Caractérisation du rôle de la petite GTPase Arf6 dans les fonctions du neutrophile : modèle murin cKO Arf6.

© Jouda Gamara, 2020

Caractérisation du rôle de la petite GTPase Arf6 dans

les fonctions du neutrophile: modèle murin cKO Arf6.

Thèse

Jouda Gamara

Doctorat en microbiologie-immunologie

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

II

Caractérisation du rôle de la petite GTPase Arf6 dans

les fonctions du neutrophile : modèle murin cKO Arf6.

Thèse

Jouda GAMARA

Sous la direction de :

III

Résumé

Lors d’une infection, les neutrophiles (PMNs) sont rapidement recrutés au site inflammatoire grâce à un processus finement régulé pour y exercer leurs fonctions. L’interaction du PMN avec son environnement nécessite l’intégration des signaux extérieurs captés par ses récepteurs transmembranaires faisant intervenir, entre autres, la petite GTPase ADP ribosylation factor-6 (Arf6).

Durant mes travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude du rôle d’Arf6 dans les fonctions du PMN. Les résultats obtenus suggèrent qu’Arf6 altère in vitro l’adhésion de la lignée myéloïde PLB-985 différenciée en cellules qui ressemblent à un PMN. Dans le modèle de souris knockout conditionnel d’Arf6 (cKO Arf6), qui élimine spécifiquement l’expression d’Arf6 dans les PMNs, les résultats obtenus suggèrent qu’Arf6 contrôle la migration des PMNs in vivo dans le modèle de la poche d’air (PA) en réponse au lipopolysaccharide (LPS) ou au N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). De plus, la diminution du recrutement des PMNs observée corrèle avec une réduction des niveaux d’expression des β2 intégrines à la surface des PMNs : le Lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) et le Macrophage antigen complex-1 (Mac-1).

D’autre part, les PMNs recrutés au niveau des PAs suite à une stimulation au LPS ont été utilisés pour des études ex vivo. Les résultats obtenus montrent une diminution de la phagocytose du zymosan A (opsonisé ou non), de la production des dérivés toxiques de l’oxygène (ROS) et du superoxyde (O2-), de l’apoptose et du métabolisme énergétique des

PMNs issus des souris cKO Arf6 comparés au groupe contrôle. Finalement, nous avons identifié 179 gènes dont l’expression est modulée par Arf6. Parmi ces gènes, neuf codent pour des protéines impliquées dans l’apoptose. L’expression du gène LACC1, impliqué dans le métabolisme énergétique, est le plus diminué dans les PMNs Arf6 KO. De plus, nos résultats sur la lignée THP-1 suggèrent qu’Arf6 est impliquée dans l’expression précoce de la protéine Lacc1 six heures après une stimulation avec le LPS in vitro. L’ensemble de ces résultats montre un nouveau rôle d’Arf6 dans le contrôle du métabolisme énergétique des PMNs et le contrôle de l’expression du gène de la Lacc1.

IV

Les résultats obtenus au cours de cette étude, nous laissent suggérer qu’Arf6 joue un rôle important dans les PMNs en régulant plusieurs de leurs fonctions entre autres via la modulation de l’expression des 2 intégrines et de l’expression génique.

V

Abstract

Upon infection, neutrophils (PMN) are rapidly recruited to the inflammatory site through a finely regulated process where they perform their duties. The interaction of PMNs with their environment requires the integration of different external signals received from transmembrane receptors involving, among others, the small GTPase ADP ribosylation factor-6 (Arf6).

During my thesis work, we studied the role of Arf6 in PMN functions. The results obtained suggest that Arf6 in vitro alters the adhesion of the PLB-985 myeloid cell line differentiated into PMN-like cells. In addition, we used a conditional knockout mouse model (cKO) to specifically delete Arf6 expression in PMNs. The results obtained suggest that Arf6 controls PMN migration in vivo to the air pouches (AP) in response to lipopolysaccharide (LPS) or N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). The decrease in PMN recruitment is correlated with a reduction in the expression levels of β2 integrins at the PMN surface: Function-associated lymphocyte antigen-1 (LFA-1) and Macrophage antigen complex-1 (Mac-1).

PMN recruited into the AP following LPS stimulation were used for ex vivo studies. The results obtained show a decrease in the phagocytosis of zymosan A (opsonized or not), of ROS and superoxide (O2-) production, and a decrease in apoptosis and metabolic energy of

PMN from cKO Arf6 mice compared to the control mice group. Finally, we identified 179 genes whose expression is modulated differentially by Arf6. Nine of these genes encode proteins involved in apoptosis. The Lacc-1 gene involved in energy metabolism is the one whose expression is the most impaired in PMNs Arf6 KO. In addition, our results on the THP-1 cell line suggest that Arf6 is involved in the early expression of the Lacc1 protein six hours after in vitro LPS stimulation. Taken together, these results show a new function for Arf6 in the control of energy metabolism of PMN via the control of the expression of the Lacc1 gene.

My PhD project suggests that Arf6 plays an important role in PMN by regulating several of its functions, among other by the modulation of β2 integrins and gene expression.

VI

Table des matières

Résumé ... III Abstract ... V Table des matières ... VI Liste des figures ... XI Liste des tableaux ... XIII Liste des abréviations ... XIV Remerciement ... XVII Avant-propos ... XX Introduction ... 1 1. L’immunité ... 1 2. Le polynucléaire neutrophile ... 3 Signalisation ... 7

2.1.1 Les récepteurs Toll-like ... 8

2.1.2 La stimulation du neutrophile par les peptides bactériens (fMLF) ... 10

2.1.2.1 Les récepteurs des peptides formylés ... 11

2.1.2.2 La signalisation intracellulaire induite par les FPRs ... 12

3. Les petites GTPases ... 13

Structure générale des GTPases ... 15

Activation des GTPases ... 16

Les GTPases Ras ... 18

La GTPase Ran... 19

Les GTPases Rho ... 20

Les GTPases Rab ... 21

4. Les GTPases Arfs ... 23

Généralité ... 23

Structure des Arfs ... 24

Distribution des Arfs dans la cellule ... 26

Régulation de l’activité des Arfs ... 26

4.4.1 Cycle d’activation des Arfs ... 26

4.4.2 Les Arf GAPs ... 27

4.4.3 Les Arf GEFs ... 29

Classification des Arfs ... 31

VII

4.5.2 Les Arfs ... 31

4.5.2.1 Classe 1 ... 31

4.5.2.2 Classe 2 ... 32

Classe 3 : L’Arf6 ... 32

4.6.1 La GTPase Arf6 dans les fonctions cellulaires ... 33

4.6.2 La GTPase Arf6 dans les pathologies ... 34

4.6.3 La GTPase Arf6 dans les PMNs et les cellules neutrophil-like ... 34

5. Recrutement du neutrophile au site inflammatoire... 35

Les molécules d’adhésion mises en jeu durant le recrutement du neutrophile .. 36

5.1.1 Les sélectines ... 38

5.1.2 Les intégrines ... 39

5.1.2.1 Structure des intégrines ... 41

5.1.2.2 Ligands des intégrines ... 41

5.1.2.2.1 Les ICAMs ... 42

5.1.2.2.2 Le fibrinogène ... 42

5.1.2.2.3 La fibronectine ... 43

5.1.2.3 Les β2 intégrines ... 43

5.1.2.3.1 Activation des β2 intégrines ... 44

5.1.2.3.2 Signalisation inside-out ... 47

5.1.2.3.3 La signalisation outside-in ... 48

5.1.2.3.4 L’affinité... 48

5.1.2.3.5 L’avidité ... 49

5.1.3 Déroulement du recrutement du neutrophile ... 50

5.1.3.1 L’activation de l’endothélium et la capture du PMN ... 51

5.1.3.2 Le roulement ... 52

5.1.3.3 Adhésion ferme du PMN... 52

5.1.3.4 La migration transendothéliale ... 54

5.1.3.5 La migration du neutrophile vers le site inflammatoire dans le tissu... 56

6. Les fonctions du neutrophile ... 57

Métabolisme énergétique du neutrophile ... 57

Production de radicaux libres par la NADPH oxydase ... 60

6.2.1 Les différentes sous unités de la NADPH oxydase ... 61

6.2.2 Les ROS ... 63

VIII

La phagocytose ... 64

6.3.1 Phagocytose dépendante des récepteurs FcγR ... 66

6.3.2 La phagocytose via l’activation des récepteurs du complément ... 67

L’apoptose du PMN dans l’homéostasie ... 68

7. Hypothèse et objectif de l’étude ... 70

Chapitre I: Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and recruitment. ... 72

