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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Legrand, C. (1993). Coopération d'oncogènes dans la transformation cellulaire et la sensibilisation au parvovirus MVM(p). Rôles respectifs de NS-1 et NS-2 dans la cytotoxicité (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212832/3/46fcb92e-fc3f-4144-81b6-8bcbf253642b.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
LABORATOIRE DE RADIOBIOLOGIE ET BIOPHYSIQUE
Coopération d'oncogènes dans la transformation
cellulaire et la sensibilisation au parvovirus MVM(p).
Rôles respectifs de NS-1 et NS-2 dans la cytotoxicité.
CATHERINE LEGRAND
THESE PRESENTEE EN VUE DE L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES.
AVRIL 1 993.
Titre de thèse annexe:
L’ANERGIE DES CELLULES Th POURRAIT ETRE REGULEE PAR CERTAINS
TRANSDUCTEURS DE SIGNAL.
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
LABORATOIRE DE RADIOBIOLOGIE ET BIOPHYSIQUE
Coopération d'oncogènes dans la transformation
cellulaire et la sensibilisation au parvovirus MVM(p).
Rôles respectifs de NS-1 et NS-2 dans la cytotoxicité.
CATHERINE LEGRAND
THESE PRESENTEE EN VUE DE L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES.
AVRIL 1993.
Au terme de ce travail, je pousse un soupir de soulagement . Paradoxe de la préface qui voit défiler des années si vite écoulées.. Les débuts enthousiastes mais peu fructueux ont fait place aux longues soirées acharnées sur la paillasse puis à la collecte patiente des résultats qui enfin ont permis la rédaction de cette thèse.
"Qu'importe le flacon pourvu qu'on ait l'ivresse"...Le laboratoire m'aura permis de rencontrer des gens formidables par leur attention généreuse, leur patience, leurs conseils ou leur scepticisme. En tout cas, beaucoup de personnes (sans rentrer dans un système de régulation à paramètres divers) ont contribué à l'élaboration de ce travail; je les en remercie vivement.
Tout dabord, je remercie le professeur Jean Rommelaere pour m'avoir accueillie dans son laboratoire et pour m'avoir encouragée j'usqu'au terme de cette recherche.
Ma reconnaissance va aussi à Suzanne Mousset qui m'a inculqué sa rigueur scientifique et m'a souvent prodigué ses remarques judicieuses.
Je n'oublierai pas la patience et les encouragements de Perrine Caillet (Merci la Normandie) et de Annick Brandenburger.
Grand merci également à tous ceux que j'ai croisés au laboratoire: Chen, Marcel, Bernard, Anne, Fatima, Daniel et les autres.
De même, je tiens à exprimer ma gratitude à Marie-jeanne, toujours dicrète, mais si présente et efficace.
Mes remerciements vont aussi aux amis, à ceux qui ont mis ou n'ont pas eu l'occasion de mettre la main à la page, mais qui ont beaucoup compté pour moi: Françoise, Dominique, Marcelle Fabienne, Thierry, Jacques (qui, entre nous, pourra enfin s'approcher des ordinateurs sans eau bénite).
Enfin je lance un clin d'oeil aux nocturnes bien connus des chambres froides et au lapin blanc géant qui existe à Rhode la nuit et que pourtant je n'ai pas croisé...Mais sans doute faut-il plus pour appréhender ce vivre concordant entre la montagne et l'oiseau que soupçonnait René Char...
En effaçant ce charme nostalgique du passé, je souhaite bon vent à tous.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS... 4
RESUME... 6
INTRODUCTION... 8
I. GENERALITES... 8
1. Description - classification... 8
2. Pathogénicité des parvovirus... 9
3. Interactions entre virus et cellules hôtes... 11
A. Prolifération et différenciation... 11
B. Persistance, latence et activation parvovirale. ... 12
IL PARVOVIRUS ET CANCER...13
1. Oncogènes et transformation... 13
2. Fonctions des protooncogènes... 15
A. Facteurs de croissance... 15
B. Récepteurs de facteurs de croissance... 18
C. Transducteurs du signal...20
D. Facteurs nucléaires...23
3. Gènes suppresseurs de cancer... 26
4. Oncosuppression parvovirale... 29
III. Minute Virus of Mice (MVM)... 32
1. Cycle viral de MVM(p)... 32
A. Infection restrictive...33
B. Infection abortive... 34
C. Infection cryptique... 34
2. Structure du génome de MVM(p)... 35
3. Réplication de l'ADN de MVM(p)... 36
4. Transcription... 38
5. Traduction...39
6. Fonctions des protéines non structurales...40
A. NS-1... :... 40
B. NS-2... 42
BUT DU TRAVAIL...44
RESULTATS... 45
I. ETAPES DE TRANSFORMATION ET SENSIBILITE A
MVM(p)...45
1. Obtention de lignées à différents stades de
transformation...46
2. Caractérisation de l'état de transformation... 47
A. Présence des protéines transformantes...47
B. Phénotype des cellules en culture...48
C. Croissance en fonction de la concentration en sérum du milieu... 48
E. Croissance en agar... 51
3. Corrélation entre état de transformation, sensibilité et cycle parvoviral... 52
. Rôle des protéines non structurales dans la toxicité...54
1. Constructions des plasmides et établissement de lignées inductibles... 55
2. Induction de la synthèse des protéines non stmcturales et mesure de la létalité...57
3. Toxicité des protéines non stmcturales...6l DISCUSSION... 64
I. Etapes de transformation et sensibilité à MVM(p)... 65
II. Rôle des protéines non stmcturales dans la toxicité... 68
III. Mécanisme de toxicité des protéines NS... 70
MATERIEL ET METHODES... 72
I. Cellules et plasmides...72
