Chapitre I – Les peptides membranotropes
3. Importance de l’hydrophobie dans l’activité antibactérienne
3.1. Premières observations sur l’effet de l’hydrophobie
De la même manière que pour le peptide DA5m-S3-01, les séquences suivantes ont été établies en conservant un tryptophane en 3ème position et en incorporant d’autres motifs conservés chez les dermaseptines comme « AAKAAGKAA(L) » (Tableau 17).
0% 20% 40% 60% 80% 100% 0,2 0,4 0,8 1,5 3,125 6,25 12,5 25 50 100 Su rvie b act ér ien n e
Concentration en peptides (en µM)
DA5m-S3-01N / E.coli DA5m-S3-01B / E.coli DA5m-S3-02N / E.coli DA5m-S3-02B / E.coli DA5m-S3-03N / E.coli DA5m-S3-03B / E.coli
103
Peptide Animal Séquence Référence
DMS-DA5 Pachymedusa dacnicolor GMWGKIKSTAKE----AAKAAGKAALNAVSEAL-NH2 [57] Dermaseptin B2 Phyllomedusa bicolor GLWSKIKEVGKE----AAKAAGKAALGAVSEAV-NH2 [234] ARP-AC1 Agalychnis callidryas GMWSKIKEAGKAAAKAAAKAAGKAALDVVSGAIG-NH2 [226] Dermaseptin-J7 Phasmahyla jandaia GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAV-NH2 [228] Dermadistinctin-K Phyllomedusa distincta GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAV-NH2 [231]
Dermaseptin sVI Phyllomedusa
sauvagei GLWSKIKTAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAI-NH2 [233]
Dermaseptin-1 Phyllomedusa
tarsius GLWSKIKETGKE----AAKAAGKAALNKIAEAV-NH2 [235]
Tableau 17. Séquence de quelques dermaseptines possédant des motifs conservés en commun avec DMS-DA5. Les motifs conservés sont indiqués en rouge (tryptophane en 3ème
position dans la séquence) et en gras (motif « AAKAAGKAA(L) »). Le « -NH2 » signifie une amidation du peptide à l’extrémité C-terminale.
La conservation du motif « AAKAAGKAA » chez les dermaseptines présentées dans le tableau 16 nous a amené à nous intéresser à la partie centrale de la séquence de DMS-DA5 qui possède également ce motif. De plus, les prédictions de structure ont montré que le milieu de la séquence de DMS-DA5 était plus disposé à être structuré en hélice α et le programme AMPA a prédit une meilleure activité antibactérienne pour cette région de la séquence. En effet, AMPA calcule un indice d’activité antibactérienne (ou « average antimicrobial index »), pour chaque acide aminé de la séquence, qui est représentatif de la contribution de cet acide aminé dans l’activité antibactérienne du peptide. Plus cet indice est élevé, plus l’acide aminé est essentiel pour l’activité du peptide et, selon ce programme, les indices des lysines du motif « AAKAAGKAA » sont particulièrement élevés (Figure 56) [239]. Bien que AMPA prédise que l’extrémité C-terminale de la séquence de DMS-DA5 (« NAVSEAL ») ait également une probabilité très élevée de promouvoir une activité antimicrobienne, le milieu de la séquence a été finalement choisi car il se rapproche davantage des séquences étudiées précédemment.
104
Figure 56. Prédiction par l’algorithme AMPA des régions de la séquence de DMS-DA5 les plus probables de posséder une activité antimicrobienne. Plus l’indice d’activité antimicrobienne est élevé (axe des ordonnées), plus il est probable que l’acide aminé contribue au pouvoir antimicrobien du peptide [239].