1. Avant propos ... 72

2. Résumé ... 73

3. Abstract ... 75

4. Introduction ... 76

5. Materials and methods ... 77

Reagents ... 77

Antibodies ... 78

Isolation of human neutrophil PMNs ... 78

Apoptosis measurements ... 78

Cell culture ... 79

Cell transfection with siRNA and Arf6 vector constructs... 79

Adhesion to extracellular matrix proteins ... 79

Generation of PMN-specific conditional knockout (cKO) mice ... 80

Blood cell counting ... 80

Purification of mouse PMNs from the BM ... 80

Air pouch experiments ... 81

RT-PCR analyses ... 81

Western blotting ... 81

Analysis of 2 integrins cell surface expression ... 82

Statistical analysis ... 82

6. Results ... 82

Arf6 regulates adhesion of PLB-985 to ligands for the β2 integrins LFA-1 and Mac-1. ... 82

Inhibition of Arf6 signalling reduces cell adhesion to immobilized fibronectin. 84 LFA-1 and Mac-1 expression in BM-extracted PMNs in Arf6 cKO mouse model. 84 Recruitment of PMNs into the air pouch of Arf6 cKO mice. ... 85

IX

7. Discussion ... 86

8. Conflict of Interests ... 90

9. Data Availability Statement... 91

10. Acknowledgements ... 92 11. Supplementary materials ... 93 12. References ... 94 13. Figures ... 98 14. Supplementary table ... 107 15. Supplementary figures ... 108

Chapitre II: The small GTPase Arf6 regulates metabolic functions in neutrophil. ... 113

1. Avant propos ... 113

2. Résumé ... 114

3. Abstract ... 116

4. Introduction ... 117

5. Materials and methods ... 119

Reagents ... 119

Antibodies ... 119

Generation of PMN-specific conditional knockout (cKO) mice ... 119

Air pouch experiments ... 120

Neutrophil purification from the bone marrow (BM) ... 120

Microarray analysis ... 121

Quantitative real-time PCR ... 121

Cell culture and transfection with siRNA ... 122

Western blotting ... 122 Metabolic assays ... 123 O2- measurements ... 123 ROS production ... 123 Phagocytosis ... 124 Apoptosis ... 124 Statistical analysis ... 124 6. Results ... 125

Gene expression profiling in inflammatory PMNs-Arf6 cKO. ... 125

fMLP-induced glycolysis is decreased in Arf6 cKO PMNs ... 126

X

Phagocytosis of zymosan A is reduced in PMN from Arf6 knockdown mice. 128

Impact of Arf6 depletion on air pouch PMN apoptosis ex vivo. ... 128

7. Discussion ... 129 8. Conflict of Interests ... 132 9. Acknowledgements ... 133 10. Supplementary materials ... 134 11. Références ... 135 12. Figures ... 140 13. Supplementary figures ... 148 Discussion et conclusions ... 150 1. Discussion ... 150

1.1. Choix du modèle murine cKO Arf6 pour l’étude : Le système Elane cre ... 150

1.1.1. Mise en contexte ... 150

1.1.2. Les points à relever et les limitations techniques ... 150

1.2. Arf6 dans les fonctions du PMN ... 152

1.2.1. Mise en contexte ... 152

1.2.2. Arf6 dans la régulation des fonctions intégrines dépendantes : Adhésion, migration ... 154

1.2.3. Arf6 dans la régulation des fonctions et du fonctionnement des PMNs : le métabolisme énergétique, la phagocytose et la production des ROS et du superoxyde 158 1.2.4. La survie des PMNs et l’homéostasie... 160

Conclusions ... 162

Références ... 163

Annexe ... 190

Figures supplémentaires ... 190

XI

Liste des figures

Figure 1 : La granulocytopoïèse dans la moelle osseuse [18]. ... 4

Figure 2 : Les TLRs humains et les principales voies de signalisation impliquées [69]. ... 10

Figure 3 : Les voies de signalisation des FPRs [88] . ... 13

Figure 4 : Classification des petites GTPases humaines en familles ; Ras, Ran, Rho, Rab et Arf [105]. ... 14

Figure 5 : Structure générale des GTPases [105]. ... 16

Figure 6 : Cycle d’activation des GTPases [104]. ... 17

Figure 7 : Les différents rôles des Rabs [151]. ... 22

Figure 8: Représentation schématique des GTPases typiques Arf et Rab sur une membrane [158]. ... 24

Figure 9 : Structure cristallographique Arf6-GTPγS [166]. ... 25

Figure 10 : Cycle d'Arf6 entre les formes inactives et actives et ses modulateurs ... 27

Figure 11 : Représentation schématique des structures des Arf GAPs ... 28

Figure 12 : Représentation schématique des domaines conservés dans les Arfs GEFs [186]. ... 30

Figure 13 : La famille des intégrines [283]. ... 40

Figure 14 : Signalisation intracellulaire permettant le changement conformationnel des intégrines [63]. ... 45

Figure 15 : La signalisation inside out [268]. ... 47

Figure 16 : La signalisation outside-in [268]. ... 48

Figure 17 : Cascade du recrutement du neutrophile. ... 50

Figure 18 : Les voies du métabolisme énergétique dans la cellule [434]. ... 59

Figure 19 : Signalisation induisant l’activation de la NADPH oxydase [444]... 64

Figure 20 : La famille des Fcγ récepteurs [501]. ... 67

Figure 21 : Représentation schématique de la stratégie de production des souris KO conditionnelles pour Arf6 dans les PMNs et sommaire des différents génotypes obtenus. . 71

Figure 22 (Fig.1): Arf6 regulates fMLP-induced PLB-985 adhesion to immobilized β2 integrin ligands. ... 99

Figure 23 (Fig.2) : Arf6 regulates fMLP-induced PLB-985 adhesion to immobilized fibronectin... 100

Figure 24 (Fig3) : Characterization of PMN-Arf6 cKO mice and of bone BM-derived PMNs. ... 102

Figure 25 (Fig.4) : Cell surface exposure of CD11a and CD11b in control and stimulated BM PMNs. ... 103

Figure 26 (Fig.5) : The deletion of Arf6 reduces PMN migration into the air pouches and cell surface expression of CD11a (LFA-1) and CD11b (Mac-1). ... 105

Figure 27 (Supplementary Fig. 1) : Analyses of expression of the GFP constructs by FACS at 48h post-transfection of PLB-985 cells. ... 108

Figure 28 (Supplementary Fig. 2) : Generation of PMN-Arf6 conditional KO mice and mouse genotypes used in this study. ... 109

Figure 29 (Supplementary Fig. 3) : The N-myristoylated ARF6 inhibitory peptide induces apoptosis and a non-cytotoxic concentration of the inhibitory peptide does not inhibit fMLP-induced PMN adhesion. ... 110

XII

Figure 30 (Supplementary Fig. 4) : PMN migration into the air pouches and cell surface expression of the 2 integrins in air pouch PMNs of mice bearing one or two Cre transgenes. ... 111 Figure 31 (Fig 1.) : Establishment of PMN mRNA profiles from cKO Arf6 mice compared to controls mice groups. ... 141 Figure 32 (Fig 2.) : fMLP and zymosan-induced glycolysis is attenuated in PMN-Arf6 cKO purified from the AP but not the BM. ... 142 Figure 33 (Fig 3.) : Arf6 deletion attenuates O2-, ROS production and oxygen consumption

in PMNs. ... 145 Figure 34 (Fig 4.) : Phagocytosis of zymosan A in PMN-Arf6 cKO. ... 146 Figure 35( Fig 5.) : Arf6 regulates apoptosis. ... 147 Figure 36 (Supplementary Fig 1.): Purification of air pouch PMNs by negative selection. ... 148 Figure 37 (Supplementary Fig 2.) : Lacc-1 expression in LPS-stimulated in THP-1 cells silenced for Arf6. ... 149 Figure 38 : Rôle de la petite GTPase Arf6 dans les fonctions du PMN. ... 153 Figure 39 : (Figure supplémentaire 1) Évaluation de l’adhésion et de la production du superoxyde par les PMNs traités avec les drogues Secin B7 vs Secin H3. ... 190

XIII

Liste des tableaux

Tableau 1: Les granules et les vésicules sécrétoires du PMN mature [28]. ... 5 Tableau 2 : Les récepteurs clés du neutrophile [40]. ... 7 Tableau 3 : La super famille Ras. ... 14 Tableau 4 : Molécules d'adhésion impliquées dans les différentes étapes du recrutement des neutrophiles [13]. ... 36

XIV

Liste des abréviations

ADP. : adénosine diphosphate Ag. antigènes

Arf6. : ADP ribosylation factor-6 Arfrp1. : protéine 1 liée à l'Arf Arfs. : ADP ribosylation factors Arl. Arf-like

ATP. : Adénosine triphosphate BFA. : Brefeldin A

BRAG. : brefeldin A–resistant Arf-GEFs CGD. : Granulomatose septique chronique CLRs. : récepteurs de lectin type C

CMH. : complexe majeur d’histocompatibilité CPA. : cellules présentatrices d’antigène CTH. : cytohésine

