i e n t a i s é m e n t en t r a i t a n t l e s coupes p a r des enzymes qui d i g è r e n t s p é c i f i q u e m e n t l ' u n ou l ' a u -t r e des deux -t y p e s d ' a c i d e s n u c l é i q l i e s . Ce s o n -t l a r i b o n u c l é a s e e t l a d é s o x y r l b o n u c l é a s e q u ' i l e s t p o s s i b l e d ' i s o l e r a l ' é t a t
c r i s t a l l i s é en p a r t a n t du p a n c r é a s ; ces deux f e r m e n t s a t t a q u e n t de maiilère s p é c i f i q u e r e s p e c t i v e m e n t l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e et 1 ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e . Si on t r a i t e une coupe de t i s s u s par de l a r i b o n u c l é a s e p a r exemple» l e s éléments c e l l u l a i r e s qui con-t e n a i e n con-t de l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e c e s s e r o n con-t de f i x e r l e c o l o r a n con-t b a s i q u e . Parmi l e s c o l o r a n t s b a s i q u e s » î i r a c h e t e t de nombreux a u t r e s c h e r c h e u r s a p r è s l u i ont beaucoup u t i l i s é un mélange de 2 c o l o r a n t s b a s i q u e s : l e v e r t de m é t h y l e e t l a p y r o n l n e (mélange de
Unna)• ë O U S r e v i e n d r o n s b i e n t ô t sur l e s a v a n t a g e s de c e t t e
colo-r a t i o n » c a colo-r c ' e s t l e mécanisme de son a c t i o n qui f a i t l ' o b j e t du p r é s e n t t r a v a i l .
Les t r a v a t L X de Caspersson» B r a c h e t » e t c . o n t p e i m l s d '
é t a b l i r que l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e se t r o u v e en m a j e u r e p a r t i e
dans l e cytoplasme» quoique l e noyau ( s u r t o u t l e n u c l é o l e ) en
r e n f e r m e en p e u . Une étude biochimique p l u s poussée a permis â Claude» B r a c h e t e t Jeen4b> Chantrenne e t c . d e d ^ o n t r e r que c e t
a c i d e n ' e s t pas a c s o o l é eTdes h i s t o n e s , m a i s q u ' i l e n t r e d a n s l a
composition de p a r t i c u l e s cytoplasmiques u l t r a c e n t r i f u g e a b l e s : l a t e i l l e ce ces g r a n u l e s v a r i e de 0»05 à 2^ e t l e u r c o m p l e x i t é
va en c r o i s s a n t . Les p l u s g r o s s e s p a r t i c u l e s c o n t i e n n e n t » en e f
-f e t , o u t r e l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e » des p r o t é i n e s » des p h o s p h a t i d e s e t de t r è s i m p o r t a n t e e t nombreux ensymes; i l e s t h o r s de doute
q u ' e l l e s j o u e n t un r ô l e e s s e n t i e l l o r s de l ' o x y d a t i o n c e s g l u c i -des e t -des a c i d e s gras dans l a c e l l u l e .
d) Rôle b i o l o g i q u e des a c i d e s n u c l é i q u e s ; îiîbus ne f e r o n s q u ' e «
-q u i s s e r ce -q u ' o n pense a c t u e l l e m e n t du r ô l e des a c i d e s n u c l é i -q u e s
dans l a c e l l u l e v i v a n t e : l ' a c i d e désosarrlbonucléique» c o n s t i t u a n t
l u l e , s i on en j u g e p a r l a f a i b l e v i t e s s e de r e n o u v e l l e m e n t du phos
phore e t des p u r i n e s p r é s e n t s dans s a m o l é c u l e , dEtns l e s
expèri'ences oû des i s o t o p e s o n t é t é u t i l i s é s . 2)e f o r t i n t é r e s s a n t s t r a vaux de Avery, i i . i a y l o r e t c . , que nous ne pouvons songer a d i s e u t e r i c i , m o n t r e n t que 1 * a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e p e u t , à c o n d i -t i o n d ' ê -t r e p o l y m é r i s é , i n d u i r e des m u -t a -t i o n s chez l e s b a c -t é r i e s
e t t r a n s f o r m e r p a r conséquent une souche en une a u t r e . Ces expé-r i e n c e s c o n d u i s e n t à l a c o n c l u s i o n q u ' i l d o i t e x i s t e expé-r un gexpé-rand
nombre d ' a c i d e s d é s o x y r i b o n u c l f e i q u e s s p é c i f i q u e s , d i f f é r e n t s l e s uns des a u t r e s , mais on ne p e u t encore l e s d i s t i n g u e r que p a r l e u r s p r o p r i é t é s b i o l o g i q u e s .
^ u a n t à l ' a c i d e r i b o n u c l è i q u e , l e s r e c h e r c h e s de B r a -ehet e t de Caspersson o n t montré q t ' i l i n t e r v i e n t dans l a s y n t h è s e des p r o t é i n e s c y t o p l a s m i q u e s ; i l e s t p r o b a b l e que ce s o n t l e s g r a n u l e s r i b o n u o l é o p r o t é i q u e s a u x q u e l l e s nous avons f a i t a l l u s i o n c i -d e s s u s qui s o n t l e s a g e n t s -de c e t t e s y n t h è s e , A l ' i n v e r s e -de 1 '
a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e , l ' a c i d e r i b o n u c l è i q u e e s t l e s i è g e d ' u n m é t a b o l i s m e i n t e n s e e t l ' i n c o r p o r a t i o n dans sa m o l é c v l e de
phos-p h o r e ou de phos-p u r i n e s marqués s o n t r a phos-p i d e s (Hevesy, J e e n e r , Ha^^ar-s t e n , e t c . ) .
On v o i t donc que s ' i l e x i s t e une r e s s e n b l a n c e g é n é r a l e e n t r e l e s a c i d e s r i b o e t d é s o x y r i b o n u c l é i q u e s , c e s deux s u b s t a n
-ces se comportent t r è s différermrient l ' u n e de l ' a u t r e à m&ints é
-g a r d s . - t a s s o n s m a i n t e n a n t à une a u t r e d i f f é r e n c e de comportement e n t r e l e s deux t y p e s d ' a c i d e s n u c l é i q u e s , l e u r c o l o r a b i l i t é par l e mélange de Unna.
B . Comportement des a c i d e s n u c l é i q u e s v i s - à - v i s du mélange de Unna» La c o m p o s i t i o n de ce mélange de deux c o l o r a n t s b a s i q u e s s u r l e s q u e l s nous r e v i e n d r o n s , e s t l a s u i v a n t e * V e r t de raéthyle C,15 g r î y r o n i n e 0 , 2 5 gr Alcool 94^ 2,50 ce G l y c é r i n e 20,— ce isau phéniquée 5^ ad 100 ce ( 1 , 6 8 ) . On a v a i t remarqué d e p u i s longtemps q u ' i l e s t p o s s i b l e de c o l o r e r s p é c i f i q u e m e n t l e s noyaux c e l l u l a i r e s par l e v e r t de méthgrl en m i l i e u a c i d e (en p r é s e n c e d ' a c i d e a c é t i q u e p a r e x e m p l e ; ; Unna eut l ' i d é e d ' a j o u t e r au v e r t de m ê t h y l e un second c o l o r a n t b a s i q u e , l a p y r o n i n e , a f i n de r e n d r e l e s images p l u s l i s i b l e s . I l o b t i n t a i n s i des p r é p a r a t i o n s oû l a chromatine se c o l o r e en v e r t , a l o r s que l e s n u c l é o l e s e t c e r t a i n e s g r a n u l a t i o n s c y t o p l a s m i q u e s s e t e i n t e n t en r o u g e .
