Est-il vrai qu’il existe une constante c telle que, pour tout graphe planaire 2 connexe G,

5.2.1 Purificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+

Os linfócitos que foram delicadamente lavados para que as células não aderentes fossem removidas e transferidas para placas de 48 poços (NUNC), conforme descrito no item 5.1.4 Estabelecimento das condições de cultivo de monócitos circulantes diferenciados em macrófago com melhor habilidade microbicida, foram cultivados separadamente em um total de cinco dias. Deste modo, foram purificados utilizando MACS Beads e colunas magnéticas LS (Miltenyi Biotec Inc. – Auburn, CA, EUA) com protocolo modificado, para obtenção das subpopulações T CD4+ _{e T}

CD8+. Entretanto, visando melhorar o processo de purificação, as células foram retiradas dos poços e centrifugadas a 400 x g em temperatura de 22°C por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 6mL de RPMI 1640 / 20% SFB. Estas células foram novamente processadas em um novo gradiente de Ficoll-Hipaque, nas proporções 3:3:1 em tubos Falcon de 15 mL; centrifugadas a 700g / 22°C / 30 min. Após este procedimento, as células foram lavadas três vezes em solução tampão (PBS 1X, pH 7,2, 0,5%BSA, 2mM EDTA) a 400 x g em temperatura de 4°C por 10 minutos. Posteriormente, as células foram ressuspendidas em 1mL de solução tampão, da qual foi retirada uma alíquota para contagem em câmara de Neubauer e outra para análise em citômetro de fluxo para análise do grau de pureza da separação.

A partir da suspensão celular contendo 107 _{células/mL, as células foram novamente lavadas}

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adicionado 2µL dos anticorpos anti-CD4-FITC e incubados a 22°C por 20 minutos. Em seguida, foi realizada a lavagem da suspensão celular com 5mL da solução tampão (PBS 1X, pH 7,2, 0,5%BSA, 2mM EDTA) e centrifugação a 400 x g em 22ºC por 10 minutos. Em seguida, a suspensão celular foi ressuspendida em 400µL da solução tampão e 10µL das micro-beads anti-FITC (para separação de linfócitos T CD4-FITC+) e submetida a uma segunda incubação a 22°C por 20 minutos. Após este período, a suspensão celular foi lavada pela adição de 15mL da solução tampão (PBS 1X, pH 7,2, 0,5%BSA, 2mM EDTA) e centrifugada a 400 x g por 10 minutos a 22°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 500µL da solução tampão. Assim, a suspensão celular foi transferida para a coluna magnética LS MACS® previamente lavada com 3mL da solução tampão (PBS 1X, pH 7,2, 0,5%BSA, 2mM EDTA). As retidas na coluna constituíram a populações de linfócitos TCD4+_{. Após isto, a coluna foi lavada com 3mL da solução tampão. A}

pureza da separação foi determinada por citometria de fluxo (FACS Calibur – BD Bioscience), obtendo-se um grau de pureza mínimo de 90% (Figura 1) para os diferentes ensaios in vitro.

Para obtenção da subpopulação de linfócitos T CD8+_{, as células que foram depletadas no}

processo de purificação de linfócitos T CD4+ _{passaram pelos mesmos procedimentos descritos}

acima. A partir da suspensão celular contendo 107 células/mL foi retirada uma alíquota de 1mL e transferida para tubos de poliestireno (Falcon 2054, Becton Dickinson, San Diego, EUA) sendo adicionado 5µL dos anticorpos anti-CD8-FITC e incubados a 22°C por 20 minutos. Em seguida, foi realizada a lavagem da suspensão celular com 5mL da solução tampão (PBS 1X, pH 7,2, 0,5%BSA, 2mM EDTA) e centrifugação a 400 x g em 22ºC por 10 minutos. Em seguida, a suspensão celular foi ressuspendida em 400µL da solução tampão e 10µL das micro-beads anti-FITC (para separação de linfócitos T CD8-FITC+) e submetida a uma segunda incubação a 22°C por 20 minutos. Após este período, a suspensão celular foi lavada pela adição de 3mL da solução tampão e centrifugada a 400 x g por 10 minutos a 22°C. Em seguida o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 500µL da solução tampão. Assim, a suspensão celular foi transferida para a coluna magnética LS MACS® previamente lavada com 3mL da solução tampão. As células que ficaram retidas na coluna constituíram a população de linfócitos T CD8+. A coluna foi lavada para retirar os linfócitos, sendo a pureza da separação determinada por citometria de fluxo (FACS Calibur – BD Bioscience), obtendo-se um grau de pureza mínimo de 90% (Figura 1) para realização dos diferentes experimentos in vitro.