CTH-1. : cytohésine-1

DAG. : diacylglycérol, : diacylglycérol

DAMPs. : motifs moléculaires associés aux dommages domaine E. : domaine effecteur

EFA6. : Exchange Factor for Arf6

ESAM. : Endothelial Cell-Selective Adhesion Molecule ESL-1. : ligand des sélectines E-1

FcRγ. : récepteurs d'immunoglobuline Fcγ fMLP. : peptide bactérien formyl-Met-Leu-Phe FPR. : récepteurs formyl-peptide

GAP. : protéines activatrice des GTPases

GBF1. : Golgi-specific brefeldine A–resistance factor 1 G-CSF. : Granulocyte Colony Stimulating Factor GDIs. : Guanine Dissociation Inhibitor

GDP. : Guanosine diphosphate

GEF. : facteurs d’échange nucléotidique

GlyCAM-1. : molécule d’adhésion cellulaire dépendante de la glycosylation-1 GM-CSF. : Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor

GORAB. : Ras-related in brain 6-interacting golgi GPCRs. : récepteurs couplés aux protéine G GTP. : Guanosine triphosphate

H2O2. : peroxyde d'hydrogène

HIF1α. : Hypoxia-inducible factor-1α HOCl. : acide hypochloreux

HV. : hypervariables

ICAM. : molécules d’adhésion intercellulaire Ig. : immunoglobulines

IL-17A. : interleukine-17A IL-23. : interleukine-23

XV

IP3. : inositol-1,4,5-triphosphate, : inositol-1,4,5-triphosphate

ITAM. : motif d'activation des récepteurs immuns basé sur la Tyrosine

ITIM. : motif d'inhibition des récepteurs immuns basé sur la tyrosine d'immunrécepteurs JAMs. Junctional Adhesion Molecule

LAD. : déficit de l’adhésion des leucocytes

LAD I. : déficit en adhésion leucocytaire de type I LB. : lymphocytes B

LFA-1. : Lymphocyte function-associated antigen-1 LPC. : lysophosphatidylcholine

LPS. : lipopolysaccharides LT. : lymphocytes T

MABP1. : protéine 1 liant l'actine des mammifères Mac-1. : Macrophage antigen complex-1

MAdCAM-1. : molécule-1 d’adhésion cellulaire d’adressin de muqueuse MAP kinases. : Mitogen-activated protein kinases

M-CSF. : Monocyte Colony Stimulating Factor MEC. : matrice extracellulaire

Mg2+_{. : magnésium}

MIDAS. : Metal Ion Dependent Adhesion Site MMP. : métalloprotéinases matricielles MO. : moelle osseuse

MPO. : myéloperoxydase

NADPH oxydase. : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase NET. : Neutrophil extracellular traps

NK. : Natural Killer

NLRs. : récepteurs NOD-like

NTR. : récepteurs de transport nucléaire O2. : oxygène

O2-. : anion superoxyde

OXPHOS. : la phosphorylation oxydative

PAMPs. : molécules associées à un agent pathogène PH. domaine pleckstrin homologue

PI3K. : phosphatidylinositol-3 kinase

PIP2. : 4,5-bisphosphate de phosphatidylinositol, : 4,5-bisphosphate de phosphatidylinositol

PIP3. : phosphoinositol 3 phosphate PKC. : protéine kinase C

PLA2. : phospholipase A2 PLC. : phospholipase C PLD. : phospholipase D

PMA. : Phorbol myristate acetate PMN. : neutrophiles

PRR. : Pattern recognition receptors PS. : phosphatidylsérine

PSGL-1. : ligand de la glycoprotéine des P-sélectines RabGGTase. : Rab géranylgéranyl transférase RE. : réticulum endoplasmique

XVI REP. : protéine escortée de Rab

ROS. : espèces réactives de l’oxygène S1P. : sphingosine 1-phosphate

Sar1. protéine-1 associée à la sécrétion et liée à Ras SI. : commutateurs I

SII. commutateurs II

TCR. : récepteur du lymphocyte T TGN. : réseau trans-Golgi

TLRs. : Toll-like receptors

TNF. : facteur de nécrose tumorale TRP. : répétitions tétratricopeptides

XVII

Remerciement

Mes remerciements les plus sincères s’adressent au Dr Sylvain BOURGOIN mon directeur de recherche. Merci de m’avoir donné l’opportunité́ de réaliser mon doctorat au sein de ton équipe. Je te remercie aussi de m’avoir laissé une autonomie dans mes recherches tout en m’accordant la supervision nécessaire pour mener à bien mon projet. Je voudrais également te remercier pour ta patience, ta confiance et le temps que tu as bien voulu me consacrer. Malgré un emploi du temps chargé ton bureau été toujours ouvert pour moi, même pour 5min, pour discuter et m’expliquer. Merci pour son soutien moral et financier durant toutes ces années.

Je remercie également les membres de mon jury d’avoir accepté́ d’évaluer mes travaux de doctorat :

 Dr Paul Naccache du Centre de recherche du CHU de Québec, axe des maladies infectieuses et immunitaires, département de microbiologie-infectiologie et d’immunologie de l’Université́ Laval ;

 Dr Marc Pouliot du Centre de recherche du CHU de Québec, axe des maladies infectieuses et immunitaires, département de microbiologie-infectiologie et d’immunologie de l’Université Laval ;

 Dr Jean-Pierre Lavoie du Département de Médecine Vétérinaire, DACVIM, Vice-Doyen à la recherche, Faculté de Médecine Vétérinaire de Université de Montréal;

Je voudrais remercier le Dr Emmanuelle Rollet Labelle pour sa gentillesse et toutes ses qualités humaines pour tous ses précieux conseils scientifiques je voudrais lui exprimer mon plus profond respect.

Je voudrais remercier aussi chaleureusement le Dr. Caroline Gilbert qui m’a beaucoup aidé et conseillé tout au long de mon parcours.

J’exprime également ma gratitude aux Dr Fawzi Aoudji et Dr Mohamed Amine El Azreq qui ont accepté de répondre à mes questions.

XVIII

Je veux exprimer mes remerciements et ma gratitude à Lynn Davis et Dr. Chenqi Zhao qui m’ont apporté l’aide et l’assistance nécessaire à l’élaboration de ce travail.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance envers mes trois amies Khaoula Farhate, Mabrouka Salem et Marine Lambert qui a eu la patience de relire et corriger ce travail.

Un grand merci à toutes les personnes du centre de recherche avec qui j’ai pu interagir de prés ou de loin pour l’avancement de mon projet de recherche.

Merci à Myriam Vaillancourt, et Guillaume Paré, Isabelle Allaeys, Tania Lévesque, Nathalie Cloutier, Isabelle Dubuc, Nathalie Pagé et Alexandre Brunet, pour votre serviabilité, votre aide et votre gentillesse. Travailler à vos côtés aura vraiment été un grand plaisir.

J’adresse mes remercîments à tous mes amis et collègues particulièrement à Marine Lamber, Anne-Claire Duchez, Julia Hernandez-Rapp et sa petite famille, Mabrouka Salem et sa famille, Emna Abderrazek, Audrey Hubert, Yanis Issad, Audrey Magron, ainsi que Éric Poulain, Aurélie Louit, Julien Vitry, Aurélie Corduan et sa famille, Benoit Laffont, Nadège Brondelli, Geneviève marcoux, Stephan Hasse, Jonathan et Estefania Laugier, Imène Melki, Yann Becker, Andréa Murru, Idrissa Diallo, Halima Rakhila, Irina Gymninova, Yang Zhao, Sofiane Berrazouane, Vanessa Collin, Abderrahim Benmoussa, Romuald Brice Babou, Delphine Masi, Weili Hui, Lusine Bozoyan, Flavia Ribeiro, Anne Zufferey Bakos Matthieu Rousseau et Caroline Loiseau, Caroline Subra. J’ai beaucoup aimé nos soirées nos discussions, nos sorties.

Avant de réaliser mon doctorat, j’ai eu la chance de travailler avec des gens qui m’ont transmis leur passion pour la recherche je voudrais les remercier ; Dr Ridha Barbouche, Dr Meriam Ben Ali et bien sûr toutes mes amies Khaoula, Marien, Amira, Hanene, Salma Nourhene et toutes notre équipe de l’institut Pasteur avec Chaouki, Makrem, Dafer, Fatma.

À ma famille, Yassine, Nadia, Cirioja, Oxana, Boris je tiens à vous exprimer ma profonde gratitude et mon amour. Votre tendresse, votre amour et vos encouragements m’ont aidé́ à surmonter toutes les difficultés et les embuches. Merci d’avoir toujours cru en moi. Je ne me serais jamais rendue jusqu’ici sans le soutien et l’amour de ma maman chérie. Merci pour tout maman je ne peux même pas écrire tous les sacrifices et tout ce que tu as fait pour moi. Je t’aime !

