Arf6 dans la régulation des fonctions et du fonctionnement des PMNs : le

production des ROS et du superoxyde

Fort de notre modèle de souris cKO pour Arf6, nous nous sommes proposés de faire un criblage des différents gènes potentiels dont l’expression serait modulée à la suite de l’ablation d’Arf6. Afin d’assurer une délétion maximale d’Arf6 dans les PMNs nous avons utilisé des PMNs recrutés aux poches d’air à la suite d’une stimulation au LPS (délétion de plus 70 % d’Arf6). Notre modèle est basé sur une délétion d’Arf6 uniquement dans les PMNs. Il est primordial d’avoir une population de PMN la plus pure possible. Nous avons donc utilisé un kit de sélection négative qui nous a permis d’avoir une population Ly6G-positives à près de 94%. Nous avons également utilisé deux groupes de souris contrôles (flox+/+Cre-/- et Cre+/+). Après l’analyse de nos résultats, nous nous sommes focalisés sur Lacc-1 qui est le gène le plus drastiquement touché par la suppression d’Arf6. Nous avons observé la diminution de l’expression de la FAMIN, protéine codée par le gène Lacc-1, dans les PMNs des souris cKO Arf6 comparativement aux PMNs des souris contrôles (flox+/+Cre-/-). Vu la difficulté technique à générer une population pure de PMNs dans les souris nous avons utilisé une lignée cellulaire THP-1 qui exprime le gène Lacc-1 lors d’une stimulation au LPS. Dans cette lignée, 48h après la suppression de l’Arf6 par nucléofection, une stimulation de 6h au LPS nous a permis de valider la diminution de l’expression de la protéine FAMIN dans les cellules qui n’expriment plus l’Arf6. Ces résultats montrent que l’expression du gène Lacc- 1 et de sa protéine est sous le contrôle de la GTPase Arf6.

Plusieurs études suggèrent un rôle de FAMIN dans le métabolisme cellulaire et la glycolyse [539], nous voulions alors vérifier si la délétion d’Arf6 dans les PMNs aurait aussi un impact sur leurs métabolismes via son contrôle de l’expression du gène Lacc-1. Nous

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avons évalué la glycolyse, la consommation d’oxygène et dans les PMNs issus de la poche d’air des souris cKO Arf6 comparativement au PMNs des souris contrôles. Pour la première fois, nous avons montré que la délétion d’Arf6 entraînait la diminution la glycolyse et de la consommation de l’oxygéne des PMNs entre autres possiblement via son inhibition de FAMIN.

Des mutations au niveau du gène Lacc-1 ont été associées chez l’homme avec plusieurs maladies inflammatoires comme l’arthrite juvénile, la maladie de Crohn, la lèpre et la maladie de Still [540-545]. De plus, dans le modèle de l’arthrite induite par le Collagène (CIA) une étude a montré que la suppression de Lacc-1 dans les souris augmente les indices de la maladie. Dans ces souris KO Lacc-1 l’expression de l’IL17 et du TNF est augmentée dans les lymphocytes [546]. Dans notre modèle murin cKO Arf6, il serait intéressant de voir l’impact de la suppression de la GTPase Arf6 dans les maladies inflammatoires. Le modèle d’arthrite induite par le Kbn pourrait être étudié chez les souris cKO Arf6. L’expression et le relargage du TNF ou d’autres cytokines inflammatoires seraient alors évalués.

Par ailleurs, nous avons trouvé important d’évaluer d’autres fonctions en lien avec la glycolyse et la consommation d’oxygène, plus particulièrement la production des ROS et du superoxyde. Nos résultats sur la production des ROS et du superoxyde par les PMNs des souris cKO Arf6 versus contrôle (flox+/+_Cre-/-_{) prouvent que l’activation de la NADPH} oxydase par le fMLP est régulée par l’Arf6. Plusieurs études dont celles de notre laboratoire ont montré que l’inhibition d’Arf6 ou de sa GEF (CTH-1) diminue l’activité de la PLD des PLB-985 stimulées au fMLP [187, 249, 547]. D’autres études ont montré que l’activation de la PLD est préalable au fonctionnement du complexe NADPH oxidase et à la production du superoxyde. Nos résultats nous ont confortés dans l’idée de l’existence d’un axe de signalisation CTH-1/Arf6/PLD modulant la production des ROS par les PMNs [240].

Le rôle d’Arf6 a déjà été mis en évidence dans la phagocytose dépendante des FcγR chez les macrophages [230-232, 548, 549]. Nous avons voulu évaluer l’impact d’Arf6 sur la phagocytose de bio-particules de zymosan opsonisées dans notre modèle de PMN cKOArf6. Nos résultats montrent une baisse de la phagocytose au niveau des PMNs issus de la AP des souris cKO Arf6 comparativement aux souris contrôles. La diminution de la phagocytose des PMNs cKO Arf6 pourrait être attribuée à plusieurs facteurs pouvant influencer la capacité phagocytaire d’une cellule. Arf6 pourrait jouer un rôle dans le recyclage des FcγR qui seront

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par conséquence moins disponibles à la surface cellulaire. Cependant, malgré des similitudes entre les FcγR PMNs humains et murins, il existe des différences entre les deux espèces au niveau FcγR exprimer a la surface des cellules qu’il faut prendre en compte lors de l’extrapolation aux PMNs humains [499]. Nos résultats devront être revalidés sur des cellules humaines ou une lignée comme les PLB-985 différenciées en PMNs.

