Arf6 dans la régulation des fonctions intégrines dépendantes : Adhésion,

En se basant sur les études précédentes de notre laboratoire et en ayant les outils appropriés, nous nous sommes intéressés à l’existence d’un axe de signalisation CTH-1/Arf6 et au rôle d’Arf6 dans l’adhésion et lors de la migration des PMNs vers le site inflammatoire. Plusieurs études ont souligné l’importance des β2 intégrines LFA-1 et Mac-1 dans la modulation des fonctions majeures du neutrophile, notamment l’adhésion et la migration transendothéliale [63, 532]. Le fibrinogène est un constituant de la matrice extracellulaire reconnu spécifiquement par l’intégrine Mac-1 [300, 304, 305]. ICAM-1 est le premier ligand identifié pour LFA-1 avec lequel elle a le plus d’affinité. Cependant, les deux sont indispensables à l’adhésion ferme pendant l’extravasation [313]. Les études précédentes de notre laboratoire ont montré que la CTH-1 régule de façon différentielle l’adhésion du PMN sur l’ICAM-1 et le fibrinogène. Il a également été montré chez les PMNs que l’effet de CTH- 1 sur l’adhésion dépendante d’ICAM-1 est dû à son effet sur LFA-1. Cette régulation de l’adhésion des PMNs est due à un effet de la CTH-1 différentielle sur les β2 intégrines, respectivement activateur de LFA-1 et inhibiteur de Mac-1. La CTH-1 a aussi été décrite comme un inducteur de la translocation et de l’activation d’Arf6 à la membrane cytoplasmique. Nous avons alors émis l’hypothèse que la CTH-1 pourrait réguler ces β2 intégrines via l’Arf6. Pour tester cette hypothèse, nous avons modulé le niveau d’expression d’Arf6 avec un siRNA spécifique dans des PLB-985 différenciées (PLB-985d) ressemblant à un PMN. L’effet de cette modulation d’Arf6 a été vérifié sur la capacité́ d’adhésion, dépendante de LFA-1 et de Mac-1, par mesure de l’adhésion des cellules sur l’ICAM-1 et le fibrinogène à la suite d’une stimulation au fMLP. Nos résultats ont montré que l’ablation d’Arf6 dans cette lignée grâce à un siRNA Arf6 spécifique, entrainait une diminution de l’adhésion de ces cellules en réponse au fMLP. Cette diminution de l’adhésion s’est retrouvée avec les divers substrats utilisés (ICAM-1, fibrinogène et fibronectine). Nos résultats suggèrent que CTH-1 puisse agir via Arf6 pour activer la β2 intégrine LFA-1. Cependant, le résultat de l’adhésion obtenu dans notre modèle sur le substrat de Mac-1 différait des résultats précèdent montrant une augmentation de l’adhésion lors de l’ablation de la GEF CTH-1. Ceci suggère que la protéine Arf6 pourrait être activée via d’autres GEFs. Ainsi, l’axe Arf6/CTH-

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1 n’est pas le seul possible, Arf6 pourrait emprunter une autre voie de signalisation, indépendante de CTH-1.

Par la suite, cette hypothèse a été vérifiée par la transfection de dominant positif (Q67L) et négatif (T27N) d’Arf6 au sein des PLB-985d. Cependant, l’adhésion est restée stable lors de l’expression de l’un ou l’autre des dominants Arf6 dans les PLB-985d à la suite d’une stimulation au fMLP. Cependant, il s’est avéré que l’efficacité de transfection des PLB était de seulement 40%. Or, ceci reste insuffisant pour nous permettre d’évaluer des différences au niveau de l’adhésion entre les différentes conditions. En effet, si seul 40% des PLB expriment les dominants, même si ceux-ci font varier l’adhésion, nous ne pourrions pas le voir dans nos mesures. Il est donc très probable que l’effet de ces dominants sur l’adhésion ait été masqué par les cellules (60% restant) sauvages (non transfectées). Pour valider cette hypothèse, les cellules ont alors été triées après la transfection, ainsi seules les cellules efficacement transfectées ont été évaluées pour l’adhésion. De cette manière, nous avons pu montrer une diminution de l’adhésion des PLB-985 exprimant le dominant négatif d’Arf6 sur l’ICAM-1. L’ablation d’Arf6 réduit donc considérablement la capacité́ d’adhésion des cellules aux substrats testés (ICAM-1 et fibrinogène), suggérant ainsi une régulation positive d’Arf6 sur les fonctions Mac-1 et LFA-1 dépendantes. Néanmoins, l’adhésion des PLB-985 aux différentes matrices extracellulaires est un effet global. De ce fait, nous n’avons pas pu discriminer l’implication d’Arf6 tant dans l’expression des intégrines, que dans leurs états d’activation.