XIX

Pour ma moitié, mon mari Sofien, merci ton amour, tes encouragements et ton support. Tu es un papa formidable ! Tu m’as suivie au bout du monde et tu as passé toutes les étapes à mes côtés. Notre plus belle réussite est notre fils Rayan. Que dieu nous le garde. C’est mon rayon de soleil, quand je le vois je me dis que j’ai réussi ma vie !

Je dédie cette thèse en premier lieu à mon père paix à son âme, je l’ai fait pour toi ! Et bien sûr à mon fils Rayan, je l’ai fait grâce à toi !

XX

Avant-propos

Au démarrage de mon projet, les travaux antérieurs menés au sein du laboratoire du Dr. Bourgoin avaient mis en évidence d’une part que la cytohésine-1 (CTH-1), un facteur d’échange de nucléotide pour les petites GTPase de la famille Arf, est la plus exprimée de la famille des cytohésines dans les PMNs et dans les PLB-985 différenciées (PLB-985d). D’autre part, la CTH-1 régule la translocation d’Arf6 et d’Arf1 à la membrane et seulement l’activation d’Arf6 suite à une stimulation avec le peptide bactérien Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP). Finalement, ces études in vitro ont montré que la CTH-1 contrôle l’activation de la phospholipase D (PLD), la production de l’ion superoxyde et la dégranulation du PMN. De plus, la CTH-1 est responsable d’une régulation différentielle des β2 intégrines LFA-1 et Mac-1 contrôlant ainsi l’adhésion et la chimiotaxie du PMN et des PLB-985d.

Au regard de ces résultats, plusieurs questions se sont posées. Premièrement, est ce que les résultats obtenus concernant la régulation des intégrines du PMN sont liés à la voie de signalisation CTH-1 /Arf6? Quel est le rôle d’Arf6 dans la migration des neutrophiles in vivo? Enfin, quelles autres fonctions du PMN seront impactées à la suite de la délétion conditionnelle d’Arf6 dans les PMNs des souris?

Dans cette étude, nous apportons de précieux éléments de réponse à ces questions. Dans un premier temps, nous introduirons le PMN ainsi que ses fonctions lors d’une inflammation, puis la GTPase Arf6 et son implication dans diverses fonctions cellulaires. Ces différents aspects seront utiles à la compréhension des expériences présentées dans les chapitres deux et trois, de même que l’analyse des résultats obtenus.

Dans le premier chapitre, nous avons pu mettre en évidence le rôle d’Arf6 dans l’adhésion et la migration in vitro et in vivo des PLB985d et des PMNs, respectivement. Nous avons également mis en évidence l’importance d’Arf6 dans l’expression des β2 intégrines à la surface des PMNs. Et enfin, nous avons caractérisé les PMNs de souris cKO Arf6.

Le chapitre II met en lumière l’implication de la GTPase Arf6 dans les fonctions du PMN dont la production du superoxyde et des ROS, la phagocytose ainsi que dans l’apoptose ex vivo, et l’expression génique. Finalement, nos résultats suggèrent un mécanisme d’action

XXI

par lequel Arf6 contrôle le métabolisme énergétique de la cellule et régule l’expression du gène de la Lacc1.

Les résultats présentés dans le 1er chapitre ont été publiés dans le journal « Mediators of Inflammation » le 7 avril 2020. L’article est présentement en cours de révision. Les résultats présentés dans le 2ème chapitre seront soumis en janvier 2020. Ces résultats ont été obtenus grâce à la collaboration de tous les auteurs cités, dont le rôle est précisé ci-dessous.

Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil like cells and in mouse neutrophils using Elanetm1 (Cre) mice: impact on adhesion and recruitment. Jouda gamara :

- Conception et planification des expériences.

- Réalisation des expériences et analyse des données. - Conception des figures.

- Rédaction du manuscrit.

Lynn Davis, Emmanuelle Rollet-Labelle :

- Conception, planification et réalisation des expériences. Tsunaki Hongu, Hiroshi Hasegawa et Yasunori Kanaho : - Mise à disposition des animaux.

Fawzi Aoudji : - Expertise et conseils. - Révision du manuscrit. Sylvain Bourgoin :

- Supervision globale et coordination du projet. - Participation aux analyses des résultats.

- Rédaction, révision et soumission du manuscrit.

The small GTPase Arf6 regulates metabolic functions in neutrophils Jouda gamara :

- Conception et planification des expériences.

- Réalisation des expériences et analyse des données. - Conception des figures.

- Rédaction du manuscrit.

XXII - Réalisation des expériences.

Tsunaki Hongu, Hiroshi Hasegawa et Yasunori Kanaho : - Mise à disposition des animaux Arf6flox.

Fawzi Aoudji et Martin Pelletier : - Expertise et conseils.

- Révision du manuscrit. Sylvain Bourgoin :

- Supervision globale et coordination du projet. - Participation aux analyses des résultats.

- Rédaction, révision et soumission du manuscrit.

Durant mon doctorat, nous avons également publié en décembre 2015 une revue de littérature intitulée « Regulators and Effectors of Arf GTPases in Neutrophils » dans « Journal of Immunology Research » que vous trouverez ci-joint en annexe de cette thèse.

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Introduction

Les travaux de recherche de cette thèse portent sur l’implication de la petite GTPase Arf6 sur les diverses fonctions du neutrophile. Nous évoquerons dans cette introduction, toutes les informations qui vous seront nécessaires pour comprendre notre hypothèse et nos objectifs de recherche. Dans cette optique, ce chapitre est constitué de trois sections principales : La première partie sera un bref rappel sur l’immunité et les neutrophiles pendant l’homéostasie et dans le contexte inflammatoire. Ensuite, dans la deuxième partie nous introduirons les petites GTPases qui sont impliquées dans la signalisation cellulaire en mettant l’emphase sur la famille des factors d’ADP ribosylation (Arfs), en particulier la petite GTPase Arf6. Enfin, la dernière partie portera sur les diverses fonctions du neutrophile et le rôle des petites GTPases dans les différentes voies de signalisation menant à ces fonctions.

1. L’immunité

L’immunité est un système de défense mis en place au cours de l’évolution qui permet à un organisme de reconnaître « le soi » du « non soi » pour lutter contre tout organisme étranger tel que les agents pathogènes infectieux. Conventionnellement, la réponse du système immunitaire est subdivisée en deux parties distinctes l’immunité innée et l’immunité acquise.

Par définition, l’immunité innée représente la première ligne de défense contre les pathogènes. C’est un système qui est non spécifique à un pathogène en particulier. Elle se met en place rapidement et fait intervenir essentiellement les cellules phagocytaires telles que les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs), les macrophages, les cellules Natural Killer (NK) et certains médiateurs solubles tels que les protéines du complément. Les premières cellules recrutées au site inflammatoire sont les PMNs, quelques heures après le début de l’infection. Les monocytes prennent le relais dans les heures qui suivent et commencent à s’accumuler et se différencier rapidement en macrophages. Les autres cellules de l’immunité innée arrivent plus tard. Il s’agit entre autres des cellules dendritiques, des éosinophiles et des cellules NK. La réponse innée est considérée plus ancestrale sur une échelle évolutive, du fait qu’elle soit présente chez tous les organismes pluricellulaires, alors que la réponse acquise n’existe que chez les vertébrés [1-3].

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L’immunité adaptative, très complexe, est caractérisée par l’intervention des lymphocytes B (LB) et lymphocytes T (LT) qui la subdivise ainsi en immunité humorale et cellulaire respectivement. La spécificité aux antigènes d’un agent infectieux et la mémoire immunitaire sont par ailleurs des caractéristiques essentielles de cette immunité. Au cours de l’inflammation, la réponse innée est un préalable au déclenchement de la réponse immunitaire acquise qui survient plus tard. En effet, cette réponse nécessite l’intervention des cellules présentatrices d’antigène (CPA), principalement les cellules dendritiques. D’abord les CPA phagocytent le pathogène au niveau des sites d’infections puis migrent vers les organes lymphoïdes et les ganglions. Les antigènes (Ag) spécifiques au pathogène seront alors présentés aux LB et aux LT immatures. L’immunité humorale se met en place grâce aux LB qui deviennent matures et entrent en phase d’expansion clonale puis se différencient en plasmocytes. Ces cellules vont produire et secréter des anticorps spécifiques grâce à la commutation isotopique et à l’hypermutation somatique des immunoglobulines (Ig) afin d’augmenter leurs affinités pour l’Ag pathogénique [3]. D’autre part, l’immunité cellulaire est assurée par des LT naïfs qui au contact des CPA déclenchent le processus de sélection clonale. Ce dernier débute lorsqu’une forte liaison s’établit entre le récepteur du lymphocyte T (TCR) qui reconnaît spécifiquement le complexe peptide-complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Ces LT se différencient et se polarisent en LT effecteur, cytotoxique, régulateur ou encore mémoire spécifique aux agents pathogéniques. Il est important de noter que lors d’une seconde infection par le même pathogène, la réponse adaptative est beaucoup plus rapide grâce à la mémoire immunologique. Les LB et LT dits « mémoires » produits lors de l’expansion clonale seront réactivés ce qui réduira nettement le temps de réponse. Cependant, cette réponse spécifique reste décalée dans le temps par rapport à la réponse innée qui doit contrôler le pathogène durant cette période [3].