1. Cultures cellulaires... 72
2. Constmctions plasmidiques...72
A. Mutagenèse dirigée... 72
B. Séquençage... 73
C. Clonage... 75
3. Transfection de l'ADN exogène dans les cellules eucaryotes... 75
4. Etablissement de clones cellulaires stables ayant intégré l'ADN plasmidique dans leur génome... 76
II .Caractérisation des cellules transformées...76
1. Présence des protéines transformantes... 76
2. Fluorescence du réseau d'actine... 76
3. Clonogénicité en agar...77
III. PARAMETRES PARVOVIRAUX...77
1 .Visualisation des protéines non-stmcturales... 77
A. Immunoprécipitation ds protéines
radiomarquées... 77
B. Western blotting... 78
C. Test fonctionnel: dosage CAT...79
2. Amplification du génome parvoviral... 80
3. Toxicité parvovirale... 80
A. Efficacité de clonage...80
B. Inhibition de la croissance cellulaire...81
REFERENCES...82
4 ABREVIATIONS
aa: acide aminé
AAV: virus adéno-associé
ADN: acide déoxyribonucléique ARN: acide ribonucléique
ARNm: ARN messager
ATP: adénosine triphosphate BSA: albumine de sérum de veau cpm: coups par minute
CTP: cytosine triphosphate Dex: déxaméthasone
DO: densité optique DS: double brin DTT: dithiothréitol E.coli: Escherichia coli
EDTA: éthylènediaminetétraacétate GTP: guanosine triphosphate kb: kilo base
KDa: kilo dalton min: minute ml: millilitre mM: millimolaire
|ig: microgramme
|il: microlitre
MMTV: Mouse Mammary Tumor Virus MOI: multiplicité d'infection
MU: Map Unit
MVMp: Minute Virus of Mice (p: prototype)
nm: nanomètre nt: nucléotide pb: paire de bases S: unité de Svedberg
SDS: sodium dodécyl sulfate SS(pont): pont disulfure SS: simple brin
UTP: uridine triphosphate
6 RESUME
L'intérêt fondamental et clinique suscité par les parvovirus repose sur la subordination de leur cycle lytique à des fonctions cellulaires dont l'expression dépend de la prolifération et de la différenciation. La transformation néoplasique de diverses cellules de mammifères, notamment humaines, s'accompagne fréquemment d'une augmentation de leur sensibilité à l'attaque parvovirale. L'oncotropisme de ces virus et leur aptitude à lyser ou normaliser des cellules transformées ont été démontrés respectivement in vivo et in vitro.
Le mécanisme d'oncosuppression parvoviral n'est pas connu. On sait néanmoins que le déroulement parfois même incomplet du cycle de vie parvoviral entraîne généralement la lyse cellulaire.
De plus, il ressort de la comparaison d'une série de systèmes cellulaires dont les sensibilités aux parvovirus diffèrent, que le niveau de synthèse des protéines virales non structurales (NS) est déterminant pour la cytotoxicité.
Dans un premier temps nous avons choisi la lignée établie de fibroblastes normaux de rat, FR3T3, pour sa résistance naturelle au parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) afin d'étudier l'influence d'une transformation par des oncogènes coopérant dans la transformation sur la sensibilité des cellules au parvovirus MVM. Nous avons tiré profit du fait que in vitro la transformation cellulaire peut être effectuée graduellement par différents oncogènes se complémentant dans le processus de transformation et classés de ce fait arbitrairement en oncogènes de classe I (immortalisants et nucléaires) et oncogènes de classe II (transformants et cytoplasmiques).
Nous avons donc étudié la transformation de la lignée parentale
FR3T3 par les oncogènes nucléaires de classe I, grand T de polyoma virus
(PyLT) et y-myc, par les oncogènes cytoplasmiques de classe II, moyen T
de polyoma virus (PyMT) et c-Ha-r«5-l, ainsi que par les deux types
d'oncogènes simultanément (PyLT + PyMT ou v-myc + c-Ha-r«5-l) en
parallèle avec la sensibilisation cellulaire au parvovirus MVM. Nous
avons montré que les cellules transformées par les oncogènes de classe I,
PyLT et v-myc, gardent un phénotype normal mais acquièrent une légère
indépendance vis-à-vis du substrat de culture et poussent faiblement en
agar ; tandis que les oncogènes de classe II, PyMT et c-Ha-ra^-l, induisent des altérations morphologiques et une grande capacité de pousser en agar chez les cellules transfectées. L'expression simultanée des oncogènes des deux classes (PyLT + PyMT ou v-myc + c-Ha-m^-l) confère un phénotype supertransformé caractérisé par des empilements de cellules en foyers peu adhérents et une croissance plus rapide des clones en agar.
La transformation progressive de ce système cellulaire coïncide avec une augmentation graduelle de la sensibilité à l'infection par le parvovirus MVM(p). Nous concluons donc que des oncogènes de classes fonctionnelles différentes coopèrent dans la sensibilisation à l'infection parvovirale. De plus, cette coopération accentue la mort des cellules infectées et leur capacité de produire les protéines non structurales (NS) (Legrand et al., 1992, J. of Gen. Virol.).
Nous avons ensuite tenté d'évaluer les contributions respectives des différentes protéines NS (NS-1 et NS-2) à la lyse cellulaire. Plusieurs mutations ont été réalisées dans les gènes des protéines NS du parvovirus MVM, affectant l'une ou l'autre de ces protéines. L'unité de transcription NS de ces mutants a été placée sous contrôle du promoteur inductible de MMTV (mouse mammary tumor virus) qui répond à une stimulation par les glucocorticoïdes tels que la dexaméthasone.