De plus, la GTPase Arf6 a été impliquée, dans des études précédentes, dans le remodelage de l’actine corticale [157]. Ce remodelage est nécessaire lors de la phagocytose qui implique les mouvements de la membrane plasmique. Arf6 pourrait donc avoir un impact direct sur cette fonction par le biais de la polymérisation de l’actine corticale, en plus de son rôle lors du recyclage des FcR. De plus, l’expansion des pseudopodes et la formation du phagosome nécessitent un apport de membranes provenant des vésicules et de la fusion avec des lysosomes lors de la maturation du phagosome [550-552]. Des études ont montré l’importance d’Arf6 lors de la formation du phagosome et des pseudopodes du fait de son implication dans le trafic vésiculaire [550, 553].

Pour conclure, nos résultats suggèrent que les fonctions principales de défense des PMNs, la libération des ROS et la phagocytose, sont diminuées dans les PMNs cKO Arf6 comparativement aux PMNs contrôles. L’ablation de l’Arf6 va probablement impacter la capacité des PMNs à éliminer les pathogènes et par extrapolation, va induire une diminution de l’inflammation. Une étude utilisant un modèle d’arthrite induit au collagène chez la souris et un modèle inflammatoire induit par la carragénine au niveau de la AP a montré que l’inhibition avec la SecinH3 des CTH réduit l’inflammation et la progression de l’arthrite [554]. Il serait intéressant de valider ces observations de baisse de la progression de la maladie dans notre modèle de souris cKO Arf6 et d’établir son impact, par exemple dans un modèle inflammatoire de l’arthrite induite par Kbn.

1.2.4. La survie des PMNs et l’homéostasie

Les PMNs représentent la première ligne de défense lors d’une inflammation. Le retour à l’homéostasie est un préalable lors de la résorption de l’inflammation garantie par une apoptose spontanée des cellules en surplus. Après avoir évalué l’impact de la suppression d’Arf6 sur les diverses fonctions du PMN, nous nous sommes questionnés sur son rôle dans la survie des PMNs inflammatoires. Nous avons évalué la survie de PMNs issus de la poche

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d’air à la suite d’une stimulation au LPS que nous avons mis en culture 24 heures, avec ou sans sérum. Nous avons obtenu des résultats inverses selon le milieu de culture avec ou sans le sérum des PMNs, respectivement une diminution et une augmentation de l’apoptose des PMNs cKO Arf6 comparativement aux PMNs contrôles (flox+/+cre-/-). Nous pensons que ce résultat est dû à un facteur qui se trouve dans le sérum qui activerait une voie de signalisation cellulaire dépendante d’Arf6 induisant l’activation des voies de survie cellulaire. D’autre part, nos résultats ont montré une modulation de plusieurs gènes impliqués dans l’apoptose cellulaire lors de l’ablation d’Arf6 dans les PMNs de souris cKO ARF6 comparativement aux PMNs issus des souris (flox+/+Cre-/-). Parmi les gènes modulés à la baisse dans les PMNs Arf6 cKO on retrouve Ciapin1, Rnd1, Bcl2a1d, Arhgef3 et Ing2 qui sont tous décrits dans la littérature comme ayant un rôle anti-apoptotique [555-559]. De plus, les gènes proapoptotiques, sont modulés à la hausse (cdk5rap1) et à la baisse (Tnfsf9 et Il23a) lors de la suppression de l’Arf6 dans les PMNs. Ces résultats suggèrent qu’Arf6 joue un rôle dans l’apoptose en régulant l’expression des gènes. Une étude plus approfondit est nécessaire pour comprendre le mécanisme d’action de l’Arf6 dans l’apoptose du PMN.

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Conclusions

Les expériences réalisées dans le cadre de la présente thèse nous ont permis d’identifier Arf6 comme un acteur clé capable de réguler les fonctions du PMN, de moduler son expression génique et même d’impacter son métabolisme. Cette étude nous a permis de mettre en lumière qu’une ablation d’Arf6 induit une diminution du recrutement des PMNs murin in vivo lors d’une stimulation au LPS ou avec le fMLP. De plus, cette diminution corrèle avec une diminution de l’expression des intégrines LFA-1 et Mac-1. Nous avons montré qu’Arf6 est primordial lors d’une signalisation fMLP dépendante chez le PMN qui module la production du superoxyde et des ROS. Les résultats obtenus avec les PMNs de notre modèle cKO Arf6 rejoignent les études précédentes sur les macrophages et l’importance d’Arf6 dans la phagocytose. Pour la première fois, nous avons montré que la suppression de l’Arf6 dans les PMNs diminue le métabolisme cellulaire probablement via l’inhibition de l’expression de Lacc-1.

Vu le nombre et la diversité des effets d’Arf6 sur les fonctions des PMNs in vitro et in vivo, nous pensons qu’Arf6 pourrait avoir un effet anti-inflammatoire ou immunosuppresseur. Comme perspective, nous proposons de valider son effet sur la maladie inflammatoire de l’arthrite K/BxN chez les souris cKO Arf6.

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