La subdivision entre l’immunité innée et adaptative s’estompe de plus en plus grâce à des études qui suggèrent que les PMNs peuvent exprimer le CMH II et les molécules de costimulation CD80 et CD86 dont le rôle est d’interagir avec des récepteurs TCR fonctionnels. Ainsi, les PMNs vont jouer le rôle d’une CPA et induire la prolifération des LT [4-8].

Le bon fonctionnement du système immunitaire et le retour à l’homéostasie, via la résorption de l’inflammation, sont primordiaux. Le cas échéant, si le système immunitaire

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n’est pas fonctionnel, les patients sont dits immunodéficients. C’est le cas des personnes qui souffrent du déficit de l’adhésion des leucocytes (LAD) entrainant une accumulation des PMNs dans le sang causée par une incapacité de migration au site inflammatoire. Un autre exemple d’immunodéficience est celui, des patients atteints d’Agammaglobulinémie, qui est un trouble dans la maturation des LB. Ces patients n’ont quasiment pas de LB dans la circulation et donc pas de réponse immunitaire humorale. Ils sont sujets à des infections récurrentes qui finissent par causer la mort. Dans la situation inverse où l’inflammation n’est pas contrôlée et devient chronique, ces maladies sont dites inflammatoires telles que l’arthrite rhumatoïde ou encore le lupus [9, 10]. Ainsi le système immunitaire est très complexe et son bon fonctionnement nécessite une fine régulation.

2. Le polynucléaire neutrophile

Les PMNs ont été décrits pour la première fois au début du XXe siècle par le docteur Paul Ehrlich [11]. En effet, grâce à ses recherches sur la coloration des tissus, il a réussi à différencier trois catégories de leucocytes suivant le pH du colorant fixé par les granules de ces derniers. Ces leucocytes ont été nommés selon la coloration des cellules : basophiles, neutrophiles et acidophiles. Dû à ses nombreux granules cytoplasmiques et à son noyau multilobé, le PMN est souvent décrit comme un granulocyte polynucléaire [12]. Les PMNs sont considérés comme des cellules différenciées de manière terminale. Même si le débat reste ouvert, plusieurs études corroborent l'existence de sous-ensembles distincts de PMNs jouant différents rôles dans l'inflammation et dans le cancer [13-17].

Ces polynucléaires prennent naissance au niveau de la moelle osseuse (MO) grâce à un processus appelé la granulopoïèse [18, 19]. Les cellules souches hématopoïétiques multipotentes doivent d’abord se différencier en progéniteur myéloïde commun puis en progéniteur granulocytaire /monocytaire commun. A ce stade, la différenciation en granulocytes ou en monocytes sera induite par le Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) et le Monocyte Colony Stimulating Factor (M-(G-CSF), respectivement [18, 19]. Les progéniteurs subiront la monopoïèse ou la granulopoïèse dépendamment de la concentration faible ou forte du Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor (GM-CSF), respectivement. Les macrophages résidant dans les tissus et les cellules dendritiques vont secréter l’interleukine-23 (IL-23) qui, à son tour, induit la libération de l'interleukine-17A

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(IL-17A) par les LT. Suite à la libération de l’IL-17A, le G-CSF sera produit induisant ainsi une différenciation granulocytaire [20].

Les précurseurs des PMNs passeront par plusieurs stades de maturation, à savoir les myéloblastes puis les promyélocytes et en fin les myélocytes (Figure 1) [18]. A cette étape, il n’y a plus de prolifération mais les cellules continuent leur maturation pour devenir des métamyelocytes, des PMNs immatures et enfin des PMNs matures [18]. Toutes ces étapes de la granulopoïèse sont régulées par plusieurs facteurs de transcription, principalement le PU.1 et la CCAAT / protéine activatrice de liaison (C/EBP) α–ζ [21, 22].

Une fois matures, 1 à 2% des PMNs totaux se retrouvent dans la circulation alors que la majorité (plus de 90%) restera nichée au niveau de la MO [23, 24]. Plusieurs études suggèrent que la signalisation via la chimiokine CXCL12 (SDF-1) et son récepteur CXCR4 joue un rôle crucial quant à la rétention des PMNs dans la MO, alors que la signalisation par le récepteur CXCR2 permettrait la sortie de la MO [12, 18, 19, 25]. Une autre fraction des PMNs quitte la MO pour se retrouver au niveau de la rate, du foie et des poumons. Cette distribution est orchestrée par les cellules dendritiques [26].

Figure 1 : La granulocytopoïèse dans la moelle osseuse [18].

Les PMNs matures possèdent trois types de granules et des vésicules sécrétoires qui contiennent plusieurs types de protéines dont des protéines pro-inflammatoires (Tableau 1). Ces granules se forment séquentiellement à partir du stade promyélocyte [18, 27]. On retrouve les granules primaires (ou azurophiles) contenant de la myéloperoxydase (MPO) ou

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encore des protéases comme l’élastase. Les granules secondaires (ou spécifiques) contiennent de la lactoferrine entre autres. Les granules tertiaires (ou de gélatinase) contiennent, entre autres, de la métalloprotéinase matricielle 9 (ou gélatinase B) [13, 27]. Mise à part les granules, les PMNs possèdent également dans leur cytoplasme des vésicules sécrétoires qui peuvent transporter rapidement leurs contenus à la surface de la cellule. Par exemple, lors de l'activation des PMNs, les vésicules transportant la β2 intégrine Macrophage antigen complex-1 (Mac-1) nécessaires à l'adhésion lors de la migration vers le site inflammatoire sont incorporées et exprimées à la surface de la membrane cytoplasmique des PMNs [27].

Tableau 1: Les granules et les vésicules sécrétoires du PMN mature [28].

Azurophiles Spécifiques Gélatinase Sécrétoires Protéines cytosoliques Elastase Proteinase 3 Cathepsin G Cathepsin D Defensins Lysozyme Myeloperoxidase Bacterial permeability increasing protein (BPI) Azuricidin 1-antirypsin glucoronidase Phospholipase A2 Collagenase Gelatinase hCAP-18 Histaminase Heparinase Lactoferrine Lyoszyme NGAL 2 microglobulin NADPH Oxidase Lysozyme 2 microglobulin Protéines plasmatiques Protéines membranaires CD63 CD68 Presenilin 1 V-type H+-ATPase Mac-1 (CD11b/CD18) Cytochrome b558 fMLP-R

sous unitéα des

protéines G Leukolysin VAMP-2 Mac-1 (CD11b/CD18) Cytochrome b558 VAMP-2 V-type H+-ATPase Alkaline phosphatase Mac-1 (CD11b/CD18) CD16 CD10 CD13 CD14 (complexe TLR) CD45 CD35 (CR1)

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fMLP-R C1q-R

Cytochrome b558

Les PMNs ont depuis longtemps été considérés comme des cellules à vie courte. Des études plus récentes ont montré que dans la circulation, les PMNs murins pouvaient survivre plus de 12,5 heures et 5,4 jours pour les PMNs humains [13, 29]. Lors d’une inflammation, les PMNs s'activent et leur longévité augmente encore plus sous l’influence de diverses cytokines et facteurs de croissance. Ce contexte permet aux PMNs d’élargir leurs champs d’action en contribuant à la résolution de l'inflammation ou à la formation de la réponse immunitaire adaptative. La production des PMNs est estimée chez l'homme à environ 1011 PMNs par jour et encore plus dans le cas d’une inflammation [18].

Les PMNs sont des éléments essentiels de la réponse immunitaire innée, chez la souris ils représentent 10 à 25% des leucocytes en circulation. Par ailleurs chez l’homme, le PMN est le leucocyte le plus abondant dans la circulation sanguine. Il représente plus de 50% des leucocytes circulants [30, 31]. Ce sont les premiers leucocytes à être recrutés au site inflammatoire. Leur principale fonction est de détruire les agents pathogènes de manière non spécifique.