Ces constructions plasmidiques ont été établies dans des cellules humaines transformées NB324K, sensibles à l'effet toxique du parvovirus MVM. La létalité des cellules exprimant les 2 protéines NS sauvages après induction par la dexaméthasone est de 90%, tandis que celle observée dans les lignées exprimant la protéine NS-1 sauvage et une protéine NS-2 tronquée dans sa partie carboxyterminale ou uniquement NS-1 atteint 79%
et 46% respectivement. D'autre part, la mort des cellules exprimant une protéine NS-2 intacte en même temps qu'une protéine NS-1 tronquée inactive est réduite à 9%. Nous concluons donc que la protéine NS-2 seule n'est pas capable de développer une cytotoxicité marquée mais qu'elle est nécessaire avec NS-1 pour obtenir une toxicité maximale dans des cellules humaines transformées. Elle agirait donc comme un cofacteur de toxicité.
De plus, nos résultats montrent que le domaine cytotoxique de NS-2
serait localisé dans la partie aminoterminale de la protéine (Legrand et al.,
1993, sous presse dans Virology.)
8 INTRODUCTION
I. GENERALITES
1. Description - classification
Depuis trois décennies la biologie des parvovirus suscite un vif intérêt chez les scientifiques, tant sur le plan fondamental que médical.
Cet intérêt réside dans la grande subordination des parvovirus au cycle de la cellule hôte et dans son association avec les cellules transformées.
Ces virus non enveloppés, d'un diamètre variant de 18 à 26 nm, ont un génome simple brin d'environ 5000 nucléotides dont les extrémités sont reployées en épingle à cheveux. Ce génome, au demeurant fort simple, code en sa partie droite pour deux à trois protéines de capside, tandis que sa partie gauche code pour des protéines non structurales aux rôles multiples (voir carte p. 35).
La faible complexité génétique de ces virus implique qu'ils dépendent de la cellule hôte pour les fonctions réplicatives et la synthèse protéique (Cotmore et Tattersall, 1987 ; Berns et Bohensky, 1987).
Trois classes de parvovirus ont pu être établies en fonction des restrictions et exigences vis-à-vis de la cellule hôte:
- Les parvovirus adéno-associés (AAV) ou dépendovirus ont généralement besoin pour accomplir leur cycle lytique d'un virus auxiliaire tel qu'un adénovirus ou un virus herpès (Siegl et al, 1985). Ils peuvent néanmoins effectuer un cycle productif, sans l'aide de tout virus auxiliaire, dans certaines lignées cellulaires et dans des conditions particulières après traitement par des agents chimiques ou des oncogènes (Bantel-Shaal et zur Hausen, 1988 ; Schlehofer et al., 1983 ; Yalkinoglu et al., 1988 ; Yakobson et al., 1987). Sans la présence de virus auxiliaire, les AAV intègrent facilement leur ADN dans le génome de la cellule hôte.
Cette insertion dépend des séquences palindromiques terminales
identiques aux deux extrémités du génome (Srivastava et al., 1983) et
résulte en une infection latente qui peut devenir productive lorsque ces facteurs auxiliaires sont amenés dans la cellule.
- Les parvovirus autonomes, tout comme les adénoassociés, sont spécifiques de vertébrés aussi divers que les rongeurs, les félidés, les bovidés, les canidés ou l'homme (voir tableau 1). Néanmoins, ils s'en distinguent par une asymétrie des palindromes terminaux (excepté pour le parvovirus humain B19 (Astell et Blundell, 1989) ). De plus, ils se répliquent indépendamment de virus auxiliaire en profitant de facteurs cellulaires exprimés durant la phase S pour effectuer leur cycle lytique.
Toutefois, dans certains cas, la réplication a pu être stimulée par coinfection avec un adénovirus (Ledinko et al., 1962).
- Les densovirus infectent des cellules d'insectes et sont autonomes. Les extrémités génomiques, comme celles des parvovirus adénoassociés, sont identiques entre elles et formées de séquences répétées inversées (Nakagi et Kawase, 1980).
2. Pathogénicité des parvovirus.
Les études épidémiologiques ont montré que les AAV ne sont associés à aucune affection connue (Georg-Fries et al., 1984). Au contraire, ils inhibent la réplication de différents virus auxiliaires (Berns et Bohenzky, 1987).
Par contre, les parvovirus autonomes ont été identifiés comme des agents provoquant des malformations congénitales lors d'infection embryonnaire (transmission "verticale" de la mère à l'embryon via la barrière placentaire).
L'infection in utero à des stades précoces de développement peut
provoquer des dommages létaux chez l'embryon. L'infection plus tardive
s'accompagne de naissances viables mais génère de graves malformations
congénitales telles que le syndrome ostéolytique, dégénérescence
musculaire, hypoplasie cérébrelleuse, encéphalopathie, hépatite et
entérite (Siegl, 1984).