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Figura 1: Sequência de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de pureza de linfócitos T CD4+ e T

CD8+ _{a partir de leucócitos circulantes de cães Gráficos do painel superior (representativos dos experimentos de}

purificação de linfócitos T - LT - CD4+_{) e inferior (representativos dos experimentos de purificação de linfócitos T - LT}

- CD8+_{) esquerdos representa a densidade de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC), indicando aspectos}

morfométricos das populações de linfócitos, monócitos e neutrófilos. Gráficos do painel direito superior e inferior ilustram a frequência de LT CD4+ _{e LT CD8}+ _{(FITC/FL1 versus FL2), respectivamente, empregados para quantificar o}

percentual de linfócitos purificados, indicado pelo quadrante Q3 (91,7% de pureza para LT CD4+ _{e 93% de pureza para}

LT CD8+_). L T C D 4 + L T C D 8 + FL1-H:: FL1-Height FL1-H:: FL1-Height F L 2- H :: F L 2- H ei ght F L 2- H :: F L 2- H ei ght FSC-H:: FSC-Height FSC-H:: FSC-Height SSC -H :: SSC -H ei gh t SSC -H :: SSC -H ei ght

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5.2.2 Co-cultivo celular

No quinto dia de cultivo, após prévia análise do melhor estado de maturação, capacidade fagocítica e microbicida, os macrófagos foram infectados com promastigotas de L. chagasi (cepa C- 46) em uma proporção de 10 parasitos para cada macrófago (10:1) por um período de 3 horas. Após o tempo decorrido, os poços foram delicadamente lavados com RPMI para retirar os parasitos que não foram internalizados pelos macrófagos, para posterior co-cultivo com os linfócitos T CD4 e/ou T CD8 purificados. Neste momento, algumas lamínulas foram removidas dos poços para serem coradas por hematoxilina e eosina e contado o número de macrófagos infectados, bem como o número de amastigotas/macrófago em câmara hemocitométrica de Neubauer. Nesta etapa foi obtida a taxa de infecção da L. chagasi em um total de 200 macrófagos.

O restante das placas de cultivo celular foram mantidas por mais 24 horas em estufa a 37°C com 5% de CO2. Após este período, os linfócitos T CD4+ e T CD8+ previamente purificados, foram

incubados com os macrófagos (Mϕ) infectados com o parasito nas seguintes proporções:

Linfócito T CD4+ + Mϕ - 1 linfócito para cada 5 macrófagos (1:5), e nas condições 1:2, 1:1 e 2:1;

Linfócito T CD8+ + Mϕ - 1 linfócito para cada 5 macrófagos (1:5), e nas condições 1:2, 1:1 e 2:1;

Linfócito T CD4+ + T CD8+ + Mϕ - 1:1:1 e na condição 2:2:1; Linfócitos totais nas proporções 2:1 e na condição 4:1.

Neste sistema de co-cultivo, as células foram mantidas por mais 72 horas. Após este período, os sobrenadantes dos poços foram coletados e armazenados em tubos tipo eppendorf e acondicionados a -80°C para posterior dosagem de citocinas e óxido nítrico. Em seguida, as lamínulas foram removidas dos poços e coradas com hematoxilina e eosina para que fosse realizada a contagem do número de macrófagos infectados, bem como o número de amastigotas/macrófago. Neste processo, foi obtida a taxa de atividade microbicida dos macrófagos previamente infectados com L. chagasi e mantidos em co-cultivo com os linfócitos purificados (CD4 e/ou CD8) ou não (linfócitos totais). Estes resultados foram úteis não somente para avaliar a capacidade dos macrófagos em eliminar o parasito internalizado com 3 horas de infecção, mas também a atividade que os linfócitos estabeleceram neste processo.