En milieu inflammatoire, les PMNs peuvent reconnaitre des motifs conservés chez les pathogènes dits molécules associées à un agent pathogène (PAMPs) et des motifs moléculaires associés aux dommages (DAMPs). Cette reconnaissance est possible grâce à une

famille de récepteurs, exprimés à la surface des cellules de l’immunité innée mais aussi au niveau d’autres types de cellules, appelés Pattern recognition receptors (PRR). Les Toll-like receptors (TLRs) sont les PRRs les mieux étudiés. Hormis les TLRs, cette famille inclut entre autres, les récepteurs formyl-peptide (FPR), les récepteurs de lectin type C (CLRs) ou encore au niveau cytoplasmique les récepteurs NOD-like (NLRs) [32-34]. Cette reconnaissance va entrainer l’activation et l’enclenchement de multiples mécanismes de défense tels que la dégranulation, la libération de dérivés toxiques de l’oxygène, la phagocytose ou encore la capacité d'emprisonner les bactéries dans des pièges extracellulaires de neutrophiles dit Neutrophil extracellular traps (NET) [35]. Le PMN est capable de produire et libérer des médiateurs chimiques qui contribuent à l'amplification de la réaction inflammatoire en recrutant d’autres types cellulaires au site inflammatoire [36]. Une fois le pathogène éliminé,

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la résolution de l’inflammation et le retour à l’homéostasie sont très importants. En effet, les PMNs vont subir une apoptose spontanée, c’est une mort cellulaire programmée, afin de diminuer le nombre de cellules au site inflammatoire et de maintenir un nombre basal de PMNs dans l’organisme [37, 38].

Signalisation

Grâce à ses travaux, l’immunologiste Paul Ehrlich a introduit la notion de "récepteur membranaire spécifique" ce qui lui permit de recevoir le prix Nobel de médecine en 1908 [39].

Pour interagir avec son milieu environnent, le PMN tout au long de sa vie intègre les différents signaux extracellulaires grâce à ses divers récepteurs membranaires et intracellulaires (Tableau 2). Au niveau du site inflammatoire, l’intégration de ces signaux permet aux PMNs de s’activer et d’effectuer leurs fonctions. Par exemple, les PMNs peuvent moduler les niveaux d’expression de certains gènes et ainsi changer leur profil en ARN messager.

En effet, ces récepteurs induisent une signalisation intracellulaire faisant intervenir entre autres les petites GTPases. Ces petites molécules de signalisation peuvent intervenir dans diverses voies d’activation et à des niveaux cellulaires différents. Comprendre les voies de signalisation impliquées suite à l’activation de ces récepteurs est primordial.

Tableau 2 : Les récepteurs clés du neutrophile [40]. Les récepteurs couplés aux protéines G Les récepteurs Fc Les récepteurs de l’adhésion Les récepteurs des cytokines Les récepteurs de l’immunité innée Récepteurs des peptides formylés • FPR1 (FPR) • FPR2 (FPRL1) • FPR3 (FPRL2) Récepteurs des chimioattractants classique • BLT1 (LTB4-rec.) Récepteurs Fcγ • FcγRI • FcγRIIA (humain) • FcγRIIB (inhibiteur) • FcγRIII (souris) • FcγRIIIB (humain) Sélectines et leurs ligands • L-sélectine • PSGL-1 Intégrines • LFA-1 (αLβ2) • Mac-1 (αMβ2) • VLA-4 (α4β1) Récepteurs des cytokines de type I • IL-4R • IL-6R • IL-12R • IL-15R • G-CSFR • GM-CSFR Récepteurs Toll-like • TLR1 • TLR2 • TLR4 • TLR5 • TLR6 • TLR7 (?) • TLR8 • TLR9 Lectins type-C

8 • BLT2 (LTB4-rec.) • PAFR • C5aR Récepteurs des chemokine • CXCR1 (humain) • CXCR2 • CCR1 • CCR2 • FcγRIV (souris) Récepteurs Fcα • FcαRI (humain) Récepteurs Fcε • FcεRI • FcεRII Récepteurs des cytokines de type II • IFNAR (IFNα/β-rec.) • IFNGR • IL-10R Famille de l’IL-1R • IL-1RI • IL1RII • IL-18R Familles des TNFR • TNFR1 (p55) • TNFR2 (p75) • Fas • LTβR • RANK • TRAIL-R2 • TRAIL-R3 • Dectin-1 • Mincle • MDL-1 • Mcl • CLEC-2 Récepteurs NOD-like • NOD2 • NLRP3 Récepteurs RIG-like • RIG-I • MDA5

Dans les expérimentations de cette thèse, les PMNs ont été stimulés avec un peptide N- formylés le fMLP et avec le lipopolysaccharides (LPS). Dans les paragraphes ci-dessous, je vais au préalable vous décrire brièvement les TLRs qui sont des récepteurs très importants dans l’immunité innée et qui sont impliqués dans mes travaux de recherche lors du recrutement des PMNs dans le modèle in vivo de la PA chez les souris. Par la suite, je vous détaillerai les FPRs et la signalisation qui s’y rattache.

2.1.1 Les récepteurs Toll-like

Les récepteurs Toll ont d’abord été décrits chez la drosophile pour leur rôle dans le développement embryonnaire. Cette découverte a valu le prix Nobel en 1995 au Dr. Nussein-Volhard. Chez la drosophile, ces récepteurs ont un rôle protecteur contre les infections fongiques (prix Nobel en 2011 du Dr. Hoffmann). Par ailleurs, des récepteurs homologues aux récepteurs Toll (TLR : Toll-like receptors) sont présents chez les vertébrés [32, 41, 42].

Les TLRs sont des récepteurs qui jouent un rôle important dans la défense de l'hôte contre les agents pathogènes. Ils reconnaissent une grande variété de PAMPs (décrit dans la section le polynucléaire neutrophile) [43, 44]. Les TLRs sont des protéines

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transmembranaires caractérisées par des répétitions riches en leucine (LRR) N-terminal qui facilitent la reconnaissance des PAMPs; une région transmembranaire; et un domaine d'homologie cytoplasmique Toll / IL-1R (TIR) intracellulaire nécessaire à la transduction du signal en aval [45].

Dix TLRs fonctionnels ont été identifiés chez l'homme et douze chez la souris, les TLR1 – TLR9 étant conservés chez les deux espèces. Le TLR10 de souris n'est pas fonctionnel et les gènes TLR11, TLR12 et TLR13 n’existent pas dans le génome humain [45]. Ces récepteurs peuvent être exprimés à la membrane cytoplasmique (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 et TLR6) ou au niveau de la membrane endosomale (TLR3, TLR4, TLR7 et TLR9) (Figure 2). Les TLRs sont exprimés sur diverses cellules immunitaires, notamment les PMNs et d’autres types de cellules [46]. Les PMNs humains n’expriment pas le TLR3 [47-49].

Chaque TLR reconnait spécifiquement une certaine catégorie de PAMP. En effet, ces PAMPs comprennent les protéines, les lipides, les lipoprotéines et les acides nucléiques dérivés de microbes tels que les bactéries, les virus ou encore les parasites [45, 50]. Chez les PMNs, l’association et l’activation des TLRs par les PAMPs déclenchent diverses fonctions de défense comme l’augmentation de la capacité phagocytaire [48]. De plus, la réponse du PMN est dépendante et distincte en fonction du TLR stimulé [45, 50-53]. Par exemple, dans le PMN, la stimulation du TLR2 induit le relâchement de l’IL-8 alors que celle du TLR4 induit la génération de superoxyde [54-56]. En effet, le TLR4 est considéré comme le principal récepteur des LPS [51, 57, 58]. Le LPS est un composant de la membrane externe de la bactérie Gram- [34]. Le TLR4 reconnaît le LPS avec le facteur de différenciation myéloïde 2 (MD2) à la surface des cellules pour former un hétérodimère [59]. D’autre part, le TLR2 est considéré comme le principal récepteur lors de la réponse cellulaire aux composants des bactéries Gram+ [60]. Parmi les agonistes du TLR2, on retrouve les lipopeptides bactériens et le zymosan. La signalisation sera induite via les hétérodimères de TLR2 (TLR2 en association avec TLR1 ou TLR6) [51, 61, 62].

Suite à l’activation des TLRs, la transduction du signal est généralement dû au recrutement de l'adaptateur MyD88. Ce dernier recrute des kinases de la famille IRAK (principalement IRAK4), ce qui conduit à l’activation de diverses voies de signalisation dont la voie NF-κB et celle du p38 entraînant une régulation transcriptionnelle de la production de cytokines et d'autres processus pro-inflammatoires [63-65]. D’autres acteurs

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supplémentaires tels que les PI3-kinases ou diverses MAP kinases transmettent les signaux des TLRs dans les PMNs [63, 66-68].

Figure 2 : Les TLRs humains et les principales voies de signalisation impliquées [69].

2.1.2 La stimulation du neutrophile par les peptides bactériens (fMLF)

Dans le PMN, parmi les voies de signalisation les plus étudiées, on retrouve celles déclenchées par l’activation des récepteurs spécifiques aux peptides N-formylés (FPRs).