Tableau 1 : LE GROUPE DES PARVOVIRUS
Acronym FuU Name Source aind Date of Original Isolation Genus Parvovirus (nondefective)
RV Kilham rat virus Rat liver sarcomas and transplantable leukemia (1959)
H-1 Hamster osteolytic virus Human HEP-1 transplantable tumor (1960)
RT RT virus Rat AT permanent ccU line (1967)
TVX Tumor virus Human permanent tumor cell line (1971)
MVM Minute virus of mice Mouse adenovirus stock (1966)
Luin Lu in virus Human Lu 106 permanent cell line (1971)
B19 B19 virus Sérum from asymptomatic blood donor (1975)
BPV Bovine parvovirus Calf fcccs (1961)
PPV Porcine parvovirus Hog choiera virus stock (1966)
FPV Fcline parvovirus
Host range variants
FPLV Fcline panleukopenia virus Léopard spleen (1965)
MEV Mink enteritis virus Mink liver and spleen (1952)
CPV Canine parvovirus Canine feces (1979)
LPV Lapine parvovirus Rabbit feces (1977
ADV Aleutian mink diseasc virus Mink tissues (1973)
GPV Goose parvovirus Goose tissues (1973)
Possible membeis
MVC Minute virus of canines Dog feces (1968)
HB HB virus Human placentas and tumors (1964)
RA-1
—Genus Dependovirus (defective)
AAV-1 Adeno-associated virus type 1 Simian virus 15 stock (rhésus motikey) (1865) AAV-2 Adeno-assodated virus type 2 Human adenovirus 12 stock (H.M. strains) (1966) AAV-3 Adeno-associated virus type 3 Human adenovirus 7 stock (H.K.and T strains) (1966) AAV4 Adeno-associated virus type 4 Simian virus 15 stock (african grcen monkey) (1967) AAV-5 Adeno-associated virus type 5 Penile fiat condylomatous lésion (1984)
BAAV Bovine adeno-associated virus Bovine adenovirus 1 stock (1970)
CAAV Canine adeno-associated virus Canine hepatitis virus stock (1969)
AAAV Avian adeno-associated virus Quail bronchitis virus stock (1967)
Possible membeis
EAAV Equine adeno-associated virus
OAAV Ovine adeno-associated virus Sheep feces (1979)
Genus Densovinis
Gaüeiia DNV
—Galleria mellonella larvae (1964)
Junonia DNV
—Junonia coenia Itmrae (1972)
Agraulis DNV
—Bombyx DNV
—Possible membeis
Aedes DNV
_______Acheta DNV
—Sibine DNV
—Diatraea DNV
________Pieris DNV
______ _Leucorrhinia DNV
—Pehplanata DNV
—Simulium DNV —
Chez l'adulte, l'infection parvovirale bien que moins pathogène,peut affecter certains tissus à prolifération rapide comme le foie en régénération, l'épithelium intestinal, la moelle osseuse, les tissus lymphoïdes et la rate (Siegl, 1984).
Le parvovirus B19 est le seul virus actuellement connu pour être pathogène chez l'homme (Anderson et Spandidos, 1988). Ce virus attaque préférentiellement les cellules précurseurs de la lignée érythroïde (Mortimer et al., 1983). Il induit deux maladies connues : l'érythroblastopénie aigüe, observée au cours des anémies hémolytiques chroniques et l'exanthème infectieux ou cinquième maladie chez l'enfant (Morinet et Tchernia, 1991).
3. Interactions entre virus et cellules hôtes.
A. Prolifération et différenciation.
Les parvovirus requièrent la prolifération de la cellule hôte pour effectuer leur cycle lytique. Cette exigence provient de leur incapacité à induire la phase S du cycle cellulaire durant laquelle certaines fonctions ou facteurs cellulaires sont exprimés et permettent notamment la conversion de l'ADN viral simple brin en une forme réplicative double brin (Cotmore et Tattersall, 1987).
La multiplication parvovirale dépend aussi de la différenciation de la cellule hôte (Rommelaere et Tattersall, 1990). Ainsi des cellules de carcinome embryonnaire de souris, résistantes au parvovirus MVM(p) (souche prototype du parvovirus minute virus of mice), peuvent devenir l'hôte du cycle parvoviral lytique après l'induction in vitro de leur différenciation en cellules fibroblastiques (Tattersall, 1972).
Ces résultats suggèrent donc que la susceptibilité des cellules aux
parvovirus dépend aussi du degré d'expression de certains gènes
auxiliaires régulé au cours du développement de la cellule hôte.
B. Persistance, latence et activation parvovirale.
L'infection parvovirale s'accompagne presque inévitablement d'une persistance sous forme latente ou infectieuse du virus dans l'individu.
Suite à une injection, des taux élevés d'anticorps antiviraux persistent à long terme (Parker et al., 1970 ; Robinson et al., 1971), suggérant une stimulation continue du système immunitaire par de petites quantités d'antigène viral.
L'infection persistante a aussi été observée in vitro, soit dans des cellules provenant de tissus infectés in vivo (Kilham et Olivier, 1959), soit dans des lignées établies de cellules contaminées accidentellement et dans lesquelles le virus reste indétectable pendant un certain nombre de divisions (Hallauer et al., 1971 ; Bonnard et al., 1976; Faisst et al, 1990).
Les parvovirus AAV restent latents en absence de virus auxiliaire et s'intégrent dans le génome cellulaire. Ils peuvent être réactivés lors de l'infection par le vims auxiliaire (Berns et Bohenzky, 1987 ; Hoggan et al., 1972 ; Laughlin et al., 1986).
Les parvovirus autonomes, quant à eux, ne peuvent intégrer leur génome dans l'ADN (vraisemblablement à cause de la dissymétrie de leur extrémités palindromiques) et sont donc incapables d'établir le même type de latence que les AAV (Richards et Armentrout,1979). Il est néanmoins possible de révéler la présence d'un virus latent par un traitement immunosuppressif tel que l'administration de doses non létales de cyclophosphamide (El Dadah et al., 1967) ou par administration de carcinogènes (Kilham et Olivier, 1959; El Dadah et al., 1967; Cotmore et Tattersall, 1986). Il y a alors réapparition d'une virémie dans des animaux qui ne semblaient pas infectés.
La persistance de l'infection parvovirale sous forme chronique ou
latente semble prévenir l'apparition de tumeurs chez l'animal. Le
mécanisme de cette surveillance n'est pas connu mais on peut suggérer
que la transformation cellulaire réactive la virémie parvovirale qui se
traduit par le cycle lytique du vims et la mort de la cellule néoplasique.
L'utilisation éventuelle des parvovirus comme thérapeutique anti
cancéreuse chez l'homme nécessite encore une meilleure connaissance des facteurs cellulaires impliqués dans la multiplication parvovirale.
Cependant, de nombreuses études ont tenté de caractériser l'association de la toxicité parvovirale avec la transformation des cellules par des oncogènes spécifiques afin d'employer ces virus comme marqueurs d'un état de transformation cellulaire.