Unna c h e r c h a immédiatement à donner u n e e x p l i c a t i o n c h i mique de c e t t e a f f i n i t é d i f f é r e n t i e l l e de c e r t a i n s éléments c e l l u -l a i r e s pour -l e s deux c o -l o r a n t s : i -l p e n s a d ' a b o r d que -l a p y r o n i n e c o l o r e r a i t c e r t a i n e s p r o t é i n e s , p u i s i l émit l ' h y p o t h è s e que l e
l a c e l l u l e a l o r s que l a p y r o n i n e a u r a i t une a f f i n i t é pour l e » l i -eux f o r t o a e n t r é d u c t e u r s ( " r e d u k t i o n s f r e u n d l i c h " ) .
C e t t e e x p l i c a t i o n p a r u t t r è s v i t e f a n t a i s i s t e e t e l l e
f u t sévèrement e t j u s t e m e n t c r i t i q u é e p a r v , K t t l l e n d o r f f e t par Vexmal. Par l a s u i t e » B r a c h e t p o r t e l e coup de g r â c e à l ' h y p o t h è s e de TJnna en m o n t r a n t que l e b l o c a g e des groupes s u l f h y d r i l e s des p r o t é i n e s (qui s o n t l e s p r i n c i p a u x groupaaaents r é d u c t e u r s c o n s e r -v é s dans l e s p r é p a r a t i o n s h i s t o l o g i q u e s j par l ' a c i d e mono-iodacé-t i q u e n ' e n mono-iodacé-t r a î n e aucun changemenmono-iodacé-t de l a c o l o r a b i l i mono-iodacé-t é à l a p y r o n i n e .
La f a i b l e s s e des h y p o t h è s e s écnises p a r Unna pour exp l i q u e r l e mécanisme de l a c o l o r a t i o n exp a r l e v e r t de m é t h y l e exp y r o -n i -n e a rapideme-nt i -n c i t é l e s h i s t o l o g i s t e s à r e -n o -n c e r à l ' e m p l o i de ce c o l o r ê - n t j on ne s ' e n s e r v a i t p l u s g u è r e q u ' e n h f c i e t o l o g i e , quand B r a c h e t l ' u t i l i s a à nouveau avec l ' e s p o i r q u ' i l p a r v i e n d r a i t i d é c e l e r 1 ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e dans l e cytoplasme c e s c e l l u l e s . I l a v a i t en e f f e t m o n t r é que c e t a c i d e , q u ' o n c r o y a i t a l o r s ê t r e un
c o n s t i t u a n t s t r i c t e i a e n t v é g é t a l , se r e n c o n t r e dans de nombreux o e u f s , où s a l o c a l i s a t i o n ne p e u t ê t r e que c y t o p l a s m i q u e . i ^ a i s , même dans ces o e u f s , l e noyau s e u l se c o l o r a i t par l e v e r t de m é t h y l e , qui é t a i t r é p u t é s p é c i f i q u e des a c i d e s n u c l é i q u e s ; l e c y t o p l a s m e , mal-g r é l a p r é s e n c e c e r t a i n e d ' a c i d e r i b o n u c l è i q u e , f i x a i t avec a v i d i t é l a p y r o n i n e . L ' a n a l y s e de ces r é s u l t a t s e t l ' u t i l i s a t i o n peu a p r è s p a r B r a c h e t de l a r i b o n u c l é a s e l e c o n d u i s i r e n t à l a c o n c l u s i o n e u i -v a n t e i s i l e -v e r t de l A ê t h y l e c o l o r e en e f f e t spécifiqu«^aent l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e , l a p y r o n i n e s e f i x e ê l e c t i v e t a e n t s u r l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e . C e t t e c o n c l u s i o n a é t é c o n f i r m é e d e p u i s par de nombrettx a u t e u r s e t on n e c o n n a î t que d e r a r e s e x c e p t i o n s à l a r è g l e , s u r
l e s q u e l l e s nous r e v i e n d r o n s l o r s de l a d i s c u s e i o n da nos propres-r é s u l t a t s . i:iais i l f a u t propres-r e c o n n a î t propres-r e que nous i g n o propres-r o n s t o u t encopropres-re des r a i s o n s pour l e s q u e l l e s l e s deux c o l o r a n t s b a s i q u e s se f i x e n t s p é c i f i q u e m e n t s u r un a c i d e n u c l é i q u e de l ' u n ou de l ' a u t r e t y p e : c ' e s t c e t t e énigiae que nous avons t e n t é de d é b r o u i l l e r .
A v a n t d ' e x p o s e r l a m a n i è r e dont nous avons abordé l e p r o
-blème, nous croyons u t i l e de r e v e n i r rapidement s u r l a composition du mélange de I^nna. Le v e r t de m é t h y l e , dont l a c o n s t i t u t t o n a é t é é c l a i r c i e p a r Hoftoan dès 1873, e s t l e c h l o r o - (ou é v e n t u e l l e m e n t l ' i o d o - ) m é t h y l a t e de c h l o r u r e d ' h e x a m é t h y l e p a r a r o s e n i l i n e ; en v o i c i l a f o r -b e l o n î e t e r s o n , Conn e t K e l i n , l e p r o d u i t commercial s e r a i t l e c h l o r u r e double de z i n c e t du bromure d ' é t l ^ l e h e x a m é t h y l e p a r a -r o s a n i l i n e » Co7H35ÎJ^ClB-r + ZnClj>.
Le v e r ï de m é t h y l e e s t presque t o u j o u r s contaminé par l a p r é -sence de v i o l e t de m é t h y l e j i l e s t d ' u s a g e , en h i s t o l o g i e , de l e
C ' e s t une s u b s t a n c e a s s e z f o r t e m e n t f l u o r e s c e n t e , suscept l b l e de donner un v i r a g e mésusceptachromasusceptique en p r é s e n c e de s u b s suscept a n
-ces comme l e s g l y c o p r o t l i d e s (mucus» c a r t i l a g e ) , a i n s i que l ' a s i g n a l é B r a c h e t .
L ' a l c o o l i n t e r v i e n t dans l e mélange de linna pour- f a v o r i s e r l a m i s e en s o l u t i o n des c o l o r a n t s , t a n d i s que l e r&le de l a
glj^c é r i n e demeure i n glj^c e r t a i n , vouant eu p h é n o l , on a pensé q i i ' i l i n -t e n s i f i e r a i -t l a c o l o r a -t i o n de f a ç o n s p é c i f i q u e (Pos-t) ; mais i l semble c e r t a i n m a i n t e n a n t q u ' i l i n t e r v i e n n e seulement en a b a i s s a n t l e pH, La p r é s e n c e oe phénol e s t également u t i l e pour f a v o -r i s e -r l a c o n s e -r v a t i o n du mélange: l ' a c t i o n b a c t é -r i c i d e de l a py-r o n l n e e s t en e f f e t t py-r è s modépy-rée à l ' i n v e py-r s e de ce q u ' o n obsepy-rve pour l e v e r t de m é t h y l e .
La n a t u r e des c o l o r a n t e u t i l i s é s a c e r t a i n e m e n t une grands importance; nous n ' a v o n s cependant pas e n t r e p r i s de p u r i f i c a t i o n poussée de ceux que nous avions à n o t r e d i s p o s i t i o n , p e r c e q u ' i l
é t a i t e s s e n t i e l d ' u t i l i s e r des p r o d u i t s qui donnent de bons r é -s u l t a t -s l o r -s q u ' o n l e -s emploie dan-s de-s b u t -s h i -s t o c h i m i q u e -s . Le-s c o l o r a n t s de l a marque Grttbler dont nous nous sommes s e r v i s » don-n a i e don-n t e don-n t i è r e s a t i s f a c t i o don-n â c e t é g a r d .