11 2.1.2.1 Les récepteurs des peptides formylés

Les N-formyl peptide receptor (FPRs) sont considérés comme des récepteurs de l’immunité innée impliqués dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes [70]. Les FPRs appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques (G protein coupled receptor : GPCR). Ces récepteurs ne peuvent pas transduire le signal par eux même et ont besoin des protéines G qui jouent un rôle de protéines effectrices intermédiaires [71, 72]. Ils sont exprimés à la membrane plasmique et sont également stockés dans les vésicules sécrétoires afin d’être rapidement mobilisés à la surface cytoplasmique suite à l’activation cellulaire [73, 74]. Bien conservés chez les mammifères, les FPRs sont principalement exprimés sur les cellules myéloïdes dont les monocytes et les PMNs [75]. Chez l’humain, il existe trois récepteurs FPRs ; le FPR1, le FPR2 et le FPR3 [70, 76-78]. Le FPR1 est également exprimé dans les cellules dendritiques immatures, les astrocytes, la microglie et les hépatocytes. Le FPR2 est aussi exprimé dans les cellules endothéliales microvasculaires, les cellules épithéliales, les cellules d'astrocytome, les hépatocytes et les cellules de neuroblastome [75]. Le FPR3 n’est pas exprimé dans les PMNs humains [79]. Les récepteurs FPR1 et FPR2 sont très étudiés pour leurs rôles dans les réactions inflammatoires [80]. Ces deux derniers présentent une grande similarité de séquence d'acides aminés (69% chez l’humain), surtout dans les parties cytosoliques suggérant une signalisation intracellulaire semblable. À la surface des PMNs, le FPR1 est le premier récepteur qui a été identifié et caractérisé [81-83]. Ce récepteur reconnaît généralement les peptides courts commençant par la N-formylméthionine qui sont des produits de clivage de la partie N-terminale des protéines constituant la paroi bactériennes et mitochondriales [84, 85]. En effet, les trois premiers acides aminés du peptide formylé débutent par une méthionine (M) formylée (sur une de ses molécules d'azote), d'une leucine (L) et d'une phénylalanine (F), d’où l'appellation fMLP ou fMLF dans la littérature [86]. Le peptide fMLP dérivé d’Escherichia coli est un des ligands les plus puissants pour le FPR1 humain [70]. Par ailleurs, les récepteurs FPR2 sont activés par des peptides plus longs dotés de propriétés amphipathiques -hélicoïdales [87, 88]. Dans les PMNs, les récepteurs FPRs, entre autres, sont impliqués dans le recrutement des cellules de la moelle osseuse au flux sanguin et du flux sanguin aux sites inflammatoires [70, 73, 89].

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2.1.2.2 La signalisation intracellulaire induite par les FPRs

Dans ce paragraphe, nous allons décrire les voies signalétiques principales activées par le fMLP dans les PMNs. Ces voies signalétiques sont hautement complexes. Une représentation schématique est présentée à la Figure 3.

L'activation des FPRs par leurs ligands dans les cellules myéloïdes entraîne l’activation et la dissociation des protéines G hétérotrimériques couplées aux FPRs. En effet ces protéines G sont composées de trois sous-unités α, β et γ [80]. Suite à l’activation, la sous unité α qui possède l’activité GTPase se dissocie du dimère βγ [80, 88, 90]. D’une part, ce dimère active la phospholipase Cβ2 (PLCβ2) qui à son tour hydrolyse le 4,5-bisphosphate de phosphatidylinositol (PIP2) en diacylglycérol (DAG) et en inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) conduisant à la libération de calcium des réserves intracellulaires. Cette augmentation du calcium intracellulaire induit entre autres l'activation des protéines kinases C (PKC) (Figure 3). D’autre part, le dimère βγ active aussi la phosphoinositide-3-kinase  (PI3K) qui convertit le PIP2 en 3,4,5-triphosphate phosphatidylinositol (PIP3) au niveau de la membrane ce qui entraîne une cascade de signalisation menant aussi à l'activation des PKC et de la protéine kinase B (Akt) [80]. Cette voie est nécessaire à la dégranulation et à la production de superoxyde [80, 91].

La sous-unité  de la protéine G couplée au FPR, quant à elle, va activer des petites GTPases monomériques de la superfamille Ras (petites protéines G) via l’activation de leurs facteurs d’échange nucléotidique (GEFs). L’engagement de ces petites GTPases conduit à l'activation des voies de la protéine kinase ERK 1/2, p38 et la protéine kinase JNK [88, 92]. Dans le PMN, en réponse au fMLP, l’activation de la petite protéine G Arf6 stimule aussi la voie de la PLD qui joue un rôle important dans plusieurs fonctions [93, 94].

Suite à l’activation des voies de signalisation précédemment décrites, diverses réponses cellulaires antimicrobiennes sont induites. En effet, l’activation de ces voies conduit à une réorganisation du cytosquelette qui est un processus préalable à plusieurs fonctions telles que la dégranulation, la chimiotaxie et la migration des cellules activées vers les sites d'infection [80, 88, 95]. En outre, cette activation entraine la formation du complexe NADPH oxydase et la production de divers ROS. De plus, ces voies entraînent une dégranulation,

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ainsi que la régulation de la transcription et de l'expression de chimiokines, telles que l'IL-8 (Figure 3) [80, 88, 96-98].

Figure 3 : Les voies de signalisation des FPRs [88] .

Il est important de mentionner que suite à une première réponse au fMLP, les FPRs à la surface des PMNs sont inactivés, comme la majorité́ des RCPGs, par une désensibilisation homologue. Suite à la stimulation prolongée des FPRs, le nombre de ces récepteurs à la surface cellulaire est alors diminué suite à leur internalisation. Ce processus d’endocytose fait intervenir, entre autres, des petites GTPases dont Arf6 et Arf1 et permet ainsi de contrôler leur activité́ de manière efficace lors d’une stimulation prolongée [99-101].

3. Les petites GTPases

Les petites GTPases sont des molécules de signalisation regroupées dans la super famille RAS (Figure 4). On en dénombre actuellement plus de 150 petites GTPases qui sont présentes chez la levure, les eucaryotes et l'humain. Ces GTPases sont appelées petites protéines G, car contrairement aux protéines G hétérotrimériques, elles sont des protéines composées d’une seule sous-unité, donc monomériques, d’une vingtaine de kilo dalton (20-25 kDa). La caractéristique principale des petites protéines G est leur capacité à fixer en alternance du guanosine diphosphate (GDP) et du guanosine triphosphate (GTP). Ces

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GTPases peuvent être toujours ou partiellement associées aux membranes, ou non associées à ce compartiment. [102-104].

Figure 4 : Classification des petites GTPases humaines en familles ; Ras, Ran, Rho, Rab et Arf [105].

Une comparaison des séquences d'acides aminés des protéines Ras de différentes familles a révélé que leurs structures primaires sont conservées et qu’elles sont homologues à 30–55% entre elles. La plupart des petites protéines G sont largement distribuées dans les diverses cellules des mammifères, bien que leurs niveaux d’expression varient d'un type cellulaire à l'autre [103].

Cette super famille Ras peut être subdivisée en cinq familles : Ras, Rho, Rab, Ran et Arf, en se basant sur la similitude des séquences d’acides aminés et des fonctions (Figure 4) (Tableau 3). Par exemple, les protéines de la famille Ras ont une homologie de séquences d'acides aminés relativement élevée (50–55%), alors que les protéines Rab et Rho n’en partagent que 30% d’homologie avec les protéines Ras [103, 106]

Tableau 3 : La super famille Ras.

Rab Ras Arf Rho Ran Other

Rab9B RabL4 Rab18 Rab7L1 Rab32 Rab38 Rab7B Rab40A Rab40B Rab23 Rab34 Rab36 Rab15 Rab27A Rap2C Rheb Rheb2 NKIRas1 NKIRas2 Noey2 Di-Ras1 Arf1 Arf3 Arf4 Arf5 Arf6 Arl1 Arl2 RhoA RhoB RhoC RhoD RhoH RhoG Wrch-1 Ran Rab20 RabL2A RabL2B RabL3 RabL5 Miro1 Miro2

15 Rab7A Rab9A Rab22A Rab22B Rab6B Rab6A Rab6C Rab28 Rab5B Rab5A Rab5C Rab24 Rab17 Rab21 Rab40C Rab3D Rab3B Rab3A Rab3C Rab10 Rab13 Rab8A Rab8B Rab30 Rab14 Rab4A Rab4B Rab27B Rab26 Rab37 Rab39A Rab39B RasEF Rab11A Rab11B Rab42 Rab25 Rab33A Rab33B Rab2B Rab2A Rab41 Rab19 Rab1B Rab1A Rab35 Rab12 Di-Ras2 RRP22 Rem1 Rem2 Gem Rad Rerg Ris FLJ22655 N-Ras H-Ras K-Ras2B M-Ras E-Ras R-Ras RasD1 RasD2 RasL10B RasL11A RasL11B TC21 Rit1 Rit2 RalA RalB Rap1A Rap2A Rap1B Rap2B Arl3 Arl4 Arl5 Arl6 Arl7 Arl8 Arl9 Arl10A Arl10B Arl10C Arl11 Arl2L1 Ard1 FLJ22595 Arf4L ArfRP1 ArfRP2 Sar1a Sar1b LOC339231 Wrch-2 RhoBTB1 RhoBTB2 Rac1 Rac2 Rac3 Rnd1 Rnd2 Rnd3 TCL TC10 Cdc42 Rif SRPRB LOC401884