Ces paramètres de sélection ont inspiré les séquences des peptides DA5m-S4-01 et DA5m-S5-01 respectivement à partir des positions 9 à 23 (« TAKEAAKAAGKAAL ») et des positions 7 à 22 (« KSTAKEAAKAAGKAA ») du milieu de la séquence de DMS-DA5. Un tryptophane est introduit en 3ème position dans chacune de ces deux séquences par insertion (cas de DA5m-S4-01: TAWKWAAKAAGKAAL) ou par substitution d’un acide aminé (thréonine par tryptophane dans le cas de DA5m-S5-01 : KSWAKEAAKAAGKAA). Ces séquences sont, à leur tour, modifiées par substitution d’un seul acide aminé afin de tenter de moduler l’activité du peptide vers une action pénétrante ou antibactérienne. Selon les machines de prédiction, l’insertion d’acides aminés hydrophobes doit améliorer l’activité antibactérienne du peptide tandis que l’insertion d’acides aminés basiques doit promouvoir l’activité pénétrante. Les séries de peptides DA5m-S4-01 à DA5m-S4-03 et DA5m-S5-01 à DA5m-S5-05 vont permettre de vérifier ces prédictions d’activité (Tableau 18).
105
Nom Séquence Score
CAMPR3
Score
CPPpred Charge
DMS-DA5 GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL 0,873 0,558 + 3
DA5m-S4-01 TAWKWAAKAAGKAAL 0,940 0,737 + 3
DA5m-S4-02 TAWKLAAKAAGKAAL 0,904 0,736 + 3
DA5m-S4-03 TAWKRAAKAAGKAAL 0,840 0,786 + 4
DA5m-S5-01 KSWAKEAAKAAGKAA 0,366 0,575 + 3
DA5m-S5-02 KSWAKIAAKAAGKAA 0,343 0,543 + 4
DA5m-S5-03 KSWAKFAAKAAGKAA 0,595 0,583 + 4
DA5m-S5-04 KSWAKWAAKAAGKAA 0,620 0,690 + 4
DA5m-S5-05 KSWAKRAAKAAGKAA 0,325 0,752 + 5
Tableau 18. Séquence des nouveaux peptides DA5m-S4 et DA5m-S5 inspirés de DMS-DA5. La substitution dans les séquences de DA5m-S4-01 et DA5m-S5-01 pour induire le caractère pénétrant est indiquée en rouge. Les Scores sont compris entre 0 et 1 (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide aie l’activité correspondant) [208, 212].
Comme pour les peptides de la série DA5m-S2, les peptides des séries DA5m-S4 et DA5m-S5 ont été synthétisés avec et sans biotinylation de l’extrémité N-terminale. Malheureusement, tous ces peptides n’ont pas montré une réelle activité antibactérienne contre les quatre souches bactériennes étudiées puisqu’aucune CMI n’est observée à des concentrations inférieures ou égales à 100 µM (Tableau 19 et Annexes 96 à 98).
Peptide Séquence
Test AMP (CMI)
E. coli P. aeruginosa
K.
rhizophila S. aureus
Incorporation du motif dermaseptine "AAKAAGKAAL" dans séquence de 15aa
DA5m-S4-01N TAWKWAAKAAGKAAL Non ~60% à 100 µM
~50% à
100 µM Non
DA5m-S4-02N TAWKLAAKAAGKAAL Non ~40% à 100 µM
~40% à
100 µM Non
DA5m-S4-03N TAWKRAAKAAGKAAL Non Non Non Non
Tableau 19. Résultats des tests antibactériens avec les peptides DA5m-S4 sur les quatre souches testées. Le « % » représente le pourcentage d’inhibition de croissance lorsque celle-ci n’est pas totale. Tests réalisés trois fois en triplicata.
Cependant, les peptides DA5m-S4-01N et DA5m-S4-02N dont les séquences comprennent l’introduction d’un acide aminé hydrophobe, respectivement tryptophane et leucine, ont causé une inhibition de croissance bactérienne de la croissance à haute
106
concentration (100 µM), où la croissance bactérienne a diminué de 60 % sur P. aeruginosa en présence de DA5m-S4-01N (Figure 57).
Figure 57. Tests antibactériens des peptides DA5m-S4 sur P. aeruginosa. Tests réalisés trois fois en triplicata.