II. PARVOVIRUS ET CANCER 1. Oncogènes et transformation
Les oncogènes sont des séquences d'ADN dont l'expression peut induire une prolifération cellulaire anormale ou cancer. Les premiers oncogènes ont été découverts par Ellerman et Bang en 1908 et par Rous en 1911, lors de l'étude de rétrovirus (virus dont le génome est constitué d'ARN) responsables de tumeurs chez le poulet.
Lors de l'infection, un rétrovirus oncogène s'intégre dans le génome cellulaire et y introduit un gène qui perturbe le contrôle de la prolifération cellulaire et de la différenciation.
Une vingtaine d'oncogènes ont pu être isolés à partir de cellules transformées par cette famille de virus (voir tableau 2).
Il fallut une quinzaine d'années après la découverte du premier oncogène pour que l'origine de ces séquences soit élucidée. En effet, une grande homologie entre ces oncogènes viraux et des séquences d'ADN de cellules normales a pu être démontrée par hybridation de leur ADN. Les mRNAs et protéines correspondant à ces oncogènes cellulaires pouvant être exprimés dans différents types cellulaires ou à des stades particuliers du développement sans induire de cancer, ils furent appelés
"protooncogènes".
Les versions "oncogènes" de ces séquences comportent
éventuellement des mutations ponctuelles ou des délétions et le contrôle
14
Tableau 2 ; ONCOGENES RETROVIRAUX
Retrovirus y-onc y~onc Virus v-onc product v-onc product
onc isolâtes ‘ origin^ protein^ disease activity^ location
src RSV Chicken pp60'"= Sarcoma PK(tyr) Inner side of
plasma membrane
rASV Quail pp60"' Sarcoma PK(tyr) Inner side of
plasma membrane
fps FuSV-ASV Chicken P130«'*-r« Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
PRCII-ASV Chicken PlOSwto Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
PRCIV-ASV Chicken PIJQPI-IP! Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
URl-ASV Chicken P150m-rpt Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
16L-ASV Chicken P142»'«’'<’* Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
fes ST-FeSV Cat P85wr«j Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
GA-FeSV Cat PllO»"’'" Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
HZl-FeSV Cat PlOOt'f'" Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
yes Y73-ASV Chicken pgQiig'y^s Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
Esh-ASV Chicken pSQipi-yp‘ Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
fgr GR-FeSV Cat pjQPl-aclut-lgr Sarcoma PK(tyr) 7
ros UR2-ASV Chicken pSgiat-m Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
abl Ab-MLV Mouse P90-P160*«''“ Pre B cell PK(tyr) Plasma membrane
leukaemia
HZ2-FeSV Cat pggï'î-'W ■ Sarcoma PK(tyr) Plasma membrane
ski Skn-rASV Chicken P110***'**^®°' Squamous ? Nucléus
PI 25 w-iW-po/ carcinoma
erbA AEV-ES4 Chicken 7 Thyroid Cytoplasm
AEV-R Chicken py^gjg-crbA hormone receptor Cytoplasm
erbB AEV-ES4 Chicken gp65'"’« Erythroblastosis Truncated Plasma membrane
AEV-R Chicken gpes"»® and EGF receptor
AEV-H Chicken gp65"*8 Sarcoma PK (tyr)
fms SM-FeSV Cat gPlSO***'''"" Sarcoma ?PK(tyr) Intermediate
gpl40®"* filaments.
• gpl20'™ M-CSF receptor membranes
kit HZ4-FeSV Cat PSOm-Kii Sarcoma ly allele Plasma
PK(tyr) membrane
sea AEV-S13 Chicken gP155"^"' Sarcoma, PK(tyr) Plasma membrane
granulocytic leukaemia, and erythroblastosis
fos FBJ-MSV Mouse pp55'®* Osteosarcoma DNA binding; Nucléus
FBR-MSV Mouse pJ^gâg-fOS-fOJr Osteosarcoma complexes with jun NK24-ASV Chicken piQQgai-lpa Nephroblastoma
mos Mo-MSV Mouse p^yettv-mos Sarcoma PK(ser, thr); Cytoplasm
Gz-MSV Mouse 7 Sarcoma oocyte
MPV-MSV Mouse p34mos Sarcoma, maturation
erythroleukaemia, factor and myélo
prolifération
Retrovirus v-onc v-onc Virus y-onc product y-onc product
onc- isolâtes '■ origin^ protein^ disease activity' location
sis SSV Monkey p^QeiiŸ-sis Sarcoma Truncated PDGF Membranes
(B Chain) ? secreted
PI-FeSV Cat P76ff!« Sarcoma
F-FeSV Cat 7 Sarcoma
TP2-FeSV Cat 7 Sarcoma
myc MC29 Chicken Sarcoma, DNA NPcIeus
MH2 Chicken carcinoma, and binding ^PlOO cytoplasmic)
P58<n^ myelocytoma
CMH Chicken Myelocytoma
OKIO Chicken Carcinoma
FeLV-myc Cat 7 Granulocytic
leukaemia
crk CTIO-ASV Chicken p47f»»-crt Sarcoma Phospholipase Cytoplasmic
C-related;
regulator of
PK(lyr) activity
maf AS42-ASV Chicken 7 Sarcoma 7 Nucléus
cbl CasNS-MSV Mouse P100«"‘‘" Pre B 7 7
leukaemia
jun S17-ASV Chicken P65"*''^ Sarcoma Complexes Nudcus,
wilh fos transcription factor?
myb AMV-BAI/A Chicken p45”'* Myeloblastosis 7 Nucléus
AMV-E26 Chicken P135w««-")* Myeloblastosis and erythroblastosis
œ! REV-T Turkey p64''' Reticulo- 7 Nucléus
endotheliosis
raf 3611-MSV Mouse gpgQtH-nl
P75w«i'
Sarcoma PK(ser, thr) ?