Une précédente étude démontre que la diminution de CTH-1 via un siRNA augmente l’adhésion des PLB-985d à la fibronectine, composante de la matrice extracellulaire lors d’une stimulation en réponse au fMLP. C’est pourquoi, nous avons décidé d’étudier l’impact de l’Arf6 sur l’adhésion à la fibronectine. Nous avons alors constaté que la diminution de l’expression d’Arf6 via un siRNA ou la surexpression de son dominant négatif inhibaient l’adhésion à la fibronectine. Ce résultat qui semble en contradiction avec celui obtenu suite à la diminution de CTH-1 pourrait être expliqué par l’interaction d’Arf6 avec d’autres GEFs, ce qui pourrait également expliquer l’inhibition de l’adhésion. D’ailleurs, la GEF d’Arf6 BRAG2 module l’adhésion des cellules Hela à la fibronectine. De plus, Arf6 et les GEFs comme BRAG2 [533, 534] peuvent modifier l’adhésion à la fibronectine dans la lignée Hela

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grâce à une variation dans le recyclage des intégrines β1, altérant ainsi leur expression à la surface cellulaire [533]. L’accumulation intracellulaire des intégrines β1 entraîne une diminution de l'adhésion et de la migration cellulaires. Néanmoins, rien n’est encore décrit concernant le rôle des protéines BRAG pour l’adhésion des PMNs. Chez les souris, la suppression de l'Arf6 dans les cellules endothéliales interfère avec le recyclage des intégrines β1 stimulé par la croissance des hépatocytes [225]. Ces études soutiennent le rôle important d'Arf6 dans le recyclage et l'expression des intégrines β1, contrôlant l'adhérence et la migration des cellules. Sachant que les principaux récepteurs de la fibronectine sont les intégrines α4β1, α5β1 et αVβ3. Nous pouvons supposer qu’Arf6 agit en altérant le recyclage de ces intégrines indépendamment de la CTH-1.

Enfin, les PLB-985 étant une lignée cancéreuse, nous avons cherché à valider nos résultats chez les PMNs humains. L’efficacité de transfection des PMNs humaines étant très faible, nous avons opté pour l’utilisation d’une drogue, la Secin B7 (inhibiteur des CTHs), plus spécifique que la Secin H3 pour la CTH-1. Cette dernière a été testée sur des essais d’adhésion et de production du superoxyde, mais s’est finalement avérée moins efficace que la Secin H3 (Figure supplémentaire 1). Ceci pourrait s’expliquer par un manque de solubilité et/ou de biodisponibilité de la drogue. Un peptide inhibiteur spécifique d’Arf6 a également été employé, mais sa toxicité au-dessus de 1µM nous a empêché de l’utiliser au sein des PMNs humaines. À 1µM, concentration limite non toxique, aucune différence n’a pu être observée dans l’adhésion des PMNs humains et des PLB-985d, ce qui peut être expliqué par une absence d’inhibition d’Arf6 due à la concentration trop faible du peptide.