C. ïlan du t r a v a i l .
I l nous a paru l o g i q u e d ' a d m e t t r e , conme hypothèse de dé-p a r t , q u ' i l se forme des comdé-plexes e n t r e l e s c o l o r a n t s b a s i q u e s
e t l e s a c i d e s n u c l é i q u e s . On s a i t , en e f f e t , que de nombreux aut e u r s ( P e u l g e n , Hammarsauten) onaut obautenu l a p r é c i p i aut a aut i o n oes a c i -des n u c l é i q u e s par c e r t a i n s c o l o r a n t s b a s i q u e s ; l ' a d d i t i o n de c r i t a l v i o l e t à des e x t r a i t s c e l l u l a i r e s c o n s t i t u e même l ' u n e des é t a p e s dans l ' i s o l e m e n t e t l e p u r i f i c a t i o n de l ' a c i d e d è s o x y r i b o -n u c l é i q u e p a r l a méthode de ï ' e u l g e -n .
I l I m p o r t a i t donc de r e c h e r c h e r l a manière dont l e s a c i d e s n u c l é i q u e s des deux t y p e s se comportent i n v i t r o v i s - à - v i s du v e r t de méthyle d ' u n e p a r t , de l a pyronine de l ' a u t r e , t o u t en f a i s a n t v a r i e r l e s c o n d i t i o n s e x p é r i m e n t a l e s ( c o n c e n t r a t i o n s de l ' a c i d e n u c l é i q u e e t du c o l o r a n t , pH). H a i s i l ne f a l l a i t pas per d r e de vue non p l u s que l e s c o n d i t i o n s r é a l i s é e s dans l e cas des coupes h l s t o l o g l q u e s r i s q u e n t d ' ê t r e b i e n d i f f é r e n t e s de c e l l e s ^ui s e r e n c o n t r e n t l o r s q u ' o n mélange des s o l u t i o n s dans un t u b e a e s s a i : des phénomènes d ' a d s o r p t i o n sont en e f f e t s u s c e p t i b l e s de J o u e r un r ô l e beaucoup plue i m p o r t a n t dans l e p r a n l e r c a s .
CH
» 3
I l convenait donc, en premier l i e u , de se r a p p r o c h e r des condi-' t i e n s oiî t r a v a i l l e n t l e s c y t o c h i m i s t e e et d condi-' a n a l y s e r l e mode>
d*a c t i o n des deux c o l o r d*a n t s v i s à v i s de coupes p r d*a t i q u é e s à t r d*a -v e r s des a c i d e s n u c l é i q u e s ou des n u c l é o p r o t é i d e s de composition b i e n connue, , . . .
I l e s t extrènement d i f f i c i l e de p r a t i q u e r des coupes au • microtome à t r a v e r s une poudre d ' a c i d e dèsoxy- ou r i b o n u c l ê i q u e
et ce n ' e s t que t o u t à l a f i n de n o t r e t r a v a i l que nous avons pu v a i n c r e l e s g r o s s e s d i f f i c u l t é s t e c h n i q u e s a u x q u e l l e s nous noue h e u r t i o n s ; c ' e s t p o u r q u o i , dans l a p l u p a r t des e x p é r i e n c e s , nous
avons u t i l i s é des f r o t t i s de n u c l é o p r o t é i d e s au l i e u de coupes h i s t o l o g i q u e s d ' a c i d e s n u c l é i q u e s . C e t t e manière de f a i r e n ' a d ' a i l l e u r s pas s e u l a n e n t des avantages p r a t i q u e s : c ' e s t en e f f e t
BOUS forme de n u c l é o p r o t é i d e s e t non pas d ' a c i d e s n u c l é i q u e s l i b r e s que ces corps se t r o u v e n t dans l e s c e l l u l e s . Les n u c l é o -p r o t é i d e s u t i l i s é s é t a l a n t la nuclfeohistone (à b a s e d ' a c i d e dés-o x j ' r i b dés-o n u c l ê i q u e ) e t de l a l e v u r e s é c h é e , qui c dés-o n t i e n t de grances q u a n t i t é s d ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e .
C ' e s t au moment où n o t r e t r a v a i l t i r a i t à sa f i n que nous avons eu c o n n a i s s a n c e d ' u n e hypothèse n o u v e l l e sur l e mécanisme de l a c o l o r a t i o n de Unnax e l l e a é t é proposée par un Jeune
cher-cheur a m é r i c a i n , Kurnick, qui pense que l e v e r t de méthyle a u r a i t une a f f i n i t é s p é c i a l e pour l e s a c i d e s n u c l é i q u e s à l ' é t a t f o r t e -ment p o l y m é r i s é a l o r s que l a pyronine se f i x e r a i t sur l e s a c i a e e
n u c l é i q u e s à l ' é t a t c ê p o l y m é r i s é ; on se s o u v i e n t de ce que l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e , qui prend f o r t e m e n t l a p y r o n i n e , e s t e f f e c t i v e m e n t beaucoup moins hautement polymérisé que l ' a c i d e d é s o s ^ r i b o n u c l é i q u e .
La communication de Kurnick é t a i t extrêmement b r è v e e t 1 ' a u t e u r ne d o n n a i t que t r è s peu de d é t a i l s s u r s e s e x p é r i e n c e s ; i l nous a donc pai'u n é c e s s a i r e de f a i r e une s é r i e d ' e x p é r i e n c e s pour v é r i f i e r l ' h y p o t h è s e de t r a v a i l de Kurnick,
En somme, nojtre t r a v a i l comporte 3 p a r t i e s d i s t i n c t e s : 1) Mous avons t o u t d ' a b o r d é t u d i é l e comportement de l a pyronine e t du v e r t de m é t h y l e , p r i e séparément, v l s - è - v i s de f r o t t i s de n u c l é o p r o t é i d e s , a f i n de nous r a p p r o c h e r des c o n d i t i o n s où t r a -v a i l l e n t l e s c y t o l o g i s t e s . Mous a-vons s u r t o u t examiné l ' i n f l u e n c e du pH s u r l ' i n t e n s i t é des c o l o r a t i o n s .
2) lidus avons e n s u i t e procédé à des e s s a i s i n v i t r o , a f i n de r e -chercher s i l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e p r é c i p i t e r a i t p l u s aisément par l a p y r o n i n e que p a r l e v e r t de méthyle e t s i l ' a c i d e désoxyribon u c l é i q u e f o r m e r a i t , au c o désoxyribon t r a i r e , p l u s aisémedésoxyribont l e s complexes i désoxyribon -s o l u b l e -s avec l e vertjî!' de méthyle que l a p y r o n i n e . I c i a u -s -s i , l e -s r é a c t i o n s ont é t é s u i v i e s è d i f f é r e n t e pH,
3) E n f i n , nous avons r e c h e r c h é à v é r i f i e r l e b i e n - f o n d é de l a théo-r i e n o u v e l l e de Kuthéo-rnick en p théo-r é p a théo-r a n t des a c i d e s n u c l é i q u e s des deux t y p e s , d i f f é r a n t f o r t e m e n t par l e u r d e g r é de p o l y m é r i s a t i o n . Bous avons e n s u i t e é t u d i é l a f a ç o n dont ces corps se comportent v i s à -v i s du mélange -v e r t de méthyle - p y r o n i n e .
I I . RESULTAIS EXPiJtOIEKI^X.
A. C o l o r a t i o n de f r o t t i s de l e v u r e e t de n u c l é o h i s t o n e par l e
v e r t de mfethyle e t par l a p y r o n l n e a d i f f é r e n t s yh, •
a) Technique; On admet en g é n é r a l que l e s c o l o r a n t s b a s i q u e s ee f i x e n t s u r l e s noyaux c e l l u l a i r e s avec une i n t e n s i t é c r o i s s a n t e à mesure que l e pli s ' é l è v e ( h a y n e s , t i s c h i n g e r , Z e i g e r , K e l l e y e t A^iller» B r a c h e t ) . h a i s l a p l u p a r t de ces a u t e u r s n ' o n t pas f a i t de mesures q u a n t i t a t i v e s et i l s n ' o n t b a s é l e u r s c o n c l u s i o n s que s u r de s i m p l e s i m p r e s s i o n s v i s u e l l e s .