mil MH2 Chicken See above for myc
Ha-ras Ha-MSV Rat pp21'»* Sarcoma and GTP binding Plasma membrane
erythroleukaemia GTPase
RaSV Rat P29w«* ? Sarcoma
BALB-MSV Mouse pp21'’> Haefnangiosarcoma
K\-ras Ki-MSV Rat pp21'’* Sarcoma and GTP binding Plasma membrane
erythyroleukaemia GTPase
NY-FeSV Cat 7 Sarcoma
ets AMV-E26 Chicken See above for myb Nucléus
d'après Franks et Teich in "Cellular and molecular biology of Cancer" Oxford
Medical Publication.
de leur expression peut avoir été modifié par translocation du gène sur un autre chromosome ou par insertion d'un promoteur ou d'un enhancer viral induisant une synthèse accrue ou inappropriée de la protéine correspondante. Afin de distinguer l'origine cellulaire ou virale du gène transformant, on le fera précéder d'un "c" pour cellulaire ou d'un "v"
pour viral.
D'autres oncogènes cellulaires furent ensuite isolés directement de tumeurs non rétrovirales et n'ayant pas de correspondant viral (voir tableau 3).
2. Fonctions des protooncogènes.
Quatre groupes de protooncogènes peuvent être définis suivant leur fonction dans la cellule ;
- les facteurs de croissance
- les récepteurs de facteurs de croissance - les transducteurs de signaux
- les facteurs nucléaires
Je présenterai ici une liste non exhaustive des oncogènes et de leurs fonctions en insistant sur les oncoprotéines Ras et Myc qui ont été utilisées dans ce travail de thèse.
A. Facteurs de croissance
Les facteurs de croissance polypeptidiques sont une classe de molécules qui peuvent agir comme mitogènes sur des cellules cibles in vivo et in vitro par l'intéraction avec des récepteurs cellulaires spécifiques.
Il est évident qu'une cellule particulière peut exprimer plusieurs
types de récepteurs spécifiques de facteurs de croissance distincts. La
croissance cellulaire sera dès lors gouvernée par la quantité de facteurs
Tableau 3 :ONCOGENES NON RETROVIRAUX
Name Tumour of origin Method of
détection
hst Stomach tumour
N-myc* Neuroblastome Amplification
L-myc' Lung carcinoma neu'-* Mammary carcinoma
Nvas' Neuroblastoma^’^ Transfection
dbl B cell lymphoma
K-fgf{ = hst) Kaposi’s sarcome
mcf2 Mammary carcinoma
mcfZ Mammary carcinoma
met Chemically transformed osteosarcaoma cells
neu Neuroblastome^
or.c-D Colon carcinoma ras related Melanoma Tlym-l, -2 T cell lymphoma
trk Colon carcinoma
tx-l Mammary carcinoma
tx-2 Pre B cell leukaemia
tx-3 Plasmacytoma
f/-4 T cell lymphoma
bchl B cell leukaemia Translocation®
bch2 B cell lymphoma
ber Chronic myelocytic leukaemia tcl-1 T cell lymphoma T,NS-l Plasmacytoma®
int-l Mammary carcinoma Insertional mutation®
int-2 Mammary carcinoma (ail rodent)
Mlvi-l, -2, -3 T cell lymphoma Pim-l T cell lymphoma P'xt-2 Plasmacytoma RMO-mM T cell leukaemia
-3 Myeloid leukaemia ew-1, -2 Myeloid leukaemia Sp/'-l Erythroid leukaemia
fo-l Myeloid and lymphoid leukaemia
d'après Franks et Teich in "Cellular and molecular
biology of Cancer" Oxford Medical Publication.
de croissance en présence et par l'efficacité de la transduction du signal stimulée par le récepteur ayant fixé son ligand, donc inévitablement par la qualité des facteurs de croissance.
Les cellules synthétisant des facteurs de croissance peuvent agir sur leur propre prolifération (effet autocrine), pour autant qu'elles produisent également les récepteurs ad hoc , ou sur les cellules voisines (effet paracrine).
On connaît notamment le PDGF (plateled derived growth factor), protéine de 30 kD formée de deux sous-unités A et B (dont l'homologie de séquence est de 50%) jointes par des ponts SS. Cette protéine a un pouvoir mitogène sur les cellules issue du mésenchyne dont les cellules gliales, le muscle lisse, les plaquettes, mais aussi le placenta et est directement impliquée dans le processus de cicatrisation (Waterfield et al., 1983).
Une version oncogénique analogue au PDGF est l'oncogène sis.. Il s'agit d'une forme tronquée de la chaîne B du PDGF ; sa surexpression peut transformer les cellules et se rencontre notamment dans un ostéosarcome humain (Freind et al., 1986).
L'EGF (epidermal growth factor) est un petit peptide de 53 acides aminés. Malgré son nom il a pour cible des cellules dérivées des trois feuillets embryonnaires. On rencontre une version raccourcie de l'EGF : le TGF a (transorming growth factor a) mais ceci tant dans des cellules normales que transformées. Ces deux facteurs jouent un rôle dans l'angiogenèse : ils stimulent la croissance des vaisseaux sanguins. Ils sont également impliqués dans la résorption osseuse et le contrôle de la concentration sanguine en calcium (Waterfield M.D., 1989).
Il existe un facteur mitogène spécifique des fibroblastes le FGF
(fibroblast growth factor). On en connaît deux versions, le bFGF (à
fonction basique) et le aFGF (à fonction acide), partageant 55% de leur
séquence. Tous deux activent la prolifération de cellules issues du méso-
et neuroectoderme.
Environ 5 oncoprotéines partageant une homologie de séquence mais différant en taille sont apparentées au FGF. Trois d'entre elles, les oncogènes int-2, hst, FaF5 possèdent une séquence signal qui pourrait impliquer d'autres mécanismes de sécrétion et de liaison à leurs récepteurs.