Structure générale des GTPases

Les petites protéines G ont une structure globulaire composée par un feuillet β central constitué de 6 brins entourés par 5 hélices α. Les différentes structures des petites GTPases G ont montré qu’elles partagent un repliement similaire (Figure 5) [105]. Les résidus 4–166 correspondent au site nucléotidique (domaine G du noyau) ~ 20 kDa. Ce domaine est conservé parmi toutes les protéines de la superfamille Ras. Il est composé de cinq motifs caractéristiques qui sont des séquences consensus conservées impliquées dans la liaison des phosphates du nucléotide avec le magnésium (Mg2+_{) (Phosphate Magnésium : PM) ou}

interagissant avec la base guanine (G). Les régions commutatrices I (SI) et II (SII) changent de conformation à l’état lié au GTP et contribuent à la liaison de l’effecteur au domaine effecteur principal (domaine E). Les protéines de la famille Ras et Rho possèdent des

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séquences supplémentaires hypervariables (HV) C-terminales pouvant subir plusieurs modifications post-traductionnelles comme indiqué dans la Figure 5 [105]. Les protéines Rab contiennent également une région HV C-terminale qui se termine par des motifs contenant des cystéines qui sont modifiées par addition de lipides. Certains motifs en N-terminal subissent une méthylation carboxylique. Les protéines de la famille Arf sont caractérisées par une extension N-terminale myristilée impliquée dans l'interaction membranaire. La GTPase Ran contient une extension C-terminale essentielle à la fonction. Les protéines Rho sont caractérisées par une séquence « insert Rho » (jusqu'à 13 acides aminés) impliquée dans la régulation de leurs effecteurs [105].

Figure 5 : Structure générale des GTPases [105].

Activation des GTPases

Les petites GTPases de la super famille RAS sont des interrupteurs moléculaires qui existent sous deux formes : une forme active lorsque liées au GTP ou inactive lorsque liées au GDP (Figure 6) [103, 107]. Des GEFs catalysent le chargement du GTP sur la protéine lui permettant d’adopter sa conformation active. Celle-ci peut interagir avec sa protéine effectrice permettant alors la cascade de signalisation menant à la fonction cellulaire. Ces GTPases possèdent une faible activité GTPase intrinsèque et ont besoin des protéines activatrice des GTPases (GAP) qui favorisent le retour à la conformation inactive en stimulant l’hydrolyse du GTP [108, 109]. Certaines GTPases (Rho/ Rac/ Cdc42, Rab et Ran) sont aussi sous le contrôle d’un autre type de protéines inhibitrices appelées Guanine

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Dissociation Inhibitors (GDIs), respectivement les Rho, les Rab et Ran GDI. Ces inhibiteurs présentent une spécificité de substrat plus large que les GEFs ou les GAPs. Elles sont actives sur les protéines Rho / Rac / Cdc42, Rab et Ran [103].

Les GDIs empêchent la dissociation basale du GDP des petites GTPases mais aussi la dissociation stimulée par les GEFs. Les petites GTPases restent liées au GDP et sont séquestrées sous leurs formes inactives. Ces GDI permettent aussi aux protéines de se dissocier des membranes et de les séquestrer dans le cytosol.

Figure 6 : Cycle d’activation des GTPases [104].

Les petites GTPases liées au GDP sont activées par les GEFs. Sous leur forme liée au GTP, elles interagissent avec les protéines effectrices pour déclencher la signalisation en aval. Par la suite, la liaison à une GAP stimule l'hydrolyse du GTP et désactive la petite GTPase. Les GDIs séquestrent les petites GTPases et assurent une régulation fine des voies de signalisation intracellulaires et des fonctions cellulaires.

Dans les sections qui suivent, je vais vous évoquer brièvement les différentes familles de GTPases et plus spécifiquement la famille des Arfs.

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Les GTPases Ras

Les premiers membres de la famille Ras ont été découverts sur la base de leur homologie avec les gènes du virus du sarcome de rat [110]. Cette famille est constituée de 36 petites GTPases qui sont localisées au niveau de la membrane plasmique, de l’appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique (RE). Cette localisation des protéines Ras sur la face cytoplasmique de la membrane est médiée par une modification post-traductionnelle de leurs parties C-terminales (farnésylation, palmitoylation et géranylgéranylation) en combinaison avec des motifs polybasiques [111].

Les protéines Ras, comme toutes les petites GTPases, peuvent alterner entre un état d'activation ou d’inactivation. En réponse à divers stimuli extracellulaires, les protéines de la famille Ras sont activées par des GEF. Ces dernières contiennent un domaine CDC25 catalytique associé majoritairement avec un REM (Ras Exchanger Motif) N-terminal. Ces GEFs favorisent la libération du GDP de Ras et la liaison avec un GTP. Ce changement va permettre aux GTPases d’interagir avec leurs protéines effectrices. Les effecteurs directs des protéines Ras activées sont les protéines et les lipides kinases, telles que la Raf kinase conduisant à l'activation de la cascade de Mitogen-activated protein kinases (MAP kinases) ou la phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) contribuant à la stimulation de l'Akt [112]. Par la suite, ces Ras GTPases peuvent être inactivées par deux familles de GAP soient les RasGAP et les RapGAP qui augmentent l’activité d'hydrolyse du GTP en GDP [109, 113].

De cette manière, les protéines Ras ont un rôle majeur dans l'homéostasie des voies d’activation cellulaire. L’activation de ces GTPases régule de multiples réseaux de signalisation qui contrôlent de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la morphologie et la survie cellulaire [113, 114]. Les protéines Ras régulent ces fonctions principalement par le biais de l'expression des gènes. L’altération de ces fonctions conduit à différentes pathologies. Une autre caractéristique des protéines Ras est que les mutations de leurs gènes et de leurs gènes régulateurs sont à l'origine de différents types de cancers humains. En effet, c’est en 1982 que la première découverte de gènes RAS mutés dans des cancers humains a vu le jour. Actuellement, la majorité des Ras sont considérées comme étant des oncoprotéines, à l’exception de certaines agissant comme suppresseurs de tumeurs (Rerg, Noey2 et DRas) [115]. En effet, 20 à 30% des tumeurs humaines possèdent des mutations oncogéniques de Ras [116]. Les formes mutées de Ras

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ont ensuite été validées dans des études de la prolifération et la transformation de cellules cultivées, ce qui a suscité un intérêt pour développer des inhibiteurs de Ras. Malgré plus de trois décennies d’efforts et de recherche, aucun des inhibiteurs anti-Ras ne s’est avéré efficace au niveau clinique [103].

Dans le PMN, une étude a montré grâce à un traitement avec un inhibiteur de la GTPase Ral et la surexpression d’un Ral constitutivement actif (Ral23V), que la GTPase Ral est un régulateur essentiel du PMN qui contrôle spécifiquement la libération de granules secondaires lors de la réponse du PMN à la stimulation avec le N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) [117].

La GTPase Ran

La protéine Ran est la petite GTPase la plus abondante dans la cellule. Il existe une seule protéine humaine Ran. Elle n’est pas associée aux membranes et se situe majoritairement dans le nucléoplasme [118]. D’ailleurs, cette GTPases est connue pour sa fonction dans le transport nucléocytoplasmique, dans l'assemblage de fuseaux mitotiques et dans l'assemblage nucléaire post-mitotique [103, 114, 119, 120]. Contrairement aux autres petites GTPases, la fonction de Ran dépend d'un gradient spatial de sa forme liée au GTP. En effet, Ran est régulée par une seule GEF nucléaire, RCC1, et par une GAP cytoplasmique. Il en résulte une concentration élevée de Ran-GTP dans le noyau et une faible concentration dans le cytoplasme, ce qui facilite la directionnalité de l'importation et de l'exportation de produits nucléaires. Lorsque Ran est liée au GTP, elle agit sur les récepteurs de transport nucléaire (NTR) [121]. Les NTR forment des complexes avec la cargaison de transport et les facteurs d’assemblage des broches ou les nucléoporines. Lorsque Ran-GTP lie les NTR, elle induit la dissociation du complexe formé par les NTR [121-124].

Il est maintenant bien établi que Ran est surexprimée dans divers cancers. Cette GTPase joue un rôle important dans le développement et la progression du cancer [125]. En effet, l'augmentation des taux de Ran liée au GTP est corrélée à une agressivité accrue des cellules cancéreuses in vitro et in vivo [126-129]. Il a été démontré que Ran était une cible thérapeutique prometteuse pour le cancer [130, 131].