MOMB avons pu t o u r n e r l a d i f f i c u l t é en u t i l i s a n t une
t e c h n i q u e qui f u t u t i l i s é e avec succès p a r B r a c h e t e t J e e n « r ,
p u i s p a r ^*iiamie, i i l l e c o n s i s t e à p i p e t t e r , au moyen d ' u n e m i c r o p i
-p e t t e à c o n s t r i o t l o n , un volvune connu de l a s u b s t a n c e à é t u d i e r ( s u s p e n s i o n de l e v u r e » s o l u t i o n de n u o l é o h i s t o n e ) dans t r o i s dé-p r e s s i o n s c r e u s é e s dans une lame r o d é e . On dé-p r é dé-p a r e un c e r t a i n nombre c e lames de c e t t e f a ç o n , p u i s on l e s f a i t s é c h e r s u r une p l a q u e m é t a l l i q u e r e c o u v r a n t un b a i n - m a r i e b o u i l l a n t . On plonge a l o r s l e s lames pendant 20 m i n u t e s dans l e c o l o r a n t en s o l u t i o n tamponnée. On r i n c e à l ' e a u d i s t i l l é e e t on é l i m i n e l ' e x c è s de c o l o r a n t p a r deux b a i n s dans l ' a l c o o l à 94<^, pendant 20 e t 4C m i n u t e s r e s p e c t i v a n e n t . On l i b è r e e n s u i t e l e c o l o r a n t qui e s t demeuré f i x e s o l i d e m e n t au f r o t t i s par l ' a d d i t i o n de quelques g o u t t e s de HCl (K pour l a p y r o n l n e , K/lOO pour l e v e r t de m è t h y l e , qui e s t i n s t a b l e en m i l i e u f o r t e m e n t a c i d e ) . Le c o l o r e n t , qui a é t é mis en s o l u t i o n par ce moyen, e s t amené à un voliuae de 2 ce
dans une p e t i t e f i o l e v o l u m ê t r i q u e . On mesure e n f i n l ' e x t i n c t i o n des s o l u t i o n s au photomètre de i t u l f r i c h en u t i l i s a n t des m i c r o -cuves de 20 mm d ' é p a i s s e u r e t un f i l t r e a p p r o p r i é (iJo.lJ avec
t r a n s p a r e n c e maxima à ^Sô mf^ pour l a p y r o n l n e e t ho,M avec traAs-p a t e n c e maxima à 42.6 m ^ traAs-p o u r l e v e r t de m é t h y l e ) .
Les c o l o r a n t s u t i l i s é s é t a i e n t s o i t l e v e r t de méthyle è. 0,3/l>« s o i t l a p y r o n l n e à 0 , 5 ^ dans l ' e a u d i s t i l l é e ; ces s o l u -t i o n s é -t a i e n -t mélangées avan-t l ' e m p l o i , avec un volume é g a l de tosapon aux p h o s p h a t e s monopotaeslque e t b l a o d i q u e ou de tampon au g l y o o c o l l e . Ce d e r n i e r a l ' a v a n t a g e de p e r m e t t r e l ' o b t e n t i o n de s o l u t i o n s tamponnées dont l e pH v a r i e de 1 à 1 3 . Le pH du mél a n g e a i n s i obtenu ( c o mél o r a n t p mél u s tampon) é t a i t chaque f o i s v é -r i f i é à l ' a i d e d ' u n e é l e c t -r o d e à l a q u l n h y d -r o n e . Un c e -r t a i n déc a l a g e e n t r e l e déc h i f f r e t h é o r i q u e e t l e déc h i f f r e obtenu s ' o b s e r -v a i t » en r a i s o n de l ' a c i d i t é de l a s o l u t i o n de c o l o r a n t dans 1 ' eau d i s t i l l é e } l a s o l u t i o n s t o c k de p y r o n l n e a v a i t en e f f e t un pH d ' e n v i r o n 3 , 5 , c e l l e de v e r t de m é t h y l e un pH v o i s i n de 4 , 6 . A p r è s ce b r e f exposé de l a t e c h n i q u e s u i v i e , examinons
m a i n t e n a n t l e s r é s u l t a t s obtenus r e s p e c t i v e s t e n t dans l e cas de l a s u s p e n s i o n de l e v u r e e t dans c e l u i de l a n u c l é o h i s t o n e .
- 10
f i x a t i o n p a r ce m a t é r i e l d ' u n a u t r e c o l o r a n t b a B i q u e , l e b i a u de>
t o l u i c i n e . La l e v u r e ee p r ê t e p a r t i c u l i è r e m e n t bierl è ce genre^ de
t r a v a i l , p a r c e q u ' e l l e e s t t r è s r i c h e on a c i d e r i b o n u c l ë i q u e « ( a c i
de zymonuclfeique), t a n d i s q u ' e l l e ne c o n t i e n t que dee t r a c e s i n -d o s a b l e e -d ' a c i -d e -d è s o x y r i b o n u c l é i q u e , r e n f e r m é -dans un minu8<:ule> noyau.
Les r é s u l t a t s de ces e x p é r i e n c e s s o n t exprimés g r a p h i q u e -ment p e r l e s diagrammes I ( s e r a p p o r t a n t exclueivecient è l a
pyro-n i pyro-n e ) , I I , I I I , IV e t V. Opyro-n v o i t que l ' i pyro-n f l u e pyro-n c e dB pH s u r l a quapyro-n- quan-t i quan-t é de c o l o r a n quan-t f i x é e s quan-t c o n s i d é r a b l e e quan-t que de minimes v a r i a quan-t i o n s de pH peuvent e x e r c e r une i n f l u e n c e énorme à c e t é g a r d . C ' e s t l à un p o i n t dont i l conviendra de t e n i r compte s é r i e u s e m e n t , chaque f o i s q u ' o n t e n t e r a de d é t e r m i n e r avec un d i s p o s i t i f m i c r o s p e c t r o -p h o t o m é t r i q u e ( c f . R i s e t t o l l i s t e r ) l a t e n e u r en a c i d e s n u c l é i q u e s
des éléments c o n s t i t u t i f s de l a c e l l u l e en m e s u r a n t l e s q u a n t i t é s v e r t de m é t h y l e e t de p y r o n i n e f i x é e s .
Sur l e s diaferemmes I I s V, nous avons i n d i q u é en rouge l e s r é s u l t a t s o b t e n u s pour l a p y r o n i n e f i x é e aiix d i f f é r e n t s | ^ r é e l s , en v e r t ceux r e l a t i f s au v e r t de m é t h y l e . Les ootirbes d e s s i -nées en n o i r i n d i q u e n t l e pH t h é o r i q u e des s o l u t i o n s . Comme on p e u t l e c o n s t a t e r , l e s r é s u l t a t s se r e s s e m b l e n t f o r t e m e n t d ' u n e e x p é r i e n c e è l ' a u t r e e t i l s m o n t r e n t de grandes d i f f é r e n c e s s u i v a n t l e c o l o r a n t employé: l e v e r t de m é t h y l e ne com-mence à se f i x e r s u r l e s f r o t t i s de l e v u r e , do m a n i è r e a p p r é c i a b l e , q u ' à p a r t i r du pH 3; l a q u a n t i t é de c o l o r a n t f i x é e 8ur l e s c e l l u l e » augmente e n s u i t e rapidement e t f o r t e m e n t , à mesure que l e pli s ' é l è -v e . Au c o n t r a i r e , l e s c e l l u l e s p r e n n e n t d é j è f o r t e m e n t l a p y r o n i n e
à des pH i n f é r i e u r s è 3; l a courbe s ' é l è v e , pour a t t e i n d r e un coejci-mum e n t r e pH 3 e t 4; maie au dessus de pK 4, l a q u a n t i t é de
pyron i pyron e f i x é e per l e s f r o t t i s de l e v u r e d é c r o î t r a p i d e m e pyron t . I l apyron r é -s u l t e q u ' e n m i l i e u a c i d e , -se -s i t u a n t aux e n v i r o n -s de pH 3 à 4, l e -s f r o t t i s r i c h e s en a c i d e r i b o n u c l ë i q u e f i x e n t en g é n é r a l notablement p l u s de p y r o n i n e que de v e r t de m é t h y l e .