Etant donné la régulation complexe via les interactions ligand- récepteurs, les facteurs de croissance sont rarement transformants de manière intrinsèque. Leur surexpression donne cependant clairement un avantage de prolifération aux cellules ayant subi d'autres modifications oncogéniques.
La capacité de certains facteurs de croissance à induire le développement de vaisseaux sanguins est essentielle dans la vascularisation des tumeurs et donc dans sa dissémination par les métastases (Cross et al., 1991).
B. Récepteurs de facteurs de croissance.
Les récepteurs sont des protéines transmembranaires présentant une large portion glycosylée à haute affinité pour un ligand spécifique sur la face extracellulaire, une région hydrophobe transmembranaire et un domaine fonctionnel intracellulaire capable d'activer différentes voies de transduction du signal notamment via l'autophosphorylation du récepteur.
Le nombre de récepteurs peut varier de moins de cent à plusieurs millions sur certaines cellules dérivées de tumeurs (Franks et Teich, 1991).
Il existe des oncogènes analogues aux récepteurs de facteurs de
croissance connus comme le PDGFR (récepteur pour le PDGF) ou
VEGFR (récepteur pour l'EGF) ou CSF-IR, mais ils ont subi soit des
mutations ponctuelles, soit sont tronquées dans leur site de fixation au
ligand de telle sorte qu'ils sont capables d'activer la cascade d'événements
intracellulaires contrôlant la division cellulaire indépendamment de la
fixation du ligand.
La famille de gènes er&B code pour des récepteurs analogues du récepteurs de l'EGF. erbQ en est une forme tronquée ne possédant pas le domaine de fixation de l'EGF mais ayant conservé la partie transmembranaire et le domaine catalytique protéine-kinase intracellulaire. Il fonctionne constitutivement, même en absence de ligand.
Un autre oncogène codant pour un récepteur très semblable à celui de l'EGF est l'oncogène neu. Une mutation ponctuelle dans le domaine transmembranaire suffit à activer constitutivement le domaine protéine- kinase (probablement en augmentant l'oligomérisation de la protéine) (Weiner et al., 1989).
Le récepteur pour le PDGF a un analogue oncogène \-kit qui est délété dans son domaine extracellulaire et ne fixe plus son ligand (Ullrich et Schlessinger, 1990).
L'oncogène v-fms , un analogue de CSF-IR possèdent un domaine extracellulaire intact et porte une mutation ponctuelle dans sa partie carboxy-terminale intracellulaire qui affecte vraisemblablement le niveau de l'activité kinase.
Cette activité kinase semble essentielle pour la transmission du signal mitogène et est conservée dans toutes les protéines oncogènes récepteurs membranaires de facteurs de croissance (hormis pour l'oncogène "mas"
qui est un récepteur pour l'angiotensine) (Hunter, 1991).
L'autophosphorylation de tyrosines dans la partie carboxyterminale
des récepteurs analogues de l'EGF (Fig. 1) semble déterminer
l'oligomérisation des récepteurs et leur interaction avec des substrats
cellulaires contenant des domaines SH-2 comme la phospholipase c-y
(PLC-y), les protéines activatrices de GTPases comme Ras (GAP),
phosphatidylinositol 3'-kinase. Les sites d'autophosphorylation des
récepteurs analogues du PDGF-R se situent dans une région interne de la
région kinase (voir fig. 1) (Pawson, 1992).
Fig.l. Structures des récepteurs de facteurs de croissance d'après Pawson iCurrent Opinion in Genetics and development 2, 4-12. (1992))
SH2 domains bind autophospho- rylated sites on receptors. The struc
tures of the epidermal growth fac
tor (ECR-receptor and platelet-derived growth factor (PDCR-receptor subfami- lies, and the locations of their tyrosine autophosphorylation sites are shown.
The interactions of the Src homology région 2 (SH2) domain of a signalling protein with phosphorylated sites in the carboxy-terminal tail of the EGF-recep- tor, or the kinase insert of the PDCF-re- ceptor are illustrated.
Fig.2, Intéractions des récepteurs de croissance avec leur substrat d'après Cantley et Auger iCell 64, 281-302 (1991)).
•’RECEPTOR TYPE ” PROTEIN-TYROSINE KINASE
"SRC TYPE"
PROTEIN TYROSINE KINASE
3-KINASe jSH-r-gl
PC
Recruitment oI CylosoUc Enzymes wiin SH*2 Oomains to Aciivaied Protein- Tyrosine Kinases
This model is an extension oi tne model in Fig.
ure 3. Receptor-type protem.tyrosine kinases undergo ligand-induced dimenzation, resuUing in cross-phosphorylation ol tne subunils on tyrosine residues. The multiple r/rosine-phos- pnoryiated régions of the receptors provide soecific binding sites for cytosolic enzymes containing SH>2 domains. The sequence sur- rounding the phosphocyrosine provides récog
nition of spécifie SH-2 domains. Once asso- ciaied, these proteins are subs:.*ates for the receptor protein-tyrosine kinase. Tyrosine phos
phorylation may modulate the activities of these proteins (see text). Rec-'uitment alone may aiso be important since the substrates for Ptdins 3-kinase and Pîdlns-spec:fic PLC-y are membrane lipids and the tarçet for GAP is p2l'*', which aIso résides at the plasma mem
brane (see text).
C. Transducteurs du signal
Les messagers associés à la membrane plasmique.
Dans les cellules normales l'autophosphorylation des récepteurs sur les tyrosines est induite par la fixation du ligand provoquant leur oligomérisation et leurs interactions avec les substrats cellulaires cités plus haut (voir figure 2).
