Visualisation de l’internalisation par microscopie de fluorescence

eucaryotes CHO-K1 est alors évaluée grâce à un test utilisant la streptavidine fluorescente. Tous les tests sont réalisés entre deux et trois fois, dont au moins deux résultats concordants.

Dans le cas du témoin négatif, correspondant à une incubation sans peptide, on n’observe pas de fluorescence dans le cytoplasme.

Les premiers résultats obtenus n’ont pas permis de mettre en évidence une fluorescence dans les cellules pour les peptides DA5m-S1-01B et DA5m-S1-02B, donnant la même image que le témoin négatif. Ces peptides n’ont donc pas pu pénétrer dans les cellules.

Cependant, les cellules incubées avec les peptides DA5m-S1-03B et DA5m-S1-04B ont montré une faible fluorescence dans les mêmes conditions en microscopie suggérant que ces peptides présentent une légère capacité à pénétrer dans les cellules eucaryotes. La principale différence entre les séquences des peptides qui ne pénètrent pas avec celles des peptides pénétrants est la charge globale qui est supérieure d’une charge positive dans le cas de ces derniers (respectivement une charge globale de +3 pour les peptides S1-01B et DA5m-S1-02B contre une charge globale de +4 pour DA5m-S1-03B et DA5m-S1-04B). Ces résultats confirment les scores des prédictions et permettent de relier l’augmentation de la charge globale d’un peptide à sa capacité à pénétrer dans les cellules.

Les peptides DA5m-S2-01B et DA5m-S2-02B issus de l’élongation respective des peptides DA5m-S1-03B et DA5m-S1-04B montrent les mêmes résultats que ces derniers. Contrairement au contrôle négatif (sans peptide) où aucune fluorescence n’est observée, la coloration concomitante des noyaux cellulaires colorés en bleu par le DAPI et des peptides en vert dans le cytoplasme indique que les peptides peuvent pénétrer dans les cellules CHO-K1 (Figure 70 et Annexe 123).

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Figure 70. Résultats des tests de pénétration dans les cellules CHO-K1 utilisant la streptavidine fluorescente des peptides DA5m-S2-01B et DA5m-S2-02B. Le contrôle est réalisé sans peptide. La couleur du DAPI et le contraste sont respectivement modifiés avec GIMP et ImageJ pour mieux correspondre avec ce qui a été observé en microscopie. Réalisés deux fois. (Les clichés d’origine peuvent être trouvés en annexe).

Les peptides de la série DA5m-S3 ont été testés dans les mêmes conditions. On observe que seul DA5m-S3-01B, qui est le moins chargé des trois peptides, ne pénètre pas dans les cellules étant donné qu’aucune fluorescence n’est observée lors des tests avec ce peptide, comme dans le cas du témoin négatif. Ces résultats soulignent à nouveau le lien que nous avons déjà évoqué entre la charge globale et la capacité à pénétrer dans les cellules, puisque les peptides les plus chargés positivement, DA5m-S3-02B et DA5m-S3-03B, sont visibles dans le cytoplasme des cellules CHO-K1 sous lumière fluorescente (Figure 71 et Annexe 124).

Les résultats en utilisant la streptavidine fluorescente obtenus avec ces trois peptides confirment les prédictions de CPPpred et CellPPD : la capacité à pénétrer les cellules peut être induite par augmentation de la charge globale positive du peptide.

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Figure 71. Résultats des tests de pénétration dans les cellules CHO-K1 utilisant la streptavidine fluorescente des peptides DA5m-S3-01B, DA5m-S3-02B et DA5m-S3-03B. Le contrôle est réalisé sans peptide. La couleur du DAPI et le contraste ont été respectivement modifiés avec GIMP et ImageJ pour mieux correspondre avec ce qui a été observé en microscopie. Réalisé deux fois (les clichés d’origine peuvent être trouvés en annexe).

Malgré les différences de charges entre les peptides de la série DA5m-S5 de séquence « KSWAKXAAKAAGKAA » (avec X, l’acide aminé variant selon le peptide), aucun de ces peptides n’a montré de fluorescence lors de cette expérience.

L’augmentation de l’hydrophobie des peptides DA5m-S5 en DA5m-S6-01B et DA5m-S6-02 par ajout de tryptophanes dans la séquence, a permis d’induire la capacité à pénétrer les cellules pour ces deux nouveaux peptides. En effet, l’expérience en utilisant ces deux peptides et les peptides pénétrants RW1-1B et RW4-1B (dérivés du peptide pénétrant RW9 en tant que témoins positifs) montre que DA5m-S6-01B et DA5m-S6-02 peuvent pénétrer les cellules CHO-K1 aussi bien que les témoins positifs déjà testés au laboratoire. Dans le cas de ces quatre peptides, une fluorescence verte intense indique la présence des peptides dans les cellules (Figure 72 et Annexe 125).La correspondance de la localisation des fluorescences du DAPI et de la streptavidine laisse envisager que ces nouveaux peptides riches en tryptophanes pourraient aller jusque dans les noyaux cellulaires.

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Figure 72. Résultats des tests de pénétration dans les cellules CHO-K1 utilisant la streptavidine fluorescente des peptides R8W1-1B, R5W4-1B, DA5m-S6-01B et DA5m-S6-02B. Le contrôle négatif est réalisé sans peptide. R8W1-1B et R5W4-1B sont utilisés en tant que témoin positif. La couleur du DAPI et le contraste ont été respectivement modifiés avec GIMP et ImageJ pour mieux correspondre avec ce qui a été observé en microscopie. Réalisé trois fois (les clichés d’origine peuvent être trouvés en annexe).

Le peptide DA5m-S6-02B (charge : +4) moins chargé positivement montre une fluorescence plus intense et plus proche de celle de R8W1-1B que le peptide DA5m-S6-01B (charge : +5). Les interactions hydrophobes dues à la présence de trois tryptophanes supplémentaires pourraient donc induire l’activité pénétrante davantage que la charge. Cette hypothèse est cohérente avec le fait que les membranes eucaryotes présentent une majorité de lipides zwiterrioniques globalement neutres sur la monocouche externe avec lesquels les interactions hydrophobes devraient être plus favorables que les interactions électrostatiques.

R8W1-1 (x60) RRRRWRRRR

R5W4-1 (x40) RRWWRRWWR

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Bien que l’expérience utilisant la streptavidine fluorescente soit purement qualitative, la fluorescence observée lors des expériences avec ces peptides riches en tryptophanes est plus intense que celle observée lors des expériences avec les premiers peptides.

Pour vérifier l’efficacité de ces internalisations, celles-ci sont alors quantifiées par spectrométrie de masse.