Voyons m a i n t e n a n t comment s e comportent des f r o t t i s de nue l é o h i s t o n nue où c ' nue s t l ' a c i d nue dfnuesoxyribonucléiqunue qui prédominnue f o r -t e m e n -t .
c) C o l o r a t i o n des f r o t t i s de n u c l é o h i s t o n e : La n u c l ê o h i s t o n e a é t é p r é p a r é e a p a r t i r de noyaux i s o l é s de g l o b u l e s rouges d ' o i s e a u x par l a méthode u t i l i s é e dans ce l a b o r a t o i r e par J e e n e r e t p a r i - r r e r a
( l y s e des g l o b u l e s r o u g e s , e x t r a c t i o n des noyaux par iiCl 0 , 6 K, p r é -c i p i t a t i o n par l ' e a u d i s t i l l é e ; p u r i f i -c a t i o n p a r r e m i s e s en s o l u t i o n r é p é t é e s dans KCl 0 , 6 k e t p r é c i p i t a t i o n per d i l u t i o n ) , £jn r a i s o n de l ' i n s o l u b i l i t é dans l ' e a u de l a n u c l é o h i s t o n e , l e s f r o t t i s é t a i e n t f a i t s en déposant s u r l e s lames de v e r r e r o d é e s un &liquod d ' u n e s o l u t i o n de ce n u c l é o p r o t è i d e dans l e l i q u i d e d ' j i d s a l l (KCl 0 , 6 M, a d d i t i o n n é de CÛ^MaH Jusque pK 8 , 6 ) . La t e n e u r en a c i d e d'esojqrribonucléique de c e t ï e s o l u t i o n é t a i t dosée par l a méthode c o l o r i m é t r i q u e de D i s c h e , m o d i f i é e p e r Lavidson ( r é a c t i o n
à l a diphénylamine du c é s o x y r i b o s e ) j l a s o l u t i o n de n u c l é o h i s t o n e é t a i t d i l u é e . J u s t e avant l ' e m p l o i , avec du l i q u i d e d ' E d s a l l de ma-n i è r e à ce que s a c o ma-n c e ma-n t r a t i o ma-n f i ma-n a l e ema-n a c i d e dfesoxyriboma-nucléique s o i t de 0 , 3 ^ . JËn r a i s o n du c a r a c t è r e f o r t a n e n t h y g r o s c o p i q u e de l a n u c l é o h i s t o n e , l e s f r o t t i s qui n ' é t a i e n t pas c o l o r é s immédiatement
Lm» r & s u l t a t B obtenus sont a p p a r e n t s sur l e s graphiques^ Vï»
VXIet V I I I : nous y r e t r o u v o n s une courbe a s c e n d a n t e en f o n c t i o n du pH pour l e v e r t de mètbyle» maie l a montëe y e s t beaucpup-plus r a p i d e e t e l l e e s t d é j à t r è s a p p a r e n t e e n t r e pH 1 e t 2 . ^ u a n t à
l a courbe de l a p y r o n i n e , e l l e tend c e t t e f o i s à d e s c e n d r e , ' d«-maniôre p l u s ou moins r é g u l i è r e , à mesure que l e pK s ' é l è v e .
Si on f a i t a b s t r a c t i o n de l ' a l l u r e e r r a t i q u e de l a courbe r e p r o d u i t e pour l a pyronine sur l e graphique VI, on v o i t que l e s f r o t t i s de n u e l ë o h i s t o n e t e n d e n t è f i x e r beaucpjip p l u s de v e r t de m é t h y l e que de pyronine à des pH s i t u é s e n t r e 3 e t 4 . à c e t
égardf l a d i f f é r e n c e avec l e s r é s u l t a t s obtenus dans l e cas des f r o t t i s de l e v u r e e s t extrêmement n e t t e e t e l l e rend f o r t b i e a compte des r é s u l t a t s obtenus en c y t o c h i m i e .
C e t t e première s é r i e d ' e x p é r i e n c e s met donc l ' a c c e n t sur l a n é c e s s i t é d ' u n c o n t r ô l e r i g o u r e u x du pK l o r s q u ' o n veut u t i l i s e r
l a c o l o r a t i o n au v e r t de methyle p y r o n i n e en c y t o c h i m i e , s u r -t o u -t avec des v i s é e s q u a n -t i -t a -t i v e s . i:&l-t;lle nous mon-tre en o u -t r e que c ' e s t s u r t o u t l e comportement de l a p y r o n i n e q u i , aux d i v e r s pH, e s t i n f l u e n c é par l a p r é s e n c e de l ' u n ou de l ' a u t r e type d ' a c i d e n u c l é i q u e . E n f i n , noue pouvons c o n c l u r e que l e s g é n é r a l i s a t i o n s f a i t e s par P i s c h i n g e r e t par v . î i f l l l e n d o r f f e t i i r e b s , qui pensent que l e s c o l o r a n t s b a s i q u e s c o l o r e n t avec p l u s d ' i n t e n s i t é en
mi-l i e u b a s i q u e e t mi-l e s c o mi-l o r a n t s a c i d e s en m i mi-l i e u a c i d e , ne peuvent ê t r e a c c e p t é e s sens r é s e r v e s : l a p y r o n i n e , s u r t o u t en p r é s e n c e d ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l ê i q u e , f a i t nettement e x c e p t i o n à c e t t e r è ^ l e .
Jùcaminons m a i n t e n a n t s i l e s e x p é r i e n c e s que nous avons f a i t e s s u r l a p r é c i p i t a t i o n des a c i d e s n u c l é i q u e s par l e s c o l o r a n t s ba-s i q u e ba-s i n v i t r o ne nouba-s p e r m e t t r o n t paba-s d ' a l l e r un peu p l u ba-s l o i n . B . La p r é c i p i t a t i o n i n v i t r o des a c i d e s n u c l é i q u e s par des
colo-r a n t s b a s i q u e s . Le b u t p r i n c i p a l de ces e s s a i s é t a i t n a t u r e l l e m e n t de r e c h e r c h e r s i l a pyronine ne p r é c i p i t e r a i t pas è l e c t i v e m e n t 1 ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e , a l o r s que l e v e r t de méthyle p r é c i p i t e r a i t l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l ê i q u e . La l i t t é r a t u r e s c i e n t i f i q u e ne c o n t i e n t pas de données p r é c i s e s à c e t é g a r d , b i e n que de nombreux a u t e t i r s , f e u l g e n eh p a r t i c u l i e r , a i e n t é t u d i é d ' a u t r e s c o l o r a n t s b a s i q u e s ( v e r t ma-l a c h i t e , c r i s t a ma-l v i o ma-l e t , b ma-l e u de m é t h y ma-l è n e ) . La p ma-l u p a r t de ces t r a v a u x ne r e n f e r m e n t aucune donnée q u a n t i t a t i v e e t , l e p l u s souv e n t , l a n a t u r e de l ' a c i d e n u e l é i q u e u t i l i s é n ' e s t même pas p r ê
12
-pour des su'bstanoeB n a t u r e l l e s t e l l e s que l a nuol&ohistone* >
En ce qui concerne l e v e r t de m è t h y l e , un vieux t r a
v a i l de HammaxBten s i g n a l e q u ' i l p r é c i p i t e r a i t " l ' a c i d e n u c l é -ique"} l a chose e s t p l u s c e r t a i n e dans l e cas de l a pyronine-» p u i s q u e l e oomplexe e n t r e l a pyronine e t l ' a c i d e zymonuclèique
a pu ê t r e i s o l e p a r ochumacherf qui a fetudife quelques unes de s e s p r o p r i é t é s ( s o l u b i l i t é dans l ' e a u chaude e t en m i l i e u a l c a -l i n , i n s o -l u b i -l i t é dane -l ' a -l c o o -l e t -l ' é t h e r , extrême -l a b i -l i t ê eh m i l i e u a c i d e ) . La p r é c i p i t a t i o n de l ' a c i d e zymonucléique par l a
pyronine a é t é confirmée par Brossa u l t é r i e u r e m e n t .