La transduction du signal implique un réseau d'interactions notamment via les protéines à domaines SH2 qui peuvent se fixer sur les tyrosines phosphorylées du récepteur et sont activées par phosphorylation des tyrosines mais aussi via les protéines à domaines SH- 3 présents dans les protéines associées au cytosquelette.
La stimulation de la phospholipase c-y (voir fig. 2) induit la génération de métabolites comme l'inositol 1,4,5-triphosphate qui provoque la libération de Ca"*" des compartiments intracellulaires et de diacylglycérol qui lui active la protéine kinase C.
Les protéines kinases de la famille Src sont des tyrosines kinases fixées dans la membrane par leur extrémité aminoterminale (via la myristilation de la glycine terminale) ayant un domaine catalytique carboxyterminal et interagissant avec le récepteur de facteurs de croissance par l'intermédiaire du domaine SH-2 (Storms et Bose, 1989).
La protéine v-Src contient une substitution d'environ 10 acides
aminés et est exprimée 15 à 30 fois plus que le protoconcogène c-Src et, à
même niveau d'expression, elle est 10 à 100 fois plus active. De plus, à
l'exception de la vinculine, les protéines phosphorylées sur des tyrosines
dans les cellules transformées par v-src, ne le sont pas sur les mêmes
tyrosines dans leur équivalent normal (Coussens et Brugge, 1987). La
différence de phosphorylation au niveau des tyrosines.pourrait impliquer
une discrimination dans le choix du substrat de la version oncogène de
Src. c-Src est en effet phosphorylée en tyr 527 alors que v-src l'est en tyr
416 (Cooper et King, 1986).
21 Les oncogènes de type ras codent pour une GTPase de 21 kDa
associée à la membrane par l'extrémité carboxyterminale. Cette protéine, p21, est une protéines G: elle est capable de fixer le GDP (guanosine diphosphate) et possède une activité GTPasique.
La p21 Ras participerait à la transduction du signal venant des récepteurs membranaires et est modulée par le turnover du GTP et GDP.
La protéine Ras normale lie le GDP jusqu'à la stimulation. Lors de la stimulation, le GDP est échangé contre un GTP qui induit une modification conformationnelle et la protéine est activée. Cette forme activée interagit avec des effecteurs non encore connus, ce qui provoquerait l'hydrolyse du GTP en GDP et donc une désactivation de l'enzyme..
La régulation de cette activité se fait via la vitesse d'échange du GDP et GTP et par le contrôle de l'hydrolyse du GTP.
Les protéines GAP (GTPase activating proteins) et la protéine codée par le gène NF-1 (Neurofibromatose) sont capables de stimuler l'activité GTPasique et donc de rendre la protéine Ras inactive. Un deuxième mode d'interaction des protéines GAP est possible ; en effet, comportant deux groupes SH2, ces protéines peuvent interagir avec des protéines phosphorylées sur des tyrosines.
Il semblerait que la protéine kinase C puisse empêcher les GAP de stimuler l'activité GTPasique de Ras. Cet effet n'impliquerait pas directement la phosphorylation des GAP mais surtout son complexe avec d'autres protéines comme la pl90 et la p62 qui sont des protéines phosphorylées sur des tyrosines. Une fois complexée à la pl90 la GAP n'est plus capable de stimuler l'activité GTPasique de Ras, tandis que complexée à la p62 elle activerait même la transduction par Ras (Polakis et al., 1990). Il s'agirait donc d'une régulation double impliquant aussi des protéines kinases.
Le potentiel oncogène de ras est développé lorsque la protéine est
stabilisée dans sa forme active : - soit par des mutations abolissant les
interactions avec les GAP ou supprimant l'activité GTPasique (mutations
dans les codons 12, 13, 59, 6l) (Barbacid, 1987 ; Walter et al., 1986).
- soit en augmentant la vitesse d'échange du G DP contre le GTP (mutations dans les codons Il6, 117, 119 et 146) (Sigal et al., 1986 ; Walter et al., 1986).
On connaît mal les cibles de la protéine p21 Ras : elle semble interagir avec la protéine kinase C (Gauthier-Rouvière et al., 1990) qui va elle activer des facteurs de transcription comme Fos et Jun, mais un modèle suggère que la p21 Ras pourrait contrôler la polymérisation des récepteurs de membrane par son interaction avec les filaments d'actine (Cantley et al., 1991).
Dans les cellules normales, le complexe facteur de croissance- récepteur activerait la p21 Ras qui induirait la réorganisation des filaments d'actine ainsi que l'oligomérisation des récepteurs et éventuellement leur internalisation. Dans les cellules transformées par v-ras, la polymérisation des récepteurs serait induite en absence de facteurs de croissance à cause de l'activation constitutive de la p21. Or l'oligomérisation des récepteurs induisant un signal mitogène. Ras pourrait donc aussi agir sur la prolifération à partir des récepteurs.
Deux observations pourraient conforter ce modèle : dans les lymphocytes B, la protéine p21 Ras s'aggrège avec les immunoglobulines de surface (qui se comportent de manière analogue au récepteur du PDGF) et cette conglomération est bloquée par des inhibiteurs de la polymérisation de l'actine cytochalasine D (Graziadei et al., 1990).
De plus, dans des cellules transformées par ras, la phosphorylation accrue des tyrosines est analogue à celle mise en évidence lors de l'activation permanente par les facteurs de croissance (Cuadrado, 1990).
Les messagers du cvtosol
On connaît mal les mécanismes de transduction du signal dans le cytosol ; il semble toutefois impliquer des sérine/thréonine kinases comme la PKC citée plus haut.
Deux oncogènes codant pour des sérine/thréonine kinases du cytosol
ont été mises en évidence jusqu'à ce jour : il s'agit des oncogènes mil
(homologue chez le poulet de l'oncogène raf de la souris) et mos.
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Exon 2 Exon 3
i À i À U il
O CM in O V
_____________
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