Un modèle murin cKO Arf6 a été utilisé dans le but d’évaluer in vivo le recrutement des PMNs au niveau du site inflammatoire des poches d’air suite à une stimulation par des agonistes. Nos résultats indiquent que la suppression de l’expression d’Arf6 réduit le recrutement de PMNs induits par les peptides chimiotactiques et le LPS dans les poches d’air. Cela démontre qu’Arf6 joue un rôle dans la migration des PMNs. L’utilisation du modèle cKO Arf6 nous a permis d’évaluer l’expression des β2 intégrines Mac-1 et LFA-1 à la surface des PMNs. Le recrutement réduit des PMNs dans les poches d'air corrélait avec une expression réduite à la surface cellulaire des β2 intégrines. Il est important de mentionner que nous avons utilisé des anticorps qui reconnaissent les intégrines à la surface cellulaire, mais

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sans pour autant nous informer sur l’état d’affinité et d’avidité de ces dernières. Ces résultats, pris ensemble, ont confirmé les observations d’adhésion in vitro avec les PLB-985 transfectées avec le dominant négatif d’Arf6. Dans notre modèle, Arf6 interfère dans l’expression des intégrines β1 et β2 et pourrait jouer un rôle au niveau de leur recyclage. Nos résultats suggèrent notamment un rôle critique d'Arf6 dans l'adhésion des PMNs, ce qui induit une diminution du recrutement in vivo des PMNs dans la zone inflammatoire. De plus, les PMNs qui sont recrutés aux poches d’air, possèdent une délétion incomplète d’Arf6, ce qui expliquerait leur présence aux poches d’air. Cela pourrait signifier que ce modèle d'inflammation pourrait indirectement favoriser seulement le recrutement des PMNs où l’Arf6 est partiellement supprimé. En effet, il se pourrait que les PMNs ayant une suppression totale du gène d’Arf6 n’arrivent jamais au site inflammatoire. Des études précédentes ont montré qu’Arf6 est responsable de l’activation de la PLD, un des effecteurs d’Arf6, dans le PMN [535]. L’activation de cette dernière contribue à la régulation des fonctions dépendantes des intégrines β1 et β2 dans divers leucocytes [183, 533]. Selon une autre étude, l’activation de l’intégrine Mac-1 serait régulée par la PLD contrôlant ainsi la transmigration des PMNs en réponse au fMLP [536]. Nous pensons qu’Arf6 pourrait réguler l’adhésion et l’expression des intégrines via l’activation de la PLD. Une étude a montré que l’ablation de l’ARAP3, GAP d’Arf6 dépendant de l’activation du PIP3, régule l’affinité et l’avidité des β2 intégrines Mac-1 et LFA-1. Toutefois, aucune modification de l’expression de ces dernières n’a été observée à la surface des PMNs [537]. Dans les PMNs, il est envisageable que l’effet de l’Arf6 via la PLD sur le recyclage de Mac-1 est indépendant de la CTH-1. Il est aussi indépendant de l’ARAP3 pour le recyclage de Mac-1 et de LFA-1.

En conclusion, nous avons montré qu’Arf6 modulait les fonctions intégrines dépendantes suite à une stimulation au fMLP et au LPS dans le neutrophile murin. Le rôle de l’Arf6 dans cette signalisation pourrait s’expliquer par un retard du relargage des vésicules intracellulaires renfermant les intégrines au niveau de la membrane plasmique, et empêcherait leurs expressions membranaires. Cela induit une altération des fonctions dépendantes des intégrines due à leurs nombres insuffisants, empêchant ainsi une adhésion et une migration normale des PMNs. Nos données soulignent donc que la suppression d'Arf6 réduit l'adhésion des PMNs aux ligands des intégrines et la migration vers les sites d'inflammation. De plus, une étude récente a montré que l’Arf6 est impliquée dans la

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polarisation des PMNs impactant ainsi la migration de ces derniers [538]. Il serait intéressant d’investiguer la polarisation des PMNs de souris cKO Arf6 lors de leur migration vers un site inflammatoire. Finalement, notre modèle de souris cKO pour Arf6 a induit plus de 70% de diminution de l’expression d'Arf6 dans les PMN en situation inflammatoire de la poche d’air. Ce modèle pourrait donc être utilisé pour disséquer le rôle d'Arf6 dans d'autres fonctions des PMNs.

1.2.3. Arf6 dans la régulation des fonctions et du fonctionnement des