Jbious avons é t u d i é e systématiquement l e s e f f e t s du v e r t de mèthyle e t de l a pyronine sur l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e de l a 1-e-vure e t l ' a c i d e désojcyribonucléique du thymus ( a c i d e
thymonuclé-ique). C e l | i i - c i s e t r o u v a i t sous sa forme n a t i v e , hautement polym é r i s é e e t nous l ' a v o n s p u r i f i é par d i a l y s e prolongée et p r é c i
-p i t a t i o n r é -p é t é e -par l ' a l c o o l . I l e s t à n o t e r que l e s e s s a i e des a u t r e s a u t e u r s ont presque c e r t a i n e m e n t t o u j o u r s p o r t é s o i t sur de l ' a c i d e zymonucléique, s o i t sur de l ' a c i d e thymonucléique dé-p o l y m é r i s é . I l nous a dé-paru q u ' i l y a v a i t i n t é r ê t è u t i l i s e r au
c o n t r a i r e des p r o d u i t s i s o l é s par des méthodes douces e t d ' é v i t e r l e u r a l t é r a t i o n dans t o u t e l a mesure du p o s s i b l e .
Les e x p é r i e n c e s c o n s i s t a i e n t à mélsnger des s o l u t i o n s de c o l o r a n t e t d ' a c i d e n u c l é i q u e , è l a i s s e r l e s t u b e s à l a g l a c i è r e pendant 24 h e u r e s , a p r è s c e n t r i f u g a t i o n d ' u n é v e n t u e l p r é -c i p i t é , à mesurer au photomètre de ï - u l f r l -c h l a q u a n t i t é de - colo-r a n t colo-r e s t e n t en s o l u t i o n . En f a i s a n t v a colo-r i e colo-r l e s p colo-r o p o colo-r t i o n s de c o l o r a n t e t d ' a c i d e n u c l é i q u e , i l é t a i t p o s s i b l e de d é t e r m i n e r s ' i l y a une p r o p o r t i o n optima, correspondant à une r e l a t i o n s t o e -<iiiomètrique.
L ' a u t r e p a r t , nous avons examiné l ' e f f e t de v a r i a t i o n du pH sur c e t t e r é a c t i o n de p r é c i p i t a t i o n de l ' a c i d e n u c l é i q u e par
l e c d i o r a n t b a s i q u e , a f i n de d é c e l e r des d i f f é r e n c e s é v e n t u e l l e s s u i v a n t l e c o l o r a n t e t l ' a c i d e n u c l é i q u e c h o i s i .
t o u r que ces expériences a i e n t une s i g n i f i c a t i o n q u e l -conque, i l é t a i t i n d i s p e n s a b l e de p r e n d r e c e r t a i n e s p r é c e u t i o n s p r é a l a b l e s : i l i m p o r t a i t t o u t d ' a b o r d de r e c h e r c h e r s i l e s deux c o l o r a n t s employés s u i v e n t convenablement l a l o i de Beer - Lambert] i l c o n v e n a i t de r e c h e r c h e r e n s u i t e l ' i n f l u e n c e du pH s u r l ' i n t e n -s i t é de l a c o l o r a t i o n . E n f i n , t l é t -s i t n é c e -s -s a i r e de v é r i f i e r à quel pK l e s a c i d e s n u c l é i q u e s p r é c i p i t e n t en l ' a b s e n c e du colo-r a n t , p u i s q u ' o n s a i t que ces s u b s t a n c e s sont i n s o l u b l e s en m i l i « u
f o r t e m e n t a c i d e .
Voiei l e r é s u l t a t de ces e s s a i s p r é l i m i n a i r e s :
1) V a l i d i t é de l a l o i de Beer Lambert pour l a pyronine e t l e v e r t de m è t h y l e : I n f l u e n c e du pH; Kous avons procédé A des d i l u -t i o n s s u c c e s s i v e s de nos s o l u -t i o n s de d é p a r -t de p y r o n i n e (C,5/i) e t de v e r t de mèthyle (0,Sîw) e t mesuré l ' e x t i n c t i o n au photomètre
de P u l f r i o h en u t i l i i a n t l e s f i l t r e s No. f (maximum è.hii'^^) pour
l a p y r o n i n e et uo .'^ (maximum à éio*.^) pour l e v e r t de m è t h y l e .
Le t a b l e a u 'Mo,!, (page 13) e t l e graphique i!«o.(X i n d i q u e n t l e r é s u l t a t de ces e s s a i s :
è t 6 %t&l3ll récemment a u s s i par K i c h a e l i s ; c e t a u t e u r n ' a pas ob-t e n u de concordance aTec l a l o i de Beer pour l a pyronlne» mais l e c o l o r a n t dont i l s ' e s t s e r v i H a i t c e r t a i n e m e n t d i f f é r e n t au nô-t r e : l a p y r o n i n e u nô-t i l i s é e par L i c h a e l i s é nô-t a i nô-t en e f f e nô-t impropre à l a c o l o r a t i o n des coupes par l a méthode de Unna (communication > p e r s o n n e l l e du P r o f e s s e u r B r a c h e t ) .