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5. 3- Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) anti-citocinas

A determinação dos níveis de TNF-α, IL-4, e IL-10 foi realizada através de ensaios imunoenzimáticos (ELISA), utilizando-se o sobrenadante de co-cultivo celular. Foram utilizados anticorpos e proteínas recombinantes adquiridos da empresa R&D Systems (Minneapolis, USA). A cada poço de uma placa da placa de 96 orifícios (COSTAR®, USA) foram adicionados 25µL de anticorpo monoclonal anti-citocina a ser dosada, diluído em PBS estéril. As placas foram cobertas e incubadas durante o período noturno à temperatura ambiente. Os anticorpos não adsorvidos pelas placas foram descartados, por inversão e 4 sucessivas lavagens com 100μL da solução de PBS- Tween 20. A seguir, as placas foram bloqueadas com 75µL/poço de uma solução contendo PBS- BSA 1% e 0,05% de azida sódica (NaN3), durante uma hora, em temperatura ambiente, e lavadas

conforme descrito anteriormente. As amostras do sobrenadante de culturas foram aplicadas em um volume de 25µL em cada poço da placa. Paralelamente, o anticorpo recombinante de cada citocina avaliada foi diluído em diferentes concentrações para estabelecimento de uma curva padrão, sendo a diluição realizada em solução PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). As placas foram vagarosamente homogeneizadas por um minuto e, em seguida, foram cobertas e incubadas por uma hora e meia, em temperatura ambiente. Após o período de incubação, as placas foram novamente lavadas com 100μL de PBS-Tween 20. Em seguida, foi adicionado 25µL do anticorpo biotinilado diluído apropriadamente em PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,05% de azida (NaN3), em cada poço da placa. As placas foram mais uma vez mantidas ao abrigo

da luz e incubadas, a temperatura ambiente, por uma hora e meia, e, em seguida foram lavadas em PBS-Tween 20. Então, após remoção do sobrenadante, foi adicionado em cada poço 25µL de estreptoavidina (R&D Systms, Inc., Minneapolis, USA., DY998) diluída em PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,05% de azida (NaN3). As placas foram mantidas ao abrigo da

luz e incubadas, a temperatura ambiente, por vinte minutos. Após a incubação, foram novamente lavadas e, em cada poço, foi adicionado 25µL da solução de substrato (mistura 1:1 de H2O2 e

tetrametilbenzidina). Mais uma vez as placas foram incubadas, ao abrigo da luz e em temperatura ambiente, por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 25µL por poço da solução de parada (H2SO4

1M). A densidade óptica foi determinada usando leitor automático de microplacas (Biotek, EL800) no comprimento de onda de 450 nm.

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5.3.2 Quantificação de IL-12 e IFN-

Para determinar os níveis de IL-12 e IFN-, foram utilizados os kits DuoSets (R&D Systms, Inc., Minneapolis, USA., DY1969, DY781) para realização do ensaio ELISA de captura em amostras de sobrenadante de culturas de macrófagos co-cultivados com linfócitos. O ensaio foi desenvolvido de acordo com instruções do fabricante dos kits Duosets. Foram utilizadas placas de 96 poços (COSTAR, USA), onde foi feita a sensibilização, por toda a noite, com 25μL do anticorpo de captura diluído em PBS estéril, na concentração de 0,8μg/mL. As placas foram lavadas 4 vezes com 100μL solução de lavagem PBS-Tween 20 e incubadas, em temperatura ambiente, com solução de bloqueio (1% de BSA em PBS) por 1 hora. Foi realizada uma nova etapa de lavagem com 100μL de PBS-Tween 20 e, em seguida foi adicionado 25μL da amostra, sem diluição, em cada poço. Paralelamente, para estabelecimento da curva padrão, foi adicionado 25μL da proteína recombinante de cada citocina, diluída em PBS com 1% de BSA, em diluição seriada, começando com a concentração inicial de 4000 pg/mL. Após 2 horas de incubação, em TA, foi repetido o processo de lavagem com 100μL de solução PBS-Tween 20 e aplicado 25μL de Streptoavidina- HRP. Após 20 minutos de incubação ao abrigo da luz, em temperatura ambiente, foi repetido o processo de lavagem com 100μL da solução PBS-Tween 20. Então foi adicionado 25μL da solução substrato, que corresponde a uma mistura 1:1 do reagente de cor A, H2O2, e reagente de cor B,

tetrametilbenzidina, (R&D Systems, DY999). Após 20 minutos de incubação, em temperatura ambiente, foi adicionado 13μL da solução de parada (R&D Systems, DY994). A determinação da densidade óptica foi feita imediatamente, usando leitor automático de microplacas (Biotek, EL800) no comprimento de onda de 450 nm.