Choix du modèle murine cKO Arf6 pour l’étude : Le système Elane cre

1.1.1.

Mise en contexte

Afin d’étudier le rôle de la petite GTPase Arf6 sur les fonctions des PMNs, nous avons généré une lignée de souris transgéniques déficientes pour Arf6 uniquement dans les PMNs, et ce à l’aide d’un système sélectif Elane cre. Ce système implique le croisement de deux lignées de souris transgènes. Au sein de la première, le gène codant pour recombinase Cre a été introduit en aval du promoteur du gène de l’élastase, ceci ayant pour conséquence d’induire l’expression de la recombinase cre à la place de l’elastase. Dans la deuxième lignée, notre gène d’intérêt Arf6, a été encadré par des sites reconnus spécifiquement par la recombinase Cre, les sites loxP.

Le croisement de ces deux lignées de souris génétiquement modifiées a permis de générer une nouvelle lignée de souris avec l’Arf6 uniquement délété dans les PMNs (c’est ce qu’on appelle une mutagénèse conditionnelle). Puisque l’élastase est une protéine spécifique aux PMNs exprimée dès le stade promyélocyte, son expression est remplacée par celle de la Recombinase cre au sein des PMNs. Cette dernière va alors reconnaître et couper les sites loxP de part et d’autre du gène Arf6, entrainant alors son excision. C’est pourquoi ce croisement nous a permis d’obtenir des souris déficientes pour le gène Arf6 dans les PMNs.

1.1.2. Les points à relever et les limitations techniques

Ce modèle nous a permis d’observer les effets spécifiques de la délétion d’Arf6 dans les PMNs. De plus, le modèle inflammatoire de la poche d’air nous a permis d’évaluer la migration des PMNs in vivo vers le site inflammatoire.

Cependant, il est important de préciser les limites de ce modèle de souris cKO pour Arf6. D’une part, cette lignée transgénique n’est pas seulement inactivée pour Arf6 puisque l’expression du gène de l’élastase est lui aussi supprimé au sein des PMNs. Afin de contrecarrer cette limite, différents groupes de souris contrôles (les souris flox+/+Cre-/- et les

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souris Cre+/+_{) ont été utilisés au cours de ce projet, notamment dans le but de discriminer les} effets induits par l’inactivation du gène de l’élastase de ceux induits par le cKO d’Arf6.

Le deuxième point limitant de ce modèle est la délétion partielle du gène Arf6. En effet, nos résultats ont mis en évidence que la lignée transgénique de souris Elanetm1(cre) ne permet pas la suppression complète du gène d’intérêt (Arf6). La quantification des ARN messagers par RT-PCR, dans les PMNs purifiés de la moelle osseuse (MO), montre une diminution de l’expression du gène Arf6 de 36% et 40% dans les PMNs des souris (flox+/+_Cre+/-_{) et (flox}+/+_Cre+/+_{) respectivement, comparés aux PMNs issus de la MO des}

souris contrôles. Ainsi, même si les PMNs de la MO expriment la recombinase Cre, l’inactivation du gène Arf6 n’est pas complète au sein de notre modèle ; on parle alors de répression (« knock down ») de l’expression du gène Arf6 et non d’une inactivation. Les PMNs de la MO sont immatures, ainsi le promoteur de l’élastane ne permet pas une expression suffisante de la recombinase Cre pour permettre l’inactivation totale d’Arf6.

Au cours de notre étude, nous avons montré par immuno-buvardage, au sein des PMNs inflammatoire de la poche d’air, une diminution de l’expression de la protéine Arf6 de 55% dans les souris (flox+/+Cre+/-) et de 74% chez les souris homozygotes pour le gène de Recombinase Cre (flox+/+Cre+/+), comparativement aux souris contrôles (flox+/+Cre-/-). Ainsi, au sein des PMNs inflammatoires, il semble y avoir une diminution de l’expression du gène Arf6 plus prononcée comparativement aux PMNs immatures (issues de la MO).

Les PMNs issues de la poche d’air représentent des cellules activées, qui ont préalablement migré de la MO jusqu’au site inflammatoire. L’élastase a un rôle important au sein des PMNs, notamment lors de la migration des PMNs dans la matrice extracellulaire. C’est à ce moment-là que l’expression de l’élastase est la plus utile, ce qui expliquerait pourquoi la délétion d’Arf6 est plus importante après cette étape au sein des PMNs issues de la poche d’air. De nombreuses autres études confortent nos résultats et mettent en cause l’efficacité du système Elane Cre. Une étude comparative des différents systèmes de délétion de différents gènes réalisée par Abram & al, montre que le modèle Elane Cre ne permet pas une délétion complète du gène d’intérêt mais uniquement de 50% [527]. Néanmoins, dans cette étude le système Elane Cre n’a pas été validé dans un modèle inflammatoire; les auteurs ont alors estimé que la délétion pourrait être plus importante dans un modèle inflammatoire. Ceci est en accord avec les résultats que nous avons obtenus car la délétion du gène Arf6

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semble plus importante au sein des PMNs issus de la poche d’air des souris, comparativement aux PMNs de la MO, puisque son expression (ARNm, protéine) est plus fortement diminuée. Le dernier point important dans notre modèle murin est la délétion de la protéine d’intérêt Arf6 uniquement chez les PMNs. Il est primordial dans notre travail ex vivo d’avoir une population pure de PMNs et d’éviter toute contamination par un autre type cellulaire susceptible d’induire un biais dans nos résultats. Pour nous assurer de la pureté des PMNs, dans le modèle inflammatoire de la poche d’air, la collecte des cellules recrutées se fait 4 heures après une stimulation au LPS, pic du recrutement des PMNs. L’analyse par cytométrie en flux a montré que 85% des cellules de notre exsuda de poche d’air sont Ly6G+_{, marqueur}

leucocytaire (PMNs et monocytes). Plusieurs études suggèrent qu’une sous-population de monocytes exprime l’élastase du PMN [528-530], l’une d’entre elles montre que leur gène d’intérêt était en partie supprimé dans les macrophages inflammatoires mais ne variait pas dans les macrophages résidents [531]. Ainsi, il est possible qu’au sein de notre modèle inflammatoire de poche d’air, le gène Arf6 soit également supprimé ou diminué dans les monocytes inflammatoires des souris cKO Arf6.

En conclusion, l’étude de notre modèle cKO Arf6 montre que la délétion du locus du gène Arf6 est incomplète dans nos souris cKO-Arf6 hétérozygotes et homozygotes pour le gène de recombinase Cre. Les résultats obtenus suggèrent que la délétion du gène d’intérêt (Arf6) est plus importante dans un modèle inflammatoire que chez les PMNs issu de la MO, mais aussi au sein des souris homozygotes pour la recombinase Cre comparativement aux hétérozygotes.