E ' a u t r e p a r t , l e p y r o n i n e e t l e v e r t de m é t h y l e c o n t i n u e n t À oltéir à l a l o i de Beer m&ne s i on ne prend pas l a p r é c a u t i o n de u a i n t e n l r l e pH c o n s t a n t au cas des d i l u t i o n s s u c c e s s l v e e t ces
va-r i a t i o n s de pH a l l a n t de 1 , 5 à 8 se s o n t m o n t va-r é e s sans i n f l u e n c e s u r l ' i n t e n s i t é de l e c o l o r a t i o n . ube LiO.tl 4 T A B L S E U 2J0. I . S ? ' Y AO. l V t 1 / 8 1/16 1 / 3 2 1 / 6 4 1/128 1/356 1/712 1/1424 1/2828 d i l u t . p y r o n i n e . t r o p oono. 1»56 0 , 7 9 0 , 3 9 0 , 1 9 0 , 0 9 5 0 , 0 5 t r o p f a i b l e , jsixtinction. 3 , 8 4 , 8 - 5 7 - 8 pH. 1 / 6 1/12 1 / 2 4 1 / 4 8 1/96 1/192 1/384 1/768 1/1536 1/3072 d i l u t . v . d e m. t r o p c o n c e n t r é 1,40 0 , 6 9 0 , 3 2 0 , 1 5 0 , 0 8 0 , 0 5 E x t i n c t i o n * 6 pH 2) T>H de p r é c i p i t a t i o n des a c i d e s n u c l é i q u e s en l ' a b s e n c e de o o l o r a n t î Une q u a n t i t é connue d ' a c i d e r i b o - ou dfesoxyrl-oonu-c l é i q u e ( s o l u t i o n à 0 , 3 ^ ) a é t é a j o u t é e , au moyen d ' u n e p i p e t t e , dans des tubes c o n t e n a n t de l ' a c i d e o h l o r h y d r i q u e e t de l ' e a u melazxgès dans l e s c o n d i t i o n s i n d i q u é e s c i - a p r è s : T A B L E A U Mo, I I . ï u b e H o . : 1 2 3 4 6 6 7 8 5 4 3 2 1 0 , 5 0 , 2 5 0 ce HOl n / 5 0 1 2 3 4 4 , 5 4 , 7 5 5 ce HgO d i s t . Après une n u i t à l a g l a c i è r e , on se d é b a r r a s s e d e s p r é c i p i t é s par c e n t r i f u g a t i o n e t on mesure l e pH c» l i q u i d e
14
î l a i n t e n a n t que nous disposons des b a s é e qui noue é t a l e n t - né-e né-e s a a l r né-e né-e yfOVTVT0g;£9BBné-eY, nouné-e pouvons né-examinné-er succné-essiTâmné-ent l a p r è c i p i t â î î o n d e i ' T E r t J l d e ribonuclfeique par l e v e r t de mfcthyle »it par l a p y r o n i n e « t e e l l e de l ' a c i d e d%8oxyribonu{^lëiqu« par
ces c o l o r a n t e . Sous envisagerons e n f i n l e comportement de ces deux a c i d e s nuclëitiues p r i s i s e l l m e n t v i s - à - v i s du mélange des> deux c o l o r a n t s * sous l a forme oû on l ' u t i l i s e en b i o l o g i e , ^ i . .
Moz e s s a i s o n t è t 6 t r è s zuHnbrexix e t l e « d é t a i l s oee
condi-t i o n s expériiaencondi-talee a v a r i é à l * i n f i n i ; a f i n de ne pas a l o i i r d i condi-t exagérément ce t r a v a i l * on nous p e r m e t t r a de n ' e x p o s e r que 1 M r é s u l t a t s l e s p l u s i m p o r t a n t s .
3) i - r é o i p i t a t i o n de l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e par l a p y r o n i n e e t par l e v e r t de methyle;
a) i^yronine; Un e s s a i p r é l i m i n a i r e nous a montré q u ' o n o b t i e n t un p r é c i p i t e l o r s q u ' o n mélange 2 ce d ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e à 0,3^' avec 2 ce de pyronine à C,6% e t s i on amène à 12 c e . Ce p r é c i p i t é augmenta s i on a c i d i f i e p r o g r e s s i v e m e n t l e mélange per a d d i t i o n ménagée de HCl j u s q u ' a u moment oû l e pH a t t e i n t l e s environs
de 3 .
Les e x p é r i e n c e s s u i v a n t e s ont cherché à p r é c i s e r l e s propor-t i o n s oppropor-tima pour o b propor-t e n i r une p r é c i p i propor-t a propor-t i o n è pH 3ï Isious avons donc opéré en p r é s e n c e d ' u n tampon à pH 3 . A 6 ce de ce tampon, on a j o u t a i t dans une s é r i e de tubes 1 , 2 ce d ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e
e t des q u a n t i t é s c r o i s s a n t e s de p y r o n i n e ( 0 , 5 k 5 c e ) . Le volume é t a i t complété à 13,2 ce e t l e s t u b e s é t a i e n t l a i s s é e s à l a g l a c i è r e pendant une n u i t ; a p r è s c e n t r i f u g a t i o n , l ' a b s o r p t i o n du l i -quide s u r n a g e a n t é t a i t mesurée au P u l f r i c h . La q u a n t i t é d'acide-r i b o n u c l é i q u e é t a i t c a l c u l é e de t e l l e s o d'acide-r t e que l e s d'acide-r e l a t i o n s mo-l é c u mo-l a i r e s e n t r e mo-l e c o mo-l o r a n t et mo-l e s mononucmo-léotides (en supposant que l ' a c i d e n u c l é i q u e e s t un t è t r a n u c l é o t i d e ) s o i e n t l e s suivan-t e s : Isuivan-t^-; 1x1; 1 : 2 ; 1 ) 3 ; l suivan-t 4 ; l i 5 . Des suivan-t u b e s à b l a n c , consuivan-tenaJisuivan-t de l ' e a u au l i e u d ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e , s e r v a i e n t de t é m o i n s . Le t a b l e a u H o . I I I schématise l e s données de l ' e x p é r i e n c e . T A B L E A U ^O. I I I . Tube l^io.: 1 2 S 4 5 ô 6 6 6 6 6 6 eo tampon pH 3. 0*5 I 2 3 4 5 ee 8ol«pyronin«. 5,6 6 4 3 2 1 ce HpO d i s t i l l é e 1»2 1 , 2 1 , 2 1 , 2 1 , 2 1 , 2 ce s o l . a c . n u c l .
Le t a b l e a u No.IY donne l e s r é s u l t a t s de l ' u n e de ces e x p é r i e n c e s . On v o i t que l a r e l a t i o n l a p l u s f a v o r a b l e e s t c e l l e oû une c u l e ce c o l o r a n t se combinerait à un mononucléotide ( s o i t 4 molé-c u l e s de molé-c o l o r a n t par molémolé-cule d ' a molé-c i d e r i b o n u molé-c l é i q u e ) .
T A B L E A U Mo. IV. Tubie j;»o. R e l a t i o n Extlnotlon âes
tubes de
oom-p a r a l B o n :
iÈStinotlon des % de pyronlne t u b e s de p r ë - r e s t é s dans o i p l t a t l o n x l a s o l u t i o n : 1 i « X 0 , 2 1 0 , 1 4 é &8 2' 1 » l 0 , 4 6 0 , 2 4 5 53,4 3 2 t 1 0 , 8 7 0 , 5 5 6 3 , 2 4 3 : 1 1,34 0 , 9 4 5 68 5 4 i 1 1 , 7 8 1 , 3 4 75,2 6 5 : 1 2,22 1,67 7 5 , 3
I^ous avons e n s u i t e voulu d é t e r m i n e r avec p l u s de p r é c i s i o n l e pH optimum pour l a p r é c i p i t a t i o n du complexe e n t r e l a pyronlne e t
l ' a c i d e r l b o n u o l é l q u e : C e t t e f o i s , nous avons maintenu c o n s t a n t e l a p r o p o r t i o n e n t r e l e s deux c o l o r a n t s » en u t i l i s a n t l a r e l a t i o n 4 mo-l é c u mo-l e s de c o mo-l o r a n t t 1 momo-lécumo-le d ' e c mo-l d e r i b o n u c mo-l é mo-l q u e qui e ' é t a i t montrée l a m e i l l e u r e dans l e s e x p é r i e n c e s p r é c é d e n t e s e t nous avons
f a i t v a r i e r l e pH. Le tabeau c i - d e s s o u s donne, à t i t r e d'exemple, l a composition des d i v e r s tubes dans l ' u n e de ces e x p é r i e n c e s .
I A B L E A U Ho, V. ï u b e J^o.Il 8 3 4 5 6 7 8 9 10 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 oc s o l . p y r o n . HClIi/5:5 4 3 2 1 0 , 5 0 , 2 5 0 l\ 0 , 2 5 0 , 5 oc liajOU-0 1 2 S 4 4 , 5 4,76 6 4 , 7 5 4 , 5 ee HgO d i s t . S 3 3 S 3 3 3 3 3 3 oc a c . n u c l . 1,55 1 , 7 3 2 2,33 2,77 3 , 1 3,4 3 , 9 5 , 8 8 pK moyen .