De même, les peptides DA5m-S5-02, DA5m-S5-03 et DA5m-S5-04, dont les séquences comprennent l’introduction d’un acide aminé hydrophobe supplémentaire, tyrosine ou tryptophane, ont causé une inhibition de croissance bactérienne de la croissance à haute concentration (100 µM), sur Escherichia coli et Kocuria rhizophila (Tableau 20). Ces inhibitions de croissance sont particulièrement importantes dans le cas du peptide le plus hydrophobe de la série DA5m-S5-04, qui possède un second tryptophane dans la séquence, et pour lequel la croissance bactérienne a diminué de 70 % sur E. coli (DA5m-S5-04N) (Figure 58 et Annexes 99 à 102). Cette inhibition incomplète de la croissance n’est cependant observée qu’avec les peptides sans modification de l’extrémité N-terminale. En effet, les peptides biotinylés ne montrent aucune inhibition de croissance aux mêmes concentrations.
0% 20% 40% 60% 80% 100% 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,3 12,5 25 50 100 Tau x d e cro is san ce d es b act érie s
Concentration en peptides (en µM)
DA5m-S4-01N / P. aeruginosa DA5m-S4-02N / P. aeruginosa DA5m-S4-03N / P. aeruginosa
107
Peptide Séquence
Test AMP (CMI)
E. coli P. aeruginosa K. rhizophila S. aureus
Sélection d'une nouvelle région de la séquence qui présente de meilleures prédictions structurales
DA5m-S5-01N KSWAKEAAKAAGKAA Non Non Non Non
DA5m-S5-01B BGGGGKSWAKEAAKAAGKAA Non Non Non Non
DA5m-S5-02N KSWAKIAAKAAGKAA 50% à
100 µM Non
50% à 100
µM Non
DA5m-S5-02B BGGGGKSWAKIAAKAAGKAA Non Non Non Non
DA5m-S5-03N KSWAKFAAKAAGKAA 50% à
100 µM Non
50% à 100
µM Non
DA5m-S5-03B BGGGGKSWAKFAAKAAGKAA Non Non Non Non
DA5m-S5-04N KSWAKWAAKAAGKAA 70% à
100 µM Non
60% à 100
µM Non
DA5m-S5-04B BGGGGKSWAKWAAKAAGKAA Non Non Non Non
DA5m-S5-05N KSWAKRAAKAAGKAA 50% à
100 µM Non
50% à 100
µM Non
DA5m-S5-05B BGGGGKSWAKRAAKAAGKAA Non Non Non Non
Tableau 20. Résultats des tests antibactériens avec les peptides DA5m-S5 sur les quatre souches testées. Les « B » dans les séquences correspondent à la biotine. Le « % » représente le pourcentage d’inhibition de croissance lorsque celle-ci n’est pas totale. Tests réalisés trois fois en triplicata.
Il peut être noté que le seul peptide de cette série DA5m-S5 qui n’ait montré aucune activité sur les quatre souches bactériennes est le peptide DA5m-S5-01 qui présente une charge positive en moins par la présence de l’acide glutamique. Ce résultat appuie que la charge positive des peptides contribue à l’activité antibactérienne, facteur qui n’a pas encore été étudié au cours de ces travaux.
108
Figure 58. Tests antibactériens des peptides DA5m-S5-02, DA5m-S5-03 et DA5m-S5-04 sur
E. coli. Les courbes correspondant au peptide sans modification de l’extrémité N-terminale
sont en trait plein (______) et celles correspondant au peptide biotinylé en traits discontinus (- - -). Tests réalisés en triplicata trois fois.
Les peptides ayant présenté une faible activité antibactérienne sont également ceux qui possèdent une modification introduisant un acide aminé hydrophobe dans la séquence tel qu’une isoleucine (DA5m-S5-02), une phénylalanine (DA5m-S5-03) ou un tryptophane (DA5m-S5-04 et DA5m-S4-01). Ce résultat appuie le lien positif entre le nombre d’acides aminés hydrophobes dans la séquence du peptide et son activité tel qu’il a été déjà décrit [240, 241].