Après 48 h e u r e s de g l a c i è r e e t e e n t r i f u g a t l o n , nous avons mesuré au photomètre de P u l f r i c h l ' a b s o r p t i o n du l i q u i d e surnageant dans l e s d i f f é r e n t s j t u b e s e t noue avons obtenu l e s r é s u l t a t s s u i v a n t s ( v . d i a -gramme î^o.Met t a b l e a u x^o.Vl).
16 -T ii. B L £ A U 1^0 . VI. ï u b e îiio.t 1 2 3 4 6 6 7 8 9 ' i M o ^ 1 . 6 5 1 , 7 3 2,0 2 , 3 3 2,77 3 , 1 3 , 4 3 , 9 5 , 8 8 pH « ^ 2.66 2,24 1,92 1 , 4 3 1 , 1 1 1 , 2 5 1,14 1 , 4 5 2,37 1,9 i i x t i n e t i o n • y •— ^ tufces p r é c . env. 4 , 1 , 3 8 0 , 7 iiXtÉnction t u b e s coEip*
t ) Vert ce mfethyle; Les expériencee ont ètfe f a i t e s exactement de l a
mime manière que pour l a pyronine et i l nous s u f f i r a donc d ' e n don-ner l e s c o n c l u s i o n s e t une r e p r é s e n t a t i o n graphique des r é s u l t a t s .
I c i e n c o r e , c ' e s t l a r e l a t i o n 4 : 1 e n t r e l e v e r t de métiiyle et l ' a c i d e ribonuelfeique qui se montre l a p l u s f a v o r a b l e (courbe v e r t e du diagramm» l i o . S e t t e b l e a u i i o . V I I ) . Mais on remarque t o u t de s u i t e que l ' a f f i n i t é e n t r e l e v e r t de lafethyle e t l ' a c i d e r i b o n u -c l è i q u e e s t beau-coup p l u s f a i b l e que dans l e -cas de l a pyronines -ce n ' e s t q u ' u n e b i e n f a i b l e p r o p o r t i o n , n ' a t t e i g n a n t pas 15^, du colo-r a n t qui e s t entcolo-rainfe p a colo-r un minime p colo-r é c i p i t e .
T A B L E A U Ho. V I I .
Tube Ho, R e l a t i o n L x t i n c t i o n des E x t i n c t i o n des % de v e r t de c o l o r a n t ! tubes de com- t u b e s de p r é - m é t h . r e s t é s a c . n u o l . p a r a i s o n : c l p i t a t i o n : d s . l a s o l . : 1 1 1 , 0 1 0 , 9 8 97 8 1 s 1 1 , 9 3 1,66 86 3 2 i 1 3,67 3,66 9 7 , 3 4 3 : 1 6 , 6 3 5 , 5 3 9 8 , 2 L o r s q u ' o n m a i n t i e n c o n s t a n t e c e t t e p r o p o r t i o n optima de v e r t de afcthyle e t d ' a c i d e ribonuclfeique e t qu'on f a i t v a r i e r l e pH, on
obt i e n obt malheureusemenobt des r é s u l obt a obt s i n s o l i obt e s en r a i s o n de l ' i n s obt a -b i l i t é du v e r t de mêthyle à c e r t a i n s pH. iious avons a l o r s renoncé à mesurer l a q u a n t i t é de v e r t de mêthyle demeurée en s o l u t i o n en f i n
de r é a c t i o n e t nous avons e f f e c t u é , sur l e l i q u i d e surnageant après c e n t r i f u g a t i o n du p r é c i p i t é e n t r e l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e e t l e colo-r a n t , un dosage du phosphocolo-re ocolo-rganique (méthode de Becolo-renblum e t Chain) et des p e n t o s e s (méthode de B e r e n b l m et tehem) .
Mais i c i encore, nous n ' a v o n s pu o b t e n i r de réponse c l a i r e à l a q u e e t i o n s Comme l e montre l e t a b l e a u i^o.VIII, l a t e n e u r en -phosphore des t u b e s témoins e t de ceux qui c o n t e n a i e n t l e c o l o r a n t
é t a i t s e n s i b l e m e n t i d e n t i q u e . I l en é t a i t d ' a i l l e u r s de même en c e qui concerne l e s dosages de p e n t o s e .
chercher l a r a i s o n dans l e f a i t que l a tendance à l a f o r m a t i o n d ' u n p r é -c i p i t é e n t r e -c e t a -c i -c e e t l e -c o l o r a n t , è l ' i n v e r s e de -ce que nous avions eu poxir l a p y r o n i n e , e s t t e l l e m e n t f a i b l e que l e s e r r e u r s ex-p é r i m e n t a l e s deviennent extrêmement s é r i e u s e s .
T A B L E A U Ko. V I I I .
Tube de p r é c . N o . i f en |^coi Tube de comp.No.: f en f/cci pHt
1 6 , 2 1 ' 6 , 6 0 , 7 5 3 6 ; 0 3* 6 , 2 2,7 5 6 , 4 6* 6 , 8 3 , 8 e 7 , 9 6 ' 7 , 6 5,5 4) P r é c i p i t a t i o n de l ' a c i d e , désoxyribonuclfeique p a r l a p y r o n i n e e t l e v e r t de m ë t h y l e ; a) P y r o n i n e ; X<a t e c h n i q u e s u i v i e é t a i t i d e n t i q u e à c e l l e adoptée dans l e s e x p é r i e n c e s p r é c é d e n t e s , r e l a t i v e s à l ' a c i d e r i h o n u c l é i q u e , et nous nous l i m i t e r o n s donc à un exposé so^iimaire des p r i n c i p a u x r é -s u l t a t -s o b t e n u -s , i l l u -s t r é -s par quelque-s g r a p h i q u e -s .
koun avons c o n s t a t é t o u t d ' a b o r d que s i , à pH 3, on mélange
en p r o p o r t i o n s v a r i a b l e s l e s s o l u t i o n s d ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e • t de p y r o n i n e , on n ' o b t i e n t pas de p r é c i p i t é en 24 h e u r e s À l a g l a -o i è r e t l ' a c i d e d é s -o x y r i b -o n u c l é i q u e se c-omp-orte d-onc, à c e t é g a r d , t o u t à f a i t différemment de l ' a c i d e r l b o n u c l é i q u e . On note t o u t e f o i s que l a t e i n t e des t u b e s contenant l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e e s t n e t t a s e n t moins i n t e n s e au bout de 24 h e u r e s , que c e l l e des t u b e s
t€KOlns, c o n t e n a n t s e u l e a e n t l e c o l o r a n t : Comme l e montrent l e t a b -l e a u c i - d e s s o u s e t -l e diagramme iMO.^iii , on v o i t que -l a d i m i n u t i o n dans l ' i n t e n s i t é de l a c o l o r a t i o n e s t maxima l o r s q u e l a p r o p o r t i o n r e l a t i v e de l a pyronine et de l ' a c i d e d é s o x y r i b o n u c l é i q u e e s t de 4 pour 1 ( s o i t une molécule de c o l o r a n t pour un n u c l é o t i d e ) . On se rapp e l l e r a que c ' e s t l a mime rapp r o rapp o r t i o n que c e l l e que nous avions t r o u -vée l o r s de nos « s s a l s siir l e mélange p y r o n i n e - a c i d e r i b o n u c l é i q u e .
T A B L E A U m. IX.
Tube £ o . R e l a t i o n E x t i n c t i o n des E x t i n c t i o n des % de pyronine c o l o r a n t : t u b e s de com- tubes de p r é - r e s t é s dans l a a c . n u c l . t p a r a i s o n : c i p i t a t i o n : s o l u t i o n :
1 i > 1 0,30 0 , 2